Effet des nanoparticules manufacturées sur la libération de substances exopolymères du phytoplancton marin

Contexte

Les nanoparticules manufacturées (ENP), dont la taille varie entre 1 et 100 nm (dans au moins une dimension), sont utilisées dans la fabrication de nombreux biens de consommation, notamment les encres et peintures d'imprimante, les détergents, les bactéricides, les revêtements, les cosmétiques, les lotions solaires, pneus, construction d'ordinateurs et livraison de médicaments. Compte tenu de l'application prometteuse des ENP, le financement de la National Nanotechnology Initiative (NNI) aux États-Unis à lui seul a approché 1,4 milliard de dollars en 2017 [1,2,3]. L'établissement de connaissances fondamentales à l'échelle nanométrique était l'objectif principal de la communauté de recherche en nanotechnologie dans la première phase. En 2009, ces nouvelles connaissances soutenaient environ un quart de mille milliards de dollars du marché mondial, dont environ 91 milliards de dollars étaient des produits américains qui incorporent des composants à l'échelle nanométrique [4]. Avec le développement rapide de la nanotechnologie, il est inévitable que les ENP finissent par trouver leur chemin vers les systèmes aquatiques. La principale préoccupation concernant les ENP en termes de toxicité potentielle (par exemple, le potentiel de production d'espèces réactives de l'oxygène, ROS) dans l'environnement est liée à leur grande et unique réactivité de surface. Cependant, l'impact réel sur l'écosystème marin reste largement inconnu en raison des facteurs environnementaux et biologiques complexes des eaux naturelles et de la variété des ENP [1, 5, 6]. Des études antérieures ont montré que les ENP peuvent causer des dommages importants à l'écosystème marin à base d'algues [7, 8]. Il a été démontré que les organismes marins (en particulier le phytoplancton) interagissent avec les ENP, entraînant des répercussions négatives [9,10,11]. Avec l'augmentation potentielle de l'utilisation des nanotechnologies dans divers domaines, de plus en plus d'ENP peuvent pénétrer dans les environnements aquatiques, de sorte que les réponses cellulaires du phytoplancton marin aux ENP méritent une plus grande attention [12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21].

La plupart des microbes marins, qu'ils soient auto ou hétérotrophes, sont généralement capables de produire des substances exopolymères (EPS), qui ont divers rôles fonctionnels et propriétés physiques dans l'écosystème marin, agissant comme inhibiteurs de croissance, promoteurs de croissance, toxines, piégeurs de métaux ou comme substrats pour le cycle hétérotrophe [22,23,24,25,26]. Les EPS libérés par le phytoplancton et les bactéries dans l'océan sont des biopolymères colloïdaux anioniques riches en polysaccharides qui sont essentiels à la formation de gels marins, de neige marine et de biofilms, ainsi que pour le piégeage des colloïdes et des oligo-éléments et pour la protection contre diverses menaces environnementales, y compris les ENP [7, 15, 19, 20, 25, 27]. De plus, on pense que la sécrétion d'EPS est une réponse naturelle lorsque le phytoplancton subit divers stress [8].

Ca ²⁺ est un second messager commun impliqué dans une multitude de voies de signalisation intracellulaire. Il a été démontré que Ca ²⁺ est nécessaire pour la chimiotaxie, la motilité et l'adhérence chez la diatomée Amphora coffeaeformis [28]. Ca ²⁺ libre intracellulaire amélioré les niveaux sont connus pour conduire à l'activation de la protéine kinase C, qui est impliquée dans de nombreuses voies de signalisation intracellulaire [29]. Puisque la libération d'EPS est étroitement liée à la motilité et à l'adhésion des diatomées, il a été proposé qu'un Ca ²⁺ -le processus de sécrétion médié contrôle la libération d'EPS des diatomées [30], et la preuve directe vérifiant le Ca ²⁺ signalisation, exocytose et corrélation de Ca ²⁺ la signalisation avec exocytose a été rapportée dans notre étude précédente [31]. Des études antérieures ont également démontré que les interactions avec les ENP peuvent altérer le Ca ²⁺ intracellulaire voies, qui sont essentielles pour la signalisation cellulaire [29, 32, 33, 34]. Ca ²⁺ intracellulaire spécifique les changements de concentration sont importants dans les processus de signalisation et de sécrétion cellulaires; cependant, il n'y a aucun rapport de dioxyde de titane (TiO₂ ), dioxyde de silicium (SiO₂ ), ou dioxyde de cérium (CeO₂ ) pour altérer le Ca ²⁺ intracellulaire niveau en phytoplancton.

En 2013, Quigg et al. [8] ont résumé les effets toxiques directs et indirects des ENP sur les algues. Dans nos expériences précédentes, il a été démontré que les ENP facilitent l'agrégation des EPS [35]. À cet égard, l'EPS peut soit exacerber soit réduire la toxicité directe induite par l'ENP envers les organismes aquatiques [7, 15, 36]. Cependant, la mesure directe de la libération d'EPS par le phytoplancton sous le stress des ENP n'a jamais été rapportée. Dans cette étude, le but est d'étudier la libération d'EPS de quatre espèces différentes de diatomées (Odontella mobiliensis , Squelette grethae , Phaeodactylum tricornutum , Thalassiosira pseudonana ) et une algue verte (Dunaliella tertiolecta ) sous traitements ENP. En comprenant les mécanismes sous-jacents de la libération d'EPS induite par l'ENP dans le phytoplancton, la mise en œuvre de mesures préventives et de sécurité peut atténuer les effets potentiellement néfastes sur les organismes marins.

Résultats et discussions

Caractérisation ENP

La diffusion laser dynamique (DLS) a été utilisée pour caractériser les mesures de taille des ENP suivantes en suspension dans de l'eau pure :TiO₂ , SiO₂ , et PDG₂ . La distribution granulométrique variait de 7 à 66 nm dans TiO₂ , 9 à 66 nm en SiO₂ , et 12 à 70 nm dans CeO₂ . Certaines tailles plus grandes pourraient être dues à l'agrégation ou à l'agglomération alors que la taille prédominante pour TiO₂ est de 25 nm, SiO₂ est de 10 à 20 nm, et CeO₂ est de 15 à 30 nm, ce qui correspond aux informations du fabricant (Fig. 1).

Caractérisation ENP par évaluation DLS de a TiO₂ , b SiO₂ , et c PDG₂ en milieu L1 après sonication montrant leur distribution de taille. La concentration finale d'ENP dans l'échantillon DLS est de 1 μg/ml, le temps de mesure est de 3 min juste après la sonication

Les ENP induisent du Ca intracellulaire ²⁺ Concentration en phytoplancton

Étudier si les ENP pourraient induire une augmentation du Ca ²⁺ intracellulaire concentration, les cellules de phytoplancton (DO 600 = 0.8) ont été chargées avec du colorant Fluo-4AM et exposées à 1 mg/ml de TiO₂ 25 nm , 10-20 nm SiO₂ , et 15-30 nm CeO₂ ENP respectivement. Le changement de Ca ²⁺ intracellulaire La concentration, représentée par l'intensité de fluorescence dans les cellules de phytoplancton, a été surveillée pendant 150 s. Les figures 2a–e montrent que 1 mg/ml de trois ENP respectifs a augmenté le Ca ²⁺ concentration en SiO₂ d'environ 50 à 300 %, TiO₂ d'environ 40 %, et PDG₂ d'environ 150 à 200 %, tandis que les conditions de contrôle (milieu L1) sont restées inchangées. Les résultats montrent que les ENP peuvent induire un Ca ²⁺ intracellulaire significatif réponses dans le phytoplancton et suggèrent que le phytoplancton répond à des ENP distinctes via Ca ²⁺ Voies de signalisation. Nos données n'indiquent que des changements mineurs dans le Ca ²⁺ intracellulaire niveaux lorsque TiO₂ est présent, potentiellement attribué à la mort cellulaire substantielle du phytoplancton par TiO₂ -toxicité induite [37, 38]. Dans notre étude précédente, TiO₂ augmentation provoquée du Ca ²⁺ intracellulaire concentration [34] ainsi qu'une apoptose cellulaire importante [39]. Cependant, SiO₂ a montré de façon surprenante le Ca ²⁺ intracellulaire le plus évident augmentation pour toutes les espèces de phytoplancton, tandis que CeO₂ ne peut déclencher qu'un Ca ²⁺ intracellulaire intermédiaire augmentation de la concentration. Des recherches antérieures suggéraient un potentiel élevé de CeO₂ concentrations (> 50 mg/ml) pour induire un stress oxydatif intracellulaire et une élévation du Ca ²⁺ intracellulaire niveaux, bien que les effets aient été faibles, et ont soutenu notre conclusion [40]. Nous avons également mesuré le potentiel zêta de chaque ENP dans l'eau de mer artificielle pour traiter l'effet potentiel que pourrait provoquer la charge de surface ; cependant, la valeur était faible. La mesure a indiqué que les ENP sont considérées comme approximativement neutres [41] (Fichier supplémentaire 1 :données supplémentaires). Cela a servi de premier rapport dans lequel des ENP disparates se sont avérés induire du Ca ²⁺ intracellulaire changements de concentration dans le phytoplancton spécifique, ouvrant finalement une nouvelle voie pour de futures recherches.

Mesure du Ca ²⁺ intracellulaire concentration après stimulation par différentes ENP. Différentes cellules de phytoplancton a Dunaliella tertiolecta , b Thalassiosira pseudonana , c Squelette grathae , d Phaeodactylum tricornutum , et e Odontella mobiliensis ont été traités avec TiO₂ 25 nm (vert), SiO₂ 10-20 nm (rouge), PDG₂ 15-30 nm (violet) avec une concentration de 1 mg/ml et contrôle (bleu). La flèche noire indique le moment où les EPN ont été appliqués (30 s). Les mesures montrent des données représentatives d'une moyenne de 20 cellules individuelles

Libération d'EPS induite par ENP dans le phytoplancton

Un test de lectine liée à une enzyme (ELLA) a été utilisé pour évaluer la quantité d'EPS libérée par les cellules de phytoplancton lorsqu'elles sont stimulées avec TiO₂ , SiO₂ , et PDG₂ ENP, plage de concentration de 1 μg/ml à 5 mg/ml sur la base d'études précédentes pour TiO₂ [42, 43] et PDG₂ [44,45,46]. La sécrétion d'EPS a été normalisée par rapport à la quantité totale d'ADN de phytoplancton (Fichier supplémentaire 1 :données supplémentaires) afin d'avoir une base égale pour la comparaison. Par rapport au témoin, nous avons constaté que 10 à 20 nm de SiO₂ est capable d'augmenter la libération d'EPS jusqu'à 550% dans Dunaliella , 500% en Thalassiosira , 1000% dans le Squelette , 400% à Odontella , et 900 % dans le Phaeodactylum (Fig. 3). Quand les espèces phytoplanctoniques ont été exposées au TiO₂ , il n'y avait pas d'effet important sur la sécrétion d'EPS, car seul le Squelette et Phéodactyle montré des changements importants. Les données de libération d'EPS sont donc cohérentes avec notre Ca ²⁺ intracellulaire résultats de concentration. TiO₂ n'a pas présenté d'impact significatif sur la production d'EPS, similaire au fait que Ca ⁺² intracellulaire les concentrations ont montré des changements très limités dus à la toxicité du TiO₂ au phytoplancton. La production et les résidus de ROS peuvent entraîner de nombreuses complications telles que l'apoptose dans le phytoplancton [47,48,49]. Dans le PDG₂ traitement, les résultats ont montré un effet mineur sur Dunaliella , Squelette , Odontelle , et Phéodactyle . Cependant, SiO₂ a montré l'induction d'EPS la plus significative chez Thalassiosira pseudonana (environ 600%) et Skeletonema grethae (environ 1000-1500%). Ces données indiquent que différentes ENP peuvent induire une libération spécifique d'EPS à partir du phytoplancton et du Ca ²⁺ intracellulaire. les modifications correspondent également aux résultats de la version EPS. En évaluant les modifications du Ca ²⁺ intracellulaire concentration, il est évident qu'il existe une connexion directe dans le Ca ²⁺ voies cellulaires dans lesquelles les ENP évoquent la sécrétion d'EPS à partir du phytoplancton. L'observation ici est en accord avec nos études précédentes basées sur Phaeocystis Communiqué de l'EPS [31]. Les résultats fournissent une preuve directe que le phytoplancton peut détecter et distinguer les ENP répondant à différentes libérations d'EPS régulées par Ca ²⁺ voies cellulaires.

L'utilisation d'ELLA nous a permis de déterminer la libération d'EPS via les interactions du phytoplancton avec les ENP. Nos résultats indiquent que la sécrétion d'EPS était significativement augmentée lorsque le phytoplancton interagissait avec SiO₂ pour Dunaliella tertiolecta , Thalassiosira pseudonana , et Skeletonema grethae . Il semble que ces diatomées soient prêtes à reconnaître SiO₂ particules. Cependant, dans Phaeodactylum tricornutum , une forte sécrétion d'EPS n'a pas été trouvée. Cette différence représente la libération d'EPS déclenchée par les ENP dépendant de l'espèce de phytoplancton et de la concentration d'ENP (Fig. 3). Dans une étude précédente, les déversements d'hydrocarbures ont provoqué d'importants rejets microbiens d'EPS marins qui ont été proposés pour contrer les conséquences négatives des déversements d'hydrocarbures [50]. De plus, Boglaienko et Tansel ont découvert que SiO₂ particules a été capable d'éliminer efficacement les agrégats de pétrole [51]. Notre découverte fournit un nouveau mécanisme potentiel dans lequel le SiO₂ à faible toxicité les particules peuvent induire la libération d'EPS à partir de phytoplancton spécifique, facilitant potentiellement l'élimination des déversements d'hydrocarbures en favorisant l'agrégation d'EPS. Le dioxyde de cérium n'a jamais été signalé comme perturbant les écosystèmes marins à base de phytoplancton. Les résultats ici ont montré le PDG₂ Les ENP peuvent avoir un impact sur tout le phytoplancton ici, à l'exception de Thalassiosira pseudonana. PDG₂ Les ENP peuvent, comme SiO_2, ont la capacité d'augmenter la libération d'EPS à partir de phytoplancton particulier pour les applications d'atténuation des hydrocarbures.

Conclusions

L'interaction ENP-environnement marin devient de plus en plus critique en raison des rejets actuels et futurs de nanomatériaux. Ici, nous démontrons l'amélioration de la sécrétion d'EPS comme l'un des principaux effets des ENP sur le phytoplancton. Nous fournissons également des preuves que différents phytoplancton peuvent réagir différemment à divers stress ENP en régulant le Ca ²⁺ voies. Cependant, une évaluation complète des ENP dans l'écosystème marin nécessiterait des investigations supplémentaires pour fournir une connaissance et une compréhension détaillées des interactions entre les nanomatériaux et les organismes marins.

Libération d'EPS déclenchée par diverses ENP. Différentes cellules de phytoplancton a Dunaliella tertiolecta , b Thalassiosira pseudonana , c Squelette grathae , d Phaeodactylum tricornutum , et e Odontella mobiliensis ont été traités avec TiO₂ (cercles), SiO₂ (triangles), PDG₂ (carrés), respectivement, avec des concentrations de 5 mg/ml et 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml (n = 3)

Méthodes

Culture phytoplanctonique

Cultures en lots de Odontella mobiliensis (CCMP597), Dunaliella tertiolecta (UTEX999), Skeletonema grethae (CCMP775), Phaeodactylum tricornutum (UTEX646), Thalassiosira pseudonana (Provasoli - Collection de culture de phytoplancton marin Guillard, West Boothbay Harbor, MN, USA) ont été cultivés dans un milieu marin L1 (Sigma, MO, USA) sur un cycle de 14:10 (clair :sombre) à 100 μmol m ⁻² s ⁻¹ et 24 °C en conditions axéniques. La phase de croissance de la culture a été déterminée par comptage cellulaire avec un hémocytomètre.

Nanoparticules et caractérisation

Tous les ENP, TiO₂ , SiO₂ , PDG₂ (Sigma-Aldrich, MO, USA), ont été soniqués dans de l'eau pure avant utilisation. Les ENP ont été reconstituées avec du milieu L1 filtré (Sigma, MO, USA) avant d'être testées. La taille des ENP a été confirmée de manière indépendante à l'aide de la diffusion laser dynamique homodyne (DLS). Brièvement, des échantillons d'eau de mer ont été refiltrés à travers une membrane Millipore de 0,22 µm (prélavée avec du HCl 0,1 N) et versés directement dans cinq cellules de diffusion de 10 ml qui ont ensuite été positionnées dans le goniomètre d'un spectromètre laser Brookhaven BI-200SM (Brookhaven Instruments, NY, États-Unis). La fonction d'autocorrélation des fluctuations d'intensité de diffusion détectées à un angle de 45° a été traitée en ligne par un autocorrélateur Brookhaven BI 9000AT, et la distribution granulométrique a été calculée par la méthode CONTIN (Provencher, 1982). Les résultats de chaque échantillon ont été collectés en triple juste après la sonication. L'étalonnage du spectromètre DLS a été effectué en utilisant des suspensions standard de microsphères de latex monodispersées (Polysciences, PA, USA).

Traitement ENP

Les cellules de phytoplancton ont été cultivées en plaque 96 puits avec du milieu L1 pendant 24 h. Les cellules ont été traitées avec des stocks d'ENP :5 mg/ml et 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml de TiO₂ , SiO₂ , et PDG₂ (Sigma-Aldrich, MO, USA) ou milieu L1 (témoin) pendant 48 h. Le surnageant contenant l'EPS sécrété a été collecté et brièvement centrifugé à 4000 tr/min pour éliminer les ENP résiduelles. Ce protocole a été adapté de notre publication précédente [34]. La plage de concentration utilisée ici n'est pas destinée à représenter ou à imiter les niveaux actuels d'ENP dans l'environnement, mais vise à évaluer le plein impact potentiel des ENP sur le phytoplancton marin et à étudier les mécanismes cellulaires associés. En tant que nanomatériau émergent prometteur, les ENP n'ont pas encore atteint leur pleine capacité commerciale. Une évaluation détaillée de leurs impacts écologiques complets est indispensable avant que les ENP n'entrent sur le marché des produits commerciaux et ménagers pour introduire davantage d'ENP dans l'océan.

Essai de lectine liée à une enzyme (ELLA)

Le surnageant contenant le polysaccharide sécrété a été collecté et brièvement centrifugé à 1700 rcf (Megafuge 1.0R) pour éliminer les ENP résiduelles. Le surnageant a ensuite été incubé dans une plaque à 96 puits (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, USA) pendant une nuit à 4 °C. Ensuite, la plaque à 96 puits a été lavée avec du PBST (PBS  + 0,05 % de Tween-20) et du PBS, puis bloquée avec 1 % de BSA. La plaque à 96 puits a été à nouveau lavée avec du PBST et du PBS et incubée avec de la lectine (Concanavaline A, ConA) (Sigma-Aldrich, MO, USA), conjuguée à de la peroxydase de raifort (HRP ; 5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, MO , USA), à 37 °C pendant 1 h. Le substrat, 3,39,5,59-tétraméthylbenzidine (TMB; Sigma-Aldrich, MO, USA), a été ajouté à chaque puits à température ambiante suivi de H₂ SO4 (Sigma-Aldrich, MO, USA) afin de terminer la réaction. La densité optique a été mesurée à 450 nm par PerkinElmer VICTOR3 (MA, USA). Ce protocole a été adapté de notre publication précédente [34, 52].

Détermination de l'ADN

Le culot contenant du phytoplancton a été collecté et obtenu le kit ZR-96 Quick-gDNA (ZYMO Research, CA, USA). En bref, un tampon de lyse 4x a été utilisé pour briser les cellules de phytoplancton et s'écouler à travers la colonne de liaison à l'ADN, élué par le tampon d'élution à la fin. Les concentrations d'ADN ont été mesurées par NanoDrop ND-1000 (Thermo, CA, USA). Le protocole a été adapté du protocole du kit fabriqué.

Mesures du Ca intracellulaire ²⁺ Concentrations induites par les ENP

Les cellules de phytoplancton ont ensuite été chargées avec un colorant Fluo-4AM (1 mM) (Kd = 335 nM, λEx = 494 nm et λEm = 506 nm, ThermoFisher, CA, USA) pendant 60 min [31]. Après le chargement du colorant, les cellules de phytoplancton ont été rincées, incubées avec du milieu L1 et traitées avec 1 mg/ml de TiO₂ , SiO₂ , et PDG₂ respectivement. Toutes les expériences de signalisation du calcium ont été réalisées sur un microscope Nikon (Nikon Eclipse TE2000-U, Tokyo, Japon). Le protocole et les conditions ont été adaptés de publications précédentes [31, 34].

Potentiel Zeta de la mesure ENP

Pour mesurer les charges de surface des ENP, le potentiel zêta (ζ) des ENP a été mesuré avec un Zetasizer Nano ZS, Malvern, en présence d'eau de mer artificielle à 25°C. Une fois les données collectées à partir de chaque échantillon, les valeurs enregistrées ont été moyennées.

Analyse statistique

Les données sont rapportées sous forme de moyennes ± SD. Chaque expérience a été réalisée indépendamment au moins trois fois. Les histogrammes ont été réalisés par GraphPad Prism 6.0. (GraphPad Software, Inc., San Diego, Californie, États-Unis).