Nanogels déclenchés par deux stimuli en réponse aux changements de température et de pH pour une libération contrôlée de médicaments

Introduction

Les nanoporteurs sensibles aux stimuli ont généralement été développés en tant que systèmes d'administration de médicaments pour la thérapie, l'imagerie et le diagnostic [1, 2]. Récemment, divers stimuli, notamment le pH, la température, les biomolécules, l'oxydoréduction, le champ magnétique et la lumière ultraviolette, ont été utilisés pour induire une libération prolongée ou contrôlée de médicament via une activation interne ou externe [3,4,5,6]. Parmi ces stimuli, le pH et la température sont les modalités les plus connues des systèmes d'administration et de libération de médicaments. Poly-N -l'isopropylacrylamide (PNIPAM) est un polymère représentatif sensible à la température qui a été utilisé dans les réservoirs de médicaments et les systèmes de libération. Ce polymère thermosensible a la capacité de modifier son comportement de phase, présentant un état gonflé en raison de la liaison hydrogène entre l'eau et les groupes fonctionnels amide à la température de solution critique inférieure (LCST) et à l'inverse présentant un rétrécissement du réseau polymère via des interactions hydrophobes au-dessus de la LCST [7,8,9]. De plus, la LCST peut être couramment contrôlée par le rapport de complexation de l'acide acrylique (AAc) ou de l'amide acrylique couplé au PNIPAM [10, 11]. Plus précisément, AAc peut effectuer deux transitions de phase lorsque la LCST est déplacée vers des températures plus élevées [12, 13]. Les nanogels PNIPAM-co-AAc commencent à rétrécir au-dessus de la LCST en raison d'interactions hydrophobes [14, 15]. Cependant, la déprotonation des groupes carboxyliques dans l'AAc provoque une augmentation du diamètre du nanogel en raison de la répulsion interélectronique et de l'augmentation de la pression osmotique [16,17,18].

Les systèmes d'administration de médicaments médiés par le PNIPAM ont été développés pour diverses applications dans les domaines biomédicaux. Des nanogels PNIPAM sensibles à la température ou au pH ont été utilisés pour optimiser le processus d'adsorption et de délivrance de médicaments en raison de la propriété de transition de phase réversible [19,20,21,22]. En particulier, il a été rapporté que les valeurs de pH dans différents tissus sont prises en compte pour l'administration orale, bien qu'il y ait des changements plus subtils dans différents tissus [23,24,25,26]. À ce jour, les biomatériaux intelligents qui peuvent générer une réponse coopérative sous plusieurs stimuli, tels que le pH et la température, ont montré des avantages par rapport aux systèmes sensibles à un seul stimulus [27,28,29]. Le changement d'hydrophilie induit par la sensibilité à la température, qui peut être adapté pour se produire spontanément au pH environnemental, peut également jouer un rôle important dans la sensibilité au pH ainsi que le comportement LCST des copolymères et des gels.

La β-lapachone (β-LP), un composé naturel, a montré une activité thérapeutique dans le traitement du cancer [30]. En biomédecine, les supports fonctionnalisés de la -LP ont été conçus dans le but de minimiser ses effets toxiques. Divers supports pour l'administration de -LP ont été développés à l'aide d'or, d'oxyde de graphène et de PNIPAM [31, 32]. À ce jour, le PNIPAM chargé de β-LP a été appliqué à des schémas chimiothérapeutiques dans les cancers du foie, du sein, de la prostate et du côlon [33,34,35,36]. Bien que plusieurs supports -LP aient été étudiés, les procédures de préparation relativement complexes étaient incontrôlées ou la libération spontanée de β-LP limitait en partie leur efficacité. Ainsi, le développement de transporteurs efficaces de -LP pour des applications biomédicales reste une tâche importante.

Ici, nous avons développé un système de libération contrôlée bidirectionnelle utilisant les propriétés thermo-sensibles et pH du PNIPAM. Ce système d'administration de médicament se compose de nanogel PNIPAM copolymérisé avec le contenu AAc formant un nanogel PNIPAM-co-AAc. Nous avons décrit une représentation schématique de la stratégie d'auto-assemblage, du chargement du médicament et de la libération du nanogel PNIPAM-co-Aac (Schéma 1). β-LP, un médicament modèle, a été chargé dans des nanogels PNIPAM-co-Aac via des interactions hydrophobes. La libération de -LP par les nanogels PNIPAM-co-Aac chargés pourrait être efficacement contrôlée par la température et le pH. Les nanogels PNIPAM-co-Aac ont montré une propriété anti-proliférative efficace dans les fibroblastes avec un pH basique à température corporelle. La β-LP chargée dans des nanogels a atteint une efficacité thérapeutique significative avec une structure sensible à la température et au pH. Par conséquent, le nanogel modifié par PNIPAM pourrait être un bon candidat pour l'administration de médicaments sensibles aux stimuli et le traitement des tumeurs.

Illustration schématique de la double libération contrôlée de médicament d'hydrogels PNIPAM-co-AAc via la température et le pH

Méthodes

Matériaux

Le NIPAM (97 %, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a été séché sous vide à température ambiante. N ,N ′-méthylènebisacrylamide (MBA), AAc, eau distillée, alcool éthylique (EtOH), persulfate de potassium (KPS) (98 %, Dae Jung, CORÉE), β-LP (Natural Products, Corée) et solution saline tamponnée au phosphate (PBS ) étaient tous de qualité analytique et utilisés sans autre purification.

Synthèse du PNIPAM-co-AAc Nanogel

Le nanogel PNIPAM-co-AAc a été synthétisé selon des rapports antérieurs [37]. Dans un ballon à fond rond à trois cols de 500 mL, 2,26 g de monomère NIPAM, 0,154 g de MBA en tant qu'agent de réticulation et 0 g, 0,036 g, 0,077 g, 0,145 g d'AAc ont été ajoutés dans 200 mL d'eau distillée, puis dissous par agitation avec un barreau magnétique pendant 30 min à 75 °C, suivi de la synthèse de PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10 et PNIPAM-co-AAc20, respectivement. L'oxygène a été éliminé du mélange par purge à l'azote. Pour initier la réaction, 37,5 mg de KPS en tant qu'initiateur ont été ajoutés à la solution puis agités. Un condenseur à reflux a été utilisé pour empêcher l'évaporation de la solution en raison de la température élevée. La solution est devenue trouble dans les 10 minutes après l'ajout de KPS. Pour éliminer les monomères n'ayant pas réagi, il a été dialysé avec un tube de dialyse (12-14 kDa) pendant 7 jours. L'eau distillée utilisée pour la dialyse a été changée quotidiennement. Les matériaux obtenus ont été congelés dans de l'azote liquide et lyophilisés pendant 3 jours pour obtenir le nanogel PNIPAM-co-AAc séché.

β-LP Chargement dans PNIPAM-co-AAc

Un milligramme du nanogel PNIPAM-co-AAc synthétisé a été dissous dans 1 mL d'éthanol, et 0,1 mg de β-LP a été ajouté au PNIPAM-co-AAc dissous. Le mélange a été vigoureusement agité à température ambiante dans l'obscurité pendant une nuit. Après agitation, la -LP non encapsulée a été dialysée avec un tube de dialyse (6-8 kDa). Le nanogel dialysé a été congelé dans de l'azote liquide et lyophilisé pendant 3 jours. Ensuite, 1 mL de -LP encapsulé dans du PNIPAM-co-AAc a été injecté dans le tube de dialyse (6-8 kDa). Pour éviter la perte de solution, l'extrémité du tube a été scellée. Après avoir ajouté 10 mL d'éthanol, les tubes de dialyse préparés ont été immergés dans une solution de PBS.

Caractérisation du PNIPAM-co-AAc

La morphologie a été déterminée par microscopie électronique à transmission (MET) et microscopie électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM). En bref, après que les nanogels de PNIPAM-co-AAc aient été suffisamment dispersés par sonication, les dispersions sont déposées sur des grilles de cuivre de 300 mesh (Electron Microscopy Science, PA, USA) et évaporées pendant la nuit. Ensuite, des images MET ont été obtenues à une tension d'accélération de 200 kV (JEM2100F, JEOL Ltd., Japon). Les micrographies SEM ont été scannées à une tension d'accélération des électrons de 15 kV (JSM-7100F, JEOL USA). Les spectres ont été collectés à partir d'un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR, Nicolet 6700, Japon). La charge de β-LP et la quantité libérée par les nanogels ont été calculées par un spectromètre UV-Vis (UV-1800, Shimadzu, Japon). Pour confirmer la LCST, le nanogel a été mesuré avec précision à des intervalles de 1 °C pour les changements de taille et de charge de surface des nanogels en utilisant la diffusion dynamique de la lumière (DLS) (ELS-2000ZS, Otsuka Electronics, Japon).

Propriétés de libération du médicament de PNIPAM-co-AAc

Pour étudier le comportement de libération du -LP, 10 mL de nanogels chargés en β-LP ont été transférés dans un tube de dialyse (3,5 kDa), qui a ensuite été agité à température ambiante et à 37 °C dans du PBS. À un temps de libération défini (0-12 h), 2 mL de l'échantillon dans chaque solution de mélange ont été analysés par le spectromètre UV-Vis. Dans le spectromètre UV-Vis, la ligne de base a été fixée à 200-800 nm avec du PBS à pH 2, 4, 7,4 et 8, et 2 ml de la β-LP libérée contenue dans la solution de PBS ont été ajoutés à la cuvette.

Activité de libération de drogue par des stimuli de température et de pH

Le double effet sur la viabilité cellulaire a été évalué par le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Des cellules de fibroblastes NIH3T3 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (2 × 10 ⁴ cellules/puits) et cultivée pendant une nuit à 37 °C. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu frais contenant de la -LP libre, du PNIPAM-co-AAc5 et du PNIPAM-co-AAc20 comprenant de la -LP à diverses concentrations. Après incubation pendant 3 h, une solution de MTT a été ajoutée dans chaque puits et incubée pendant 4 h. Ensuite, le milieu de culture a été retiré, suivi d'un traitement avec la solution de solubilisation. Les valeurs d'absorbance à 595 nm ont été mesurées avec un lecteur de microplaques (EL800, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Les images de fluorescence vivantes/mortes ont été capturées par un microscope à fluorescence (IX37, Olympus, Japon). Cellules NIH3T3 (1,5 × 10 ⁵ cellules/puits) ont été ensemencées dans μ-Slide 8-well (ibidi, Munich, Allemagne) et cultivées pendant une nuit. Après avoir remplacé le milieu de culture, 20 μg/mL de β-lapachone libre, PNIPAM-co-AAc5 et PNIPAM-co-AAc20 comprenant de la β-LP dispersée dans le milieu de culture ont été ajoutés dans les puits. Après incubation pendant 3 h ou 6 h, les cellules ont été lavées et la viabilité cellulaire a été évaluée par le test de viabilité/cytotoxicité LIVE/DEAD® (Molecular Probes, Eugene, OR).

Résultats et discussion

Préparation de PNIPAM-co-AAc Nanogels

Des nanogels PNIPAM-co-AAc avec trois teneurs différentes en AAc (5, 10 et 20 %) ont été fabriqués par une méthode de polymérisation radicalaire. MET et SEM ont été utilisés pour confirmer la taille des particules, la morphologie et la monodispersité des nanogels. Comme le montrent les figures 1a et b, le nanogel PNIPAM-co-AAc5 présentait une distribution de taille relativement uniforme avec un diamètre de particule moyen d'environ 250 nm. De plus, la transition sol-gel des nanogels à base de PNIPAM a été observée à mesure que la température augmentait. Bien que les solutions aqueuses de PNIPAM-co-AAc5 aient persisté sous forme de phase sol à température ambiante, le nanogel est passé à la phase de gel lors du chauffage, ce qui a rendu la solution trouble au-dessus de la LCST (Fig. 1c). Les potentiels zêta du PNIPAM, du PNIPAM-co-AAc5, du PNIPAM-co-AAc10 et du PNIPAM-co-AAc20 ont diminué à - 13,56 mV, - 16,61 mV, - 21,87 mV et - 23,62 mV en raison de l'augmentation de la surface groupes carboxyle fournis par la teneur en AAc (Fig. 1d). Il a également indiqué que le diamètre hydrodynamique du PNIPAM-co-AAc présentait une plage de 217 à 442 nm lorsque la teneur en AAc augmentait jusqu'à 30 ° C en raison de l'augmentation des liaisons hydrogène avec l'eau et de la répulsion interélectronique. Cependant, les diamètres des nanogels ont diminué à 50 °C en raison des interactions hydrophobes (Fig. 1e). Ces résultats suggèrent que la taille du PNIPAM-co-AAc peut varier en fonction de la quantité d'AAc liée au PNIPAM et de la température. La composition du nanogel a été caractérisée en outre par spectroscopie FT-IR, comme le montre la figure 2. Le 1 100 cm ⁻¹ ~1200 cm ⁻¹ le pic indiquait une flexion C-N. Les spectres affichaient également le -CH₂ pic de vibration d'étirement à 1 300 cm ⁻¹ ~1400 cm ⁻¹ . Le pic supplémentaire à 1600 cm ⁻¹ ~1700 cm ⁻¹ a été attribué à C=O, qui appartient au NIPAM. Plus précisément, l'étirement de l'acide carboxylique (−COOH) est apparu à 1700 cm ⁻¹ ~ 1800 cm ⁻¹ sauf pour le nanogel PNIPAM. Un large pic à 3 200 cm ⁻¹ ~3300 cm ⁻¹ a montré l'absorption de l'étirement N-H. Par conséquent, les dérivés de nanogel de PNIPAM composés de divers rapports de mélange de PNIPAM et d'AAc ont des caractéristiques différentes en raison des différentes teneurs en AAc.

un TEM et b Image SEM de nanogels PNIPAM-co-AAc5. c Aspect physique des nanogels PNIPAM-co-AAc5. Les barres d'échelle mesurent 500 nm. d Potentiels Zeta et e diamètres moyens mesurés à 30 °C et 50 °C par DLS pour le PNIPAM avec des teneurs en AAc 0 %, 5 %, 10 % et 20 % à pH 7,4

Spectres FT-IR du PNIPAM avec des teneurs en AAc de 0 %, 5 %, 10 % et 20 %

Caractéristiques sensibles à la température

Pour étudier le comportement de la température, la distribution de la taille des nanogels PNIPAM-co-AAc a été évaluée par DLS. Le changement du diamètre hydrodynamique a été mesuré dans la plage de température de 30 à 50 °C pour déterminer la LCST. Le PNIPAM avec des teneurs en AAc de 5 %, 10 % et 20 % a eu deux étapes de transition distinctes (Fig. 3). Les dérivés du PNIPAM-co-AAc ont commencé la première étape de transition à 30 °C, puis sont entrés dans la deuxième étape de transition vers 40 °C. De plus, la deuxième température de transition avait tendance à augmenter avec l'augmentation des teneurs en AAc du PNIPAM. Par conséquent, la LCST du PNIPAM-co-AAc20 était à une température relativement élevée de 45 °C, tandis que celle du PNIPAM était à 32 °C. Cette différence dans les valeurs de LCST pourrait être induite par l'augmentation de la charge négative des dérivés de PNIPAM-co-AAc. Cependant, les températures LCST de PNIPAM-co-AAc5 et PNIPAM-co-AAc10 étaient presque identiques à 37 °C et 39 °C, respectivement. Par conséquent, PNIPAM-co-AAc10 n'a pas été davantage utilisé pour évaluer les performances de libération du médicament. Les valeurs de LCST obtenues dans les dérivés PNIPAM-co-AAc étaient similaires à celles de l'étude précédente [37]. Ces résultats ont démontré que les nanogels PNIPAM-co-AAc ont deux transitions de phase et que la LCST du PNIPAM contenant de l'AAc est déplacée vers la température plus élevée en raison des interactions hydrophobes des chaînes interfaciales du PNIPAM et de la répulsion interélectronique via les groupes carboxyle de l'AAc.

Dépendance à la température des diamètres hydrodynamiques de a PNIPAM, b PNIPAM-co-AAc5, c PNIPAM-co-AAc10, et d Nanogels PNIPAM-co-AAc20 à pH 7,4

Performance de libération de médicament à double contrôle

Pour comparer les profils de libération de médicament du PNIPAM, du PNIPAM-co-AAc5 et du PNIPAM-co-AAc20, la -LP libérée par les dérivés du PNIPAM-co-AAc a été mesurée pendant une période de 6 h à température ambiante (24 °C) et la température corporelle (37 °C). Initialement, nous avons mesuré les spectres d'absorption UV-Vis du PNIPAM-co-AAc20 et du PNIPAM-co-AAc20 incluant le -LP et observé une forte absorption à 257 nm correspondant au β-LP (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). La capacité de charge médicamenteuse de la -LP chargée de PNIPAM-co-AAc20 s'est avérée être d'environ 60 % en utilisant une courbe d'étalonnage concentration-absorbance standard de la -LP (Fichier supplémentaire 2 :Figure S2) [38, 39]. Comme le montre la figure 4, le pourcentage cumulé de médicament libéré par les dérivés du PNIPAM-co-AAc a montré que la quantité de -LP libérée par le PNIPAM-co-AAc20 était relativement plus faible et que son efficacité de libération était significativement réduite par rapport au PNIPAM et au PNIPAM. -co-AAc5 aux deux températures. Cependant, les points de libération du médicament saturé de la plupart des dérivés de PNIPAM-co-AAc ont été observés après le traitement dans les 2 h. En particulier, l'efficacité de libération du médicament des nanogels PNIPAM a été fortement affectée par la température de réaction. Les dérivés de PNIPAM-co-AAc ont présenté une efficacité de libération de médicament améliorée à température corporelle par rapport à celle à température ambiante. Ce résultat était également soutenu par la libération cumulative de médicament significativement plus élevée de tous les dérivés du PNIPAM lorsque la température de réaction était supérieure à 40 °C (Fichier supplémentaire 3 : Figure S3).

Libération cumulative de β-LP des nanogels PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5 et PNIPAM-co-AAc20 à des températures de a température ambiante (24 °C) et b température corporelle (37 °C) et pH 7,4

Comme le montrent la figure 4 et le tableau 1, les nanogels PNIPAM-co-Aac à haute température pourraient facilement libérer le médicament en raison de leur retrait remarquable. De plus, l'efficacité de libération de médicament la plus élevée à la température corporelle a été observée dans le PNIPAM et la deuxième efficacité la plus élevée était PNIPAM-co-AAc5. Les deux ont une teneur en AAc relativement faible, ce qui entraîne une diminution de la température LCST. En particulier, nous avons observé que la -LP dans le PNIPAM-co-AAc20 était libérée avec une efficacité relativement plus faible (61 %) à température corporelle, tandis que dans les autres nanogels, environ 80 % de la -LP était libérée à la même température. Ces résultats ont indiqué que le PNIPAM-co-AAc20 présentait une libération minimale du médicament à température corporelle tout en encapsulant autant que possible, par rapport au PNIPAM et aux autres PNIPAM-co-AAc5. De plus, ces résultats étaient également cohérents avec les changements dépendant de la température dans la mesure de la taille des dérivés du PNIPAM pour déterminer les valeurs LCST.

Ensuite, nous avons évalué si le PNIPAM-co-AAc20 pouvait contrôler la libération du médicament via un autre facteur auquel le PNIPAM répond, le pH, avec un piégeage maximal du médicament à la température corporelle. Le PNIPAM-co-AAc20 a montré une efficacité de libération maximale cumulée d'environ 70 %, augmentant d'environ 10 % à pH 8 par rapport à un pH acide ou neutre. Pendant ce temps, aucune différence significative n'a été observée entre le pH 7,4 et le pH acide (Fig. 5 et Tableau 2). Pris ensemble, ces résultats indiquent que le profil de libération de médicament de PNIPAM-co-AAc20 peut être affecté en contrôlant la teneur en AAc, et ce nanogel à double libération de médicament contrôlée pourrait moduler efficacement le taux de libération de médicament à des valeurs de pH de base qui sont connues pour être présent dans certaines parties de l'intestin grêle [40].

Libération cumulative de β-LP à partir de nanogels PNIPAM-co-AAc20 à différentes valeurs de pH

Évaluation des propriétés de libération des médicaments

L'anti-prolifération in vitro a été évaluée pour effectuer un critère clé des nanomatériaux conçus pour une administration et une libération contrôlées de médicaments. Comme indiqué sur la figure 6, la -LP libre a montré une viabilité cellulaire inférieure à celle des nanogels PNIPAM-co-Aac chargés de β-LP pour des concentrations équivalentes de -LP. De plus, le nanogel PNIPAM-co-AAc20 a présenté une viabilité cellulaire relativement élevée à une concentration de 20 μg/mL, car la libération de -LP du nanogel PNIPAM-co-AAc20 était relativement faible par rapport à celle du nanogel PNIPAM-co-AAc5 à 37 °C. De plus, ce résultat a également coïncidé avec les profils cumulatifs de libération de médicament. Ensuite, nous avons évalué la viabilité cellulaire à l'aide de cellules vivantes et mortes colorées par fluorescence (Fig. 7). Le test de coloration des cellules vivantes/mortes a montré que la -LP et le nanogel PNIPAM-co-AAc5, y compris la β-LP, étaient similaires en termes de viabilité cellulaire, tandis que PNIPAM-co-AAc20 a montré une augmentation significative de la viabilité cellulaire avec une dose de 20 μg/mL après traitement pendant 3 h. Cependant, une libération accrue de médicament à partir de PNIPAM-co-AAc20 a commencé à être observée après incubation à pH 8,0 pendant 3 h et une activité antitumorale synergique significative a été observée au même pH pendant les 6 h post-traitement. Ces résultats impliquent que le nanogel PNIPAM-co-AAc20 à double réponse à la température et au pH a une application potentielle pour le chargement et la libération contrôlés de médicaments dans l'intestin grêle terminal.

Activité anti-proliférative des nanogels PNIPAM-co-AAc chargés en β-LP à différentes concentrations dans des cellules de fibroblastes NIH3T3 pendant 3 h à 37 °C

Images fluorescentes de la cytotoxicité dans les cellules NIH3T3 avec a non traité, b seulement β-LP, c β-LP/PNIPAM-co-AAc5, et d Traitement β-LP/PNIPAM-co-AAc20 pendant 3 h à pH 7,4 et traitement β-LP/PNIPAM-co-AAc20 pendant 3 h (e ) et 6 h (f ) à pH 8,0. Les cellules vivantes et mortes sont colorées avec de la calcéine AM (vert) et de l'homodimère d'éthidium (rouge). Les barres d'échelle mesurent 100 μm

Conclusions

Nous avons développé des nanogels PNIPAM-co-AAc chargés en β-LP dont la libération de médicament peut être déclenchée par la température et le pH. Ces dérivés de nanogel ont été conçus et préparés par copolymérisation radicalaire. La LCST a augmenté avec l'augmentation du contenu en AAc des nanogels PNIPAM-co-AAc en raison de la répulsion interélectronique entre les groupes carboxyliques sur le contenu en AAc, entraînant le rétrécissement des PNIPAM-nanogels et la libération de médicament qui en résulte. Les nanogels PNIPAM-co-AAc à haute teneur en AAc chargés de β-LP ont présenté un profil de libération in vitro nettement réduit à la température corporelle. De plus, la libération du médicament peut être obtenue avec un effet synergique remarquable à pH basique. Enfin, nous démontrons que PNIPAM-co-AAc20 a des propriétés optimales, ayant une efficacité de libération de médicament réduite à la température corporelle mais une libération de médicament améliorée à pH 8,0, ce qui est soutenu par des tests de viabilité cellulaire utilisant des cellules de fibroblastes. Par conséquent, ce nanogel sensible à la température et au pH pourrait encourager une application prometteuse pour la libération de médicaments à double contrôle au pH physiologique de l'intestin grêle et une modalité attrayante pour l'administration de médicaments ciblée sur l'intestin via l'administration de médicaments par voie orale.

Abréviations

AAc :

Acide acrylique

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

FE-SEM :

Microscopie électronique à balayage à émission de champ

FT-IR :

Spectromètre infrarouge à transformée de Fourier

KPS :

Persulfate de potassium

LCST :

Abaisser la température critique de la solution

MBA :

N ,N ′-méthylènebisacrylamide

PNIPAM :

Poly-N -isopropylacrylamide

TEM :

Microscopie électronique à transmission

β-LP :

β-lapachone