Un nouvel immunocapteur magnétoélastique pour la détection ultrasensible de l'antigène carcino-embryonnaire

Contexte

Le cancer est l'une des maladies mortelles dans le monde [1]. Le cancer chez les patients peut être détecté cliniquement lorsque la concentration de biomarqueurs tumoraux atteint jusqu'à une certaine quantité dans le sérum [2]. Par conséquent, il est tout à fait nécessaire de réaliser des dosages sensibles, rapides et précis pour les marqueurs tumoraux, qui fournissent une stratégie efficace pour le diagnostic du cancer [3]. L'antigène carcinoembryonnaire (ACE) appartient à une famille de glycoprotéines de surface cellulaire avec un poids moléculaire de 180∼200 kDa. Il a été découvert pour la première fois dans des tissus cancéreux du côlon humain en 1965 [4, 5]. Le CEA se présente généralement à des niveaux très faibles (0 à 5 ng/mL) dans le sang d'adultes en bonne santé [6]. Généralement, un taux anormal de CEA peut être considéré comme un signe de cancer, comme un carcinome gastrique [7], un carcinome pancréatique [8], un carcinome colorectal [9], un carcinome pulmonaire [10] et un carcinome mammaire [11]. Cela signifie que le CEA pourrait être utilisé comme biomarqueur tumoral. La surveillance du taux de CEA dans le sang pourrait être utilisée pour prévenir, dépister et diagnostiquer les cancers. Pendant ce temps, le CEA peut également être utilisé pour la recherche de suivi de ceux qui ont été traités cliniquement. La sensibilité du CEA à la récidive tumorale est supérieure à 80 %, ce qui est plus précoce que l'examen clinique et pathologique. Ainsi, l'observation continue du CEA fournit une base importante pour le diagnostic et le pronostic des effets curatifs [12].

Les biocapteurs répondent à des reconnaissances spécifiques de signaux mesurables de sortie moléculaire biologique par une certaine discipline, permettant des réponses rapides, une sensibilité élevée et un faible coût. Récemment, les biocapteurs immunologiques ont été intensivement étudiés, tels que le dosage immunoenzymatique [13], le dosage immuno-fluoré [14] et le dosage immunologique électrochimique [15,16,17]. En raison de leur excellente spécificité et sensibilité, les immunocapteurs ont fourni des moyens prometteurs pour l'analyse des biomarqueurs tumoraux, même lorsque les composés cibles sont à de très faibles concentrations [18,19,20,21].

La nanotechnologie fournit de nouvelles méthodes pour l'application de nanoparticules (NP) dans la technologie de biodétection. Les NP métalliques présentent de nombreuses caractéristiques spéciales, qui fournissent des plates-formes remarquables pour l'interfaçage d'éléments de bio-reconnaissance [22, 23]. Les immunoessais basés sur les NP ont attiré une grande attention pour les chercheurs [24,25,26]. Les biocapteurs magnétoélastiques ne sont pas affectés par la température ambiante et le pH avec une sensibilité de réponse élevée. Par conséquent, dans cette étude, nous avons proposé une méthode de dosage immunologique magnétoélastique basée sur des nanoparticules d'or (AuNPs) et des micropuces magnétoélastiques. Un immunocapteur a été développé avec succès pour détecter les biomarqueurs CEA.

Résultats et discussion

Compte tenu de la forme en ruban de la micropuce magnétoélastique (ME), la perméabilité magnétique est la plus grande sur sa longueur [27]. Les résultats préliminaires ont montré que la largeur et l'épaisseur optimales de la puce ME étaient respectivement de 1 mm et 28 µm [28]. La simulation a été utilisée pour optimiser la longueur de la puce, comme le montre la figure 1b.

Longueur optimale de la puce ME. un Le déplacement relatif est différent avec la variation de longueur. b La simulation a été utilisée pour optimiser la longueur de la puce

Le déplacement relatif est différent avec la variation de longueur sur la figure 1a. Le déplacement relatif maximal est obtenu lorsque la longueur est de 6 mm sous l'analyse modale du premier ordre. Cela signifie la sensibilité théoriquement la plus élevée. Par conséquent, les dimensions optimales de la puce ont été conçues comme 6 mm × 1 mm × 28 μm dans cet article.

Un diagramme schématique du biocapteur Nano-ME est illustré à la Fig. 2. Premièrement, la puce Nano-ME a été traitée chimiquement par de la cystéine pour fabriquer les films moléculaires d'auto-assemblage (SAM) à la surface, en tant que couche fonctionnelle pour l'immobilisation de CEA Ab. Ensuite, l'albumine sérique bovine (BSA) favorise les performances des AbCEA en réduisant la liaison non spécifique et l'encombrement stérique. Des images au microscope à force atomique (AFM) ont été réalisées pour observer la morphologie de surface de la puce. Comme indiqué sur la figure 3a, l'épaisseur de la couche SAM était de 120 nm. L'imagerie de la figure 3b révèle que le CEAb était attaché de manière covalente à la couche SAM avec une rugosité croissante. Il a été clairement montré sur la figure 3c que le CEA était spécifiquement reconnu et efficacement combiné, avec une hauteur approximative de 200 nm et une taille plus grande.

Schéma du biocapteur Nano-ME construit

Images AFM de la couche SAM (a ). Couche CEAAb-SAM (b ). Complexe CEA-CEAAb(c )

Dans une certaine dimension de la puce, la concentration en anticorps est un facteur important lié à la sensibilité de l'immunocapteur. Par conséquent, il était nécessaire d'évaluer les signaux de réponse de différentes concentrations de CEAb (20, 50, 70 et 100 g/mL, comme le montre la figure 4a). Les résultats montrent que la réponse optimale a été obtenue à environ 448 Hz (Fig. 4b), lorsque la concentration de CEAAb est de 50 µg/mL. Si la concentration de CEAAb augmentait à 70 μg/mL, la réponse commençait à décliner en raison de l'encombrement stérique et de la répulsion électrostatique [29].

un La courbe de réponse en fréquence versus CEAb. b Histogramme de fréquence

En principe, le CEA est spécifiquement reconnu avec des anticorps, ce qui conduit à la diminution de la fréquence de réponse. La figure 5a montre la courbe de réponse en temps réel de l'immunocapteur vis-à-vis du CEA. Pendant ce temps, nous acquérons une courbe d'ajustement linéaire sur la figure 5b.

Réponse en temps réel (a ) et les courbes d'ajustement (b ) du biocapteur versus CEA

Généralement, la réponse stable du capteur a été obtenue à 40 min (Fig. 5a). Le changement de la fréquence de résonance a été enregistré avec les concentrations correspondantes de CEA. Le changement de Hz est linéairement dépendant du logarithme des concentrations de CEA allant de 0,1 à 100 ng/mL (R ² =  0,9688), avec la limite de détection de 2,5 pg/mL (Fig. 5b). A notre connaissance, la gamme linéaire et la limite de détection sont évidemment inférieures à celles des méthodes précédentes [28]. Les résultats ont démontré qu'une méthode sans fil et hautement sensible vis-à-vis du CEA a été établie avec succès.

Conclusions

Dans cette contribution, un immunocapteur Nano-ME pour la détection hautement sensible de l'ACE a été développé avec succès sur la base d'une puce ME. AuNPs et BSA ont amélioré efficacement la sensibilité et la stabilité. L'immunocapteur Nano-ME proposé présente de larges plages de détermination de CEA de 0,1 à 100 ng/mL avec une faible limite de détection de 2,5 pg/mL. Par conséquent, la détermination précise du CEA par l'immunocapteur tel que préparé a été obtenue avec des résultats satisfaisants. Bénéficiant de sa spécificité, sa simplicité et sa reproductibilité, la plateforme proposée montre une application prometteuse dans le développement de la détection non invasive du cancer.

Méthodes

Sous le champ magnétique variant dans le temps, la micropuce ME vibre sur toute la longueur. Dans le champ magnétique modulé pour faire vibrer la micropuce ME, l'énergie du champ magnétique est convertie en énergie potentielle élastique pour atteindre la valeur maximale. En raison de la forme de la puce de capteur en forme de ruban, la perméabilité magnétique est la plus élevée sur toute sa longueur; par conséquent, un champ magnétique incident génère des vibrations longitudinales dans le capteur à partir de presque n'importe quelle orientation, à l'exception de la normale au plan basal du capteur. Donné par l'Éq. (1) :

où E désigne le module d'élasticité, v est le coefficient de Poisson, ρ est la densité du matériau du capteur, et L est la dimension longitudinale de la puce. Lorsque la température de test, l'humidité et d'autres paramètres environnementaux sont constants, le changement de fréquence de résonance du capteur magnétoélastique dépend uniquement du changement de masse (△m ) sur sa surface, comme donné par l'Eq. (2)

Basé sur l'éq. (2), le changement de fréquence de résonance est proportionnel à la quantité de CEA. Par conséquent, les concentrations de CEA peuvent être obtenues par le changement de fréquence, où f ₀ est la fréquence de résonance initiale, M est la masse initiale, △m est le changement de masse, et △f est le décalage de la fréquence de résonance du capteur. L'équation 2 montre que la sensibilité du capteur (△f /△m ) est inversement proportionnel à la masse magnétoélastique initiale (M) du capteur. Les capteurs avec des dimensions physiques plus petites ont une masse initiale inférieure, ce qui entraîne une sensibilité plus élevée. Le signe négatif dans l'équation représente une diminution de la fréquence (△f ) à une addition de masse non magnétoélastique (△m ) sur le capteur. Par conséquent, la liaison des organismes cibles sur la surface du biocapteur provoque une augmentation de la masse avec une diminution correspondante de la fréquence de résonance fondamentale.

Les bases magnétoélastiques de l'alliage Metglas 2826MB (Fe40Ni38Mo4B18) ont été traitées par Honey well Corporation (Morristown, NJ, USA). Le CEA, l'anticorps CEA, l'albumine de sérum bovin (BSA, 99 %) et la solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH =7,4) ont été achetés auprès de Sangon (Shanghai, Chine). Acétone, isopropanol, éthanol, 1-éthyl-3-carbodiimide (EDC) et N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Corporation (Saint Louis, MO, USA). Tous les autres réactifs sont de qualité analytique. L'eau ultrapure a été obtenue à partir du système Mill-Q (Milli-pore, USA). AFM Park System (ND-100, Corée), plasma (P3C, Shanghai, Chine), ohmmètre de Gauss (GM500), analyseur de réseau vectoriel ZNB (R&S, Allemagne), découpeur laser (AV3620A, Qingdao, Chine) et gaussmètre HT20 (Hengtong, Shanghai) ont été utilisés.

La base en alliage ME a été découpée au laser en micropuces de 6 mm × 1 mm × 28 m, puis nettoyée aux ultrasons avec de l'acétone, de l'isopropanol, de l'éthanol et de l'eau déminéralisée pendant 5 min et séchée à l'azote. L'activation de la modification de surface des micropuces nettoyées est traitée par une méthode plasma. Les deux côtés de la micropuce ont été pulvérisés avec une couche de chrome (100 nm), suivie d'un revêtement avec une couche AuNP (40 nm) pour fabriquer des puces Nano-ME. La puce Nano-ME traite du plasma avec de l'oxygène de haute pureté (0,9999) puis immergé dans une solution de cystéamine 40 mM et maintenu pendant 12 h à température ambiante. Après cela, les puces Nano-ME ont été biologiquement modifiées et incubées avec différentes concentrations de CEAAb pendant 1 h à 37 °C en présence de 1-éthyl-3-carbodiimide (EDC) et de N -hydroxysulfosuccinimide (NHS). Le CEAAb a d'abord été activé avec 10 mg/mL d'EDC et 10 mg/mL de NHS. Enfin, la puce Nano-ME, modifiée par le CEAAb, a encore été réalisée avec 0,1% de BSA pendant 30 min.

Le biocapteur Nano-ME a été construit comme suit :un tube de verre a été enveloppé par la bobine et connecté à un analyseur de réseau vectoriel. Pendant ce temps, l'ajout de champ magnétique a fourni un courant alternatif pour que la bobine produise un champ magnétique alternatif. La fréquence de résonance du biocapteur Nano-ME peut être obtenue par un analyseur de réseau vectoriel. Différentes concentrations de CEA (0-100 ng/mL) ont été ajoutées dans le tube à essai, et le décalage de fréquence a été enregistré toutes les 5 min jusqu'à 40 min. Après cela, la puce Nano-ME a été rincée avec du PBS pour la caractérisation AFM.

Abréviations

AFM :

Microscope à force atomique

AuNP :

Nanoparticules d'or

BSA :

Sérum albumine bovine

CEA :

Antigène carcino-embryonnaire

CEAAb :

Anticorps CEA

EDC :

1-Ethyl-3-carbodiimide

Hz :

Fréquence

ME :

Magnétoélastique

NHS :

N -Hydroxysulfosuccinimide

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

SAM :

Moléculaire à auto-assemblage