Bone Morphogenic Protein-2 (rhBMP2)-Loaded Silk Fibroin Scaffolds pour améliorer l'ostéoinductivité dans l'ingénierie des tissus osseux

Contexte

La capacité de régénération de l'os permet la réparation des petites fractures osseuses par elle-même. L'os est formé, suivi de l'union et enfin de la reconstruction de la forme et de la forme originales de l'os. Cependant, cette capacité est limitée, ce qui crée un besoin d'autogreffes ou d'allogreffes pour le traitement [1]. L'allogreffe consiste à obtenir l'os d'un donneur distinct qui peut provoquer une réaction immunologique. L'autogreffe, où l'os est obtenu à partir du propre corps du patient ne crée pas de problèmes immunologiques mais est limitée par la quantité suffisante d'os disponibles [2,3,4].

L'ingénierie tissulaire est perçue comme une technologie potentielle pour surmonter la limitation immunologique de l'allogreffe et de l'autogreffe. Avec l'ingénierie tissulaire, des cellules spécialisées comme les cellules souches mésenchymateuses humaines ou les cellules d'ostéosarcome (MG63) sont cultivées dans un environnement approprié sur un échafaudage préfabriqué, et ce système de cellules et d'échafaudage est ensuite utilisé comme greffon [5, 6].

L'échafaudage est utilisé pour fournir un ancrage et une niche biochimique aux cellules pour la survie et la prolifération. Plusieurs propriétés à savoir. la résistance mécanique, l'ostéoinduction, la biorésorption, la porosité graduée et la biocompatibilité doivent être prises en compte lors de la sélection du matériau pour la fabrication de l'échafaudage. L'ostéoinduction (induction de la formation osseuse) est l'une des propriétés requises du matériau à utiliser dans la fabrication de l'échafaudage de l'ingénierie tissulaire osseuse (BTE) [7]. Les échafaudages avec des facteurs ostéogéniques sont puissants pour imiter le processus de régénération du tissu osseux qui couple l'angiogenèse et l'ostéogenèse qui peuvent recruter la cellule progénitrice et sa différenciation. Les protéines morphogéniques osseuses (BMP) sont la classe de facteurs de croissance qui induit la formation osseuse et sont proposées pour les applications BTE avec la matrice osseuse déminéralisée (DBM) et le phosphate de calcium [8,9,10].

Plusieurs groupes ont signalé l'utilisation de métaux, de céramiques, de polymères et composites synthétiques et de fibroïne de soie comme matériaux potentiels pour la fabrication d'échafaudages dans le BTE. La fibroïne de soie (SF) a été signalée comme un matériau approprié pour la fabrication d'échafaudages pour les applications d'ingénierie tissulaire en raison de ses propriétés mécaniques et biocompatibles remarquables [5]. À ce jour, aucun rapport n'a été publié évaluant les avantages associatifs des BMP avec des nanoscaffolds électrofilés SF.

Nous rapportons ici la fabrication de nouveaux échafaudages nanofibreux électrofilés SF conjugués à la protéine 2 morphogénique osseuse humaine recombinante (rhBMP2). Les échafaudages ont été comparés à ceux des échafaudages SF purs pour élucider l'effet de la conjugaison de rhBMP2 sur l'ostéoinduction. La viabilité cellulaire et les propriétés de prolifération cellulaire ont également été mesurées pour établir la puissance de l'échafaudage pour de nouvelles et meilleures applications d'ingénierie des tissus osseux.

Méthodes

Préparation de solutions aqueuses de SF/BMP2

Au début, SF a été isolé des cocons de vers à soie, Bombyx mori , sous forme de solution aqueuse. Le protocole établi a été suivi avec de légères modifications [11]. Les cocons ont été bouillis dans 100 ml de 0,02 M Na₂ CO₃ pendant 20 min puis rincé abondamment à l'eau distillée pour éliminer l'excès de séricine et de cire hydrosolubles. La fibroïne extraite a ensuite été dissoute dans une solution de bromure de lithium 9 M à 60 °C pendant 4 h et a ensuite été dialysée contre de l'eau pendant 4 jours. La concentration finale a été déterminée en pesant la matière sèche après séchage et s'est avérée être de 7% w /v . Cette solution a ensuite été utilisée après concentration à différents niveaux par dialyse contre 1 L de polyéthylène glycol à 25 % (PEG, 10 000 g mol ⁻¹ ) solution à température ambiante. Des solutions aqueuses de SF diluées ont été préparées en les diluant avec de l'eau distillée, et toutes les solutions ont été stockées à 10 °C jusqu'à la poursuite du traitement. La poudre lyophilisée de protéine morphogénique osseuse humaine recombinante-2 (rhBMP2) a été dissoute dans du PBS (pH 3,8). La solution de protéine a été stérilisée avec des filtres à seringue de 0,22 um et a été ajoutée sous forme de solution aqueuse à chaque solution de fibroïne sous agitation continue. La réticulation médiée par le glutaraldéhyde a été utilisée pour associer la BMP à la fibroïne. En bref, pour 10 ml de mélange réactionnel, 5 ml chacun de 6% de fibroïne de soie et 1% de rhBMP2 ont été réticulés en utilisant 200 L de glutaraldéhyde et 40 L de HCl 12 N comme agent d'activation de groupe. Avec cette procédure, trois solutions ont été préparées :(i) 3% de fibroïne de soie sans rhBMP2 (SF), (ii) 3% de fibroïne de soie avec 0,5% de rhBMP2 (SF+rhBMP2), et (iii) 12% de fibroïne de soie avec 0,125 % de rhBMP2 comme en (ii) (4SF+rhBMP2). Ces solutions ont été utilisées dans les procédures d'électrofilage pour la fabrication d'échafaudages.

Fabrication d'échafaudage par électrofilage

Pour la fabrication de l'échafaudage, chaque solution a été chargée dans une seringue en verre de 5 ml avec une aiguille en acier inoxydable (25G, ID 0,26 mm, Sigma Aldrich) qui est connectée à une alimentation CC de 5,5 kV. Pour la préparation des fibres, le débit de sortie a été maintenu à 0,4 mL h ⁻¹ à l'aide d'une pompe à seringue, et les fibres électrofilées ont été recueillies sur une feuille d'aluminium maintenue à un écart de 15 cm de la pointe du capillaire. Les échantillons ont été prélevés pendant 4 h chacun.

Microscopie électronique à balayage

Pour l'examen morphologique des échafaudages préparés, la SEM a été réalisée à l'aide de Zeiss EVO40SEM. Les échantillons ont été recouverts d'or par pulvérisation cathodique avant le traitement ultérieur des images numérisées. La détermination du diamètre des fibres se fait en faisant la moyenne des diamètres de 10 fibres aléatoires dans le cadre de l'image.

Propriétés mécaniques de l'échafaudage

Des expériences de compression ont été réalisées pour évaluer les propriétés mécaniques des échafaudages développés à l'aide d'un testeur électromécanique de table à colonne unique Instron (modèle 3345, Instron, Canton, MA). Des fibres de 0,2 mm de diamètre, obtenues par électrofilage à des durées plus longues, ont été utilisées pour déterminer la résistance à la traction et l'allongement à la rupture à partir des courbes contrainte-déformation à 25 °C et 50 % d'humidité.

Étude de gonflement

Pour la mesure du taux de gonflement, chaque formulation a été dissoute dans du PBS (pH 7,4) à 37°C. Des échantillons ont été prélevés à des intervalles de temps prédéterminés et le poids sec a été mesuré à l'aide d'une balance électronique. L'essai a été poursuivi jusqu'à ce que le poids d'équilibre soit atteint. Le taux de gonflement a été exprimé comme ci-dessous :

où, W _o =poids sec initial des matrices nanofibreuses et W _s =poids des matrices nanofibreuses gonflées à chaque instant.

Culture cellulaire

Des cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs) ont été utilisées dans la présente étude pour évaluer le potentiel ostéoinductif des nanoscaffolds fabriqués. Les hMSC ont été cultivées et maintenues dans du DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline, à 37 °C dans 5 % de CO₂ atmosphère humidifiée jusqu'à 90 % de confluence. Les cellules ont ensuite été trypsinisées, centrifugées et remises en suspension dans un milieu pour quantification.

Les échafaudages ont été stérilisés par lavage avec de l'éthanol et irradiation avec de la lumière UV pendant 30 min et lavés avec du PBS (pH 7,4) par la suite. Un traitement au DMEM est administré aux échafaudages avant l'ensemencement cellulaire. 20 L de suspension cellulaire ont été ajoutés goutte à goutte à chaque échafaudage et un film plastique servant de contrôle. Les échafaudages ont été maintenus au repos en atmosphère humidifiée (37 °C, 5% CO₂ ) pendant 30 minutes. Ensuite, les échafaudages ont été incubés dans du DMEM pendant 21 jours avec un réapprovisionnement régulier du milieu tous les deux jours.

Test d'adhérence cellulaire

Pour évaluer la capacité d'adhésion des cellules avec l'échafaudage, le nombre de cellules non adhérées a été compté après 1, 3 et 6 h d'ensemencement initial selon la méthode de la littérature avec de légères modifications [6]. Le milieu cellulaire a été collecté et la numération cellulaire a été effectuée avec un hémocytomètre. La différence entre le nombre d'ensemencements initial et le nombre de cellules non adhérentes a été considérée comme le nombre de cellules adhérentes. Les résultats ont été exprimés en pourcentage d'adhérence selon l'équation suivante :

Test de cytotoxicité

Pour mesurer l'effet toxique des matrices nanofibreuses, un test MTT a été réalisé. Après le délai respectif, les constructions ont été incubées dans une solution de MTT (1 mg mL ^-1 solution mère diluée dans du PBS (pH 7,4) dans un rapport de 1:10) et incubée pendant 4 h. Les cellules viables convertissent le MTT en sel de formazan pendant cette période d'incubation. Le sel de formazan a été dissous par l'ajout de DMSO et maintenu de côté pendant 20 min. L'absorbance provenant du sel de formazan a été mesurée quantitativement en enregistrant les changements d'absorbance à 570 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.

Test de prolifération cellulaire

Un essai de réduction de colorant bleu Alamar (AB) a été effectué pour déterminer la prolifération des cellules dans l'échafaudage. Les échafaudages ont été incubés dans un colorant dilué avec du DMEM pendant 4 h, et la réduction du colorant a été mesurée par spectrophotométrie. Le pourcentage de réduction AB a été calculé comme suit :

où, ελ ₁ =coefficient d'extinction molaire du bleu alamar à 570 nm et ελ ₂ =le coefficient d'extinction molaire du bleu d'alamar à 600 nm, dans l'oxyde (ε _bœuf ) et réduit (ε _rouge ) formes. Aλ ₁ et Aλ ₂ dénotait l'absorbance des puits d'essai.

A'λ ₁ =absorbance du puits de contrôle négatif à 570 nm.

A'λ ₂ =absorbance du puits de contrôle négatif à 600 nm.

Test ALP

La production de phosphatase alcaline (ALP) par des hMSC cultivées dans l'échafaudage a été mesurée selon le protocole du fabricant dans le kit [12]. En bref, du PBS stérile (pH 7,4) a été utilisé pour le lavage et l'incubation des échafaudages, suivi d'une homogénéisation avec 1 ml de tampon Tris (1 M, pH 8,0) et d'une sonication pendant 3 min sur de la glace. 25 L du lysat ont ensuite été incubés avec 1 mL de solution de phosphate de p-nitrophényle (16 mM) à 30°C pendant 5 min. Des mesures spectrophotométriques ont été effectuées à 405 nm pour surveiller la production de p-nitrophénol en présence d'ALP.

Activité ALP in vivo

Neuf rats nus athymiques mâles, pesant entre 100 et 120 g chacun, ont été prélevés et disséqués bilatéralement au niveau des muscles abdominaux pour créer des poches. Un modèle de souris nude a été utilisé pour démontrer le potentiel ostéoinducteur de l'échafaudage in vivo. Un des trois types d'échafaudages (5 mm × 5 mm) a été découpé et emballé séparément dans les poches musculaires. La poche a ensuite été fermée avec un fil de suture non résorbable. Après 14 jours d'opération, les implants ont été récupérés en excisant les muscles abdominaux droits et ont été conservés dans du PBS. Des lambeaux musculaires ont été excisés et un tissu d'explant est obtenu qui a été homogénéisé dans un tampon d'extraction pour libérer la phosphatase alcaline. 50 L d'aliquote de solution ont été utilisés pour la mesure de l'activité ALP.

Analyse statistique

Toutes les expériences ont été réalisées en triple et les données présentées sont formatées en moyenne ± écart type (SD) des échantillons, sauf mention contraire. Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été réalisée à l'aide du logiciel statistique Origin 6.0, pour évaluer les différences incertaines et les différences significatives. P une valeur de 0,05 ou moins signifie des différences significatives entre les groupes d'étude.

Résultats

Morphologie de l'échafaudage

Les images SEM (Fig. 1) de l'échafaudage fabriqué ont révélé une structure nanofibreuse finement filée. Les diamètres moyens des fibres dans les échafaudages SF et SF+BMP2 semblent être similaires, allant de 100 à 900 nm, à toutes les concentrations, car le diamètre s'avère être une fonction du temps pendant lequel l'électrofilage a été effectué [13], tandis que SF les nanofibres se sont avérées uniformes et la conjugaison BMP2 a conduit à une non-uniformité du diamètre des fibres. La taille des pores des échafaudages semble être homogène dans les échafaudages fabriqués et s'avère indépendante de la concentration de fibroïne. La concentration de SF n'affecte pas la taille des pores de manière significative [11].

Micrographies SEM d'échafaudages préparés. un SF. b SF+rhBMP2. c 4SF+rhBMP2

Propriétés mécaniques de l'échafaudage

Les courbes contrainte-déformation des échafaudages nanofibreux sont représentées sur la figure 2. Il a été observé que l'ajout de BMP n'altère pas les propriétés mécaniques de l'échafaudage SF, mais avec l'augmentation de la concentration de matériau de fabrication (SF), la propriété de traction des matrices a été améliorée . Elle peut être due à la formation de liaisons inter-fibres lors de la réticulation. Les fibres SF à faible concentration n'ont donc pas présenté une meilleure résistance mécanique par rapport à une plus élevée.

Relation contrainte-déformation des nanofibres électrofilées. La relation contrainte-déformation a été comparée entre (a) SF, (b) SF+rhBMP2 et (c) 4SF+rhBMP2 échafaudage

Étude de gonflement

Les rapports de gonflement en fonction du temps pour les échafaudages ont été représentés sur la figure 3. Les échafaudages ont bien gonflé avec le temps de manière uniforme au départ et ont atteint l'équilibre en environ 380 min. Les fibres liées à la rhBMP2 ont absorbé plus d'eau que les échafaudages à base de SF uniquement, ce qui suggère l'augmentation des poches hydrophiles en raison de l'association BMP2. Les fibres SF étaient équilibrées à ∼  70 % tandis que les fibres contenant du BMP2 étaient équilibrées à ∼  81 % d'eau.

Propriété de gonflement de l'échafaudage fabriqué. Des changements dans la propriété de gonflement de l'échafaudage SF ont été observés après la modification avec SF+rhBMP2 et 4SF+rhBMP2

Test d'adhérence cellulaire

L'adhésion des cellules à l'échafaudage est requise pour la croissance des cellules et l'induction pour la différenciation. Dans cette étude, nous avons observé que les hMSC adhéraient bien aux échafaudages et que l'adhérence des hMSC aux échafaudages 4SF-BMP2, SF-BMP2 et SF était représentée sur la figure 4.

Histogramme représentant le pourcentage d'adhérence en fonction du temps pour trois points dans le temps. Modifications du niveau d'adhérence dans (a) SF, (b) SF+rhBMP2 et (c) échafaudage 4SF+rhBMP2

Il y avait un problème de perte d'adhérence dans l'échafaudage mélangé qui a été exclu avec les résultats observés. Le mélange avec BMP2 ne diminue pas la capacité d'adhérence de l'échafaudage. Comme le montre la figure 3, il était bien compris qu'avec une augmentation de la taille des pores (diminution de la concentration de SF), l'adhérence de la cellule à l'échafaudage augmente. L'ANOVA entre les trois formulations différencie significativement les variations à la 3ème et 6ème heure. Cependant, aucune différence significative n'a été observée au cours de la 1ère heure.

Test de cytotoxicité et test de prolifération cellulaire

La viabilité cellulaire a été significativement augmentée dans les échafaudages conjugués à rhBMP2, et les échafaudages construits ne créent aucun effet cytotoxique sur les cellules invitées concernées (Fig. 4), et les cellules ont bien proliféré dans tous les échafaudages comparativement à la Fig. 5. Il y avait un tendance à la hausse de la viabilité avec le nombre de jours, et l'échafaudage SF+BMP2 présentait la moindre toxicité à chaque instant. L'ANOVA a révélé une différence significative entre les valeurs de viabilité cellulaire des trois formulations concernées.

Test de viabilité cellulaire représenté sous forme d'histogramme pour quatre points dans le temps. Le test de viabilité cellulaire a été réalisé par test MTT, et les résultats sont présentés en pourcentage par rapport au contrôle

A partir de la figure 6, la prolifération cellulaire peut être examinée. Les cellules ont bien proliféré dans les trois préparations d'échafaudage avec le meilleur dans SF + BMP2 à chaque instant. Des pores plus grands dans l'échafaudage SF + BMP2 offraient un espace maximal pour la croissance des cellules. L'importance des différences entre les groupes a été bien établie à partir de l'ANOVA.

Représentation de la prolifération cellulaire en pourcentage de réduction du colorant bleu alamar à quatre points dans le temps pour SF, SF+BMP2 et 4SF+BMP2

Test ALP

L'activité ALP est un marqueur standard de la propriété ostéoinductive de l'environnement autour de la cellule [13]. Dans notre expérience, nous avons observé une activité ALP plus élevée dans les constructions SF + BMP2 par rapport aux constructions uniquement SF (Fig. 7). Les échafaudages nanostructurés SF ont également pu présenter une ostéoinduction seule, mais comme le montrent la figure 7 et l'ANOVA, l'échafaudage SF + BMP2 s'est avéré être le meilleur parmi les échafaudages concernés. La concentration d'ALP a augmenté au fil du temps de l'expérience, et les constructions avec une concentration de SF plus élevée, cependant, présentaient une activité ALP inférieure par rapport aux constructions avec une concentration de SF plus faible.

Représentation de l'activité ALP parmi trois stratégies de fabrication d'échafaudages différentes à différents moments. (a) SF (b) SF+rhBMP2 (c) 4SF+rhBMP2 échafaudage

Activité ALP in vivo

La figure 8 représente l'activité ALP d'explants pour (a) SF, (b) SF+rhBMP2 et (c) 4SF+rhBMP2. Comme prévu, les explants du traitement contenant rhBMP2 ont induit une activité ALP plus élevée tandis que les souris traitées avec un échafaudage sans rhBMP2 ont produit une activité ALP plus faible.

Activité ALP in vivo des explants obtenus après traitement. Un modèle de souris nue a été utilisé pour démontrer le potentiel ostéoinducteur de l'échafaudage in vivo

Discussions

L'ingénierie tissulaire basée sur un échafaudage a prouvé son potentiel en médecine régénérative et a connu des progrès impressionnants en tant qu'outil pour la BTE. Des études antérieures ont établi le rôle crucial de la microarchitecture et des propriétés physiques des structures dans la traduction des constructions d'échafaudage cellulaire in vitro dans le tissu osseux [14,15,16].

Les propriétés mécaniques optimales (taille des pores, résistance à la traction, etc.) et la biocompatibilité des constructions sont des caractéristiques potentielles à considérer pour la colonisation et l'organisation des cellules [17]. Le travail présenté décrit la fabrication et la caractérisation de l'échafaudage pour l'ingénierie des tissus osseux en utilisant la combinaison des propriétés bénéfiques des matériaux proposés pour le même. Alors que la SF fournit une plate-forme suffisamment solide et biocompatible, la rhBMP2 intégrée induit la formation de nouveaux ostéocytes. La SF est largement étudiée par plusieurs groupes dans différentes formulations pour la prolifération cellulaire ostéoblastique [18] et la régénération tissulaire, notamment ligament, tendon, cartilage, os, foie, peau, trachée, cornée, nerf, tympan et vessie [19, 20].

Nous avons utilisé des solutions aqueuses de SF et SF + rBMP2 pour notre étude car les solutions aqueuses sont préférées aux solvants organiques pour la préparation de solutions de SF car la dégradation de SF est défavorable dans les solutions organiques [18]. Les fibres électrofilées SF ont déjà été signalées comme ayant une structure homogène de fibres de diamètre uniforme, et le maillage est très poreux avec des pores interconnectés et interconnectés, ce qui est également en accord avec notre étude [21, 22]. Il n'y avait aucune observation de formation de structures en forme de billes dans les fibres SF dans nos échafaudages et ceux précédemment rapportés [21]. Le diamètre de la fibre SF pure diminuait auparavant avec l'augmentation du mélange [11, 21] ; cependant, nous n'avons pas observé de perte de diamètre due au mélange. Mais l'uniformité de la fibre a été perturbée dans les fibres mélangées, probablement en raison d'une association inégale de rBMP2 sur les fibres SF.

Une résistance mécanique suffisante est une propriété essentielle pour un échafaudage en tissu. Le mélange de SF pur a augmenté la flexibilité de la nanofibre dans notre expérience, et les rapports précédents ont également révélé une tendance similaire à l'amélioration des propriétés mécaniques lors du mélange de SF avec d'autres matériaux pour produire des biomatériaux mélangés employables [21, 23]. Ainsi, notre échafaudage fabriqué possède une résistance mécanique et une flexibilité essentielles qui sont requises dans les applications d'ingénierie tissulaire.

Les échafaudages pour l'ingénierie tissulaire devraient être capables de fixer des cellules dessus, devraient faciliter la prolifération cellulaire et l'ostéoinduction et devraient être moins cytotoxiques pour une meilleure acceptabilité. Des rapports antérieurs sur les échafaudages SF ont établi ses activités non cytotoxiques et prolifératives cellulaires [21, 24], et nos études étaient en accord étroit avec les résultats précédemment rapportés.

En raison de ses propriétés ostéoinductives, la rhBMP2 est utilisée dans l'ingénierie tissulaire osseuse par plusieurs groupes [25,26,27]. Ces études ont révélé que les cellules cultivées sur des échafaudages contenant BMP2 possédaient une activité ALP plus élevée, un biomarqueur de l'ostéoinduction. L'effet de l'association BMP2 était mieux contrasté à mesure que le temps d'incubation progressait. Kim et al. ont utilisé des microsphères poreuses associées à la BMP2 et observé une amélioration similaire de l'ostéoinduction [25].

Conclusions

Nous avons fabriqué avec succès des échafaudages fibreux à base de SF contenant rhBMP2. Ces échafaudages étaient homogènes et se sont avérés avoir des propriétés mécaniques et une biocompatibilité adéquates. Une autre association rhBMP2 attribuée au potentiel ostéoinducteur des échafaudages fabriqués. Les échafaudages ont été évalués plus avant pour des applications in vivo et se sont avérés adaptés à des applications impliquant l'ingénierie des tissus osseux.

Abréviations

ALP :

Phosphatase alcaline

BTE :

Ingénierie tissulaire osseuse

hMSC :

Cellules souches mésenchymateuses humaines

rhBMP2 :

Protéine morphogénique osseuse humaine recombinante-2

SF :

Fibroine de soie