Fabrication industrielle
Internet des objets industriel | Matériaux industriels | Entretien et réparation d'équipement | Programmation industrielle |
home  MfgRobots >> Fabrication industrielle >  >> Industrial materials >> Nanomatériaux

Nanoparticules chargées de médicaments en polysorbate 80-émulsifié à visée cérébrale pour la neuroprotection

Résumé

La plupart des médicaments contre la maladie d'Alzheimer n'agissent pas efficacement à cause de la barrière hémato-encéphalique. Par conséquent, nous avons conçu une nouvelle nanopréparation (PS-DZP-CHP) :une nanoparticule de pullulane modifiée par le cholestérol (CHP) avec une couverture de surface en polysorbate 80 (PS), en tant que transporteur de donépézil (DZP) pour réaliser la livraison de tissu cérébral. Par analyse de taille et calorimétrie de titrage isotherme, nous avons choisi le rapport de dosage optimal du médicament avec des nanomatériaux (1:5) et conçu une série d'expériences pour vérifier l'efficacité des nanoparticules. Les résultats des expériences de libération in vitro ont montré que les nanoparticules peuvent obtenir une libération continue du médicament en 72 h. Les résultats de l'observation de fluorescence chez la souris ont montré un bon ciblage cérébral des nanoparticules PS-DZP-CHP. De plus, la nanoparticule peut augmenter la concentration du médicament dans le tissu cérébral chez la souris. Des nanoparticules de DZP-CHP ont été utilisées pour prétraiter les cellules nerveuses avec des dommages à la protéine Aβ. La concentration de lactate déshydrogénase a été déterminée par coloration au MTT, à la rhodamine 123 et à l'AO-EB, ce qui a prouvé que les nanoparticules de DZP-CHP avaient un effet protecteur sur la neurotoxicité induite par Aβ25–35 et étaient supérieurs au donépézil gratuit. Un test de mesure de mouvement perpétuel microthermique a montré que les nanoparticules PS-DZP-CHP ont une affinité avec l'apolipoprotéine E, ce qui peut être vital pour cette nanoparticule ciblant le tissu cérébral.

Introduction

La MA est une maladie du système nerveux central avec des mécanismes pathologiques compliqués qui provoque un dysfonctionnement cognitif progressif, mais elle est très difficile à traiter en raison de la difficulté d'administration du médicament et de la faible concentration de médicament pouvant atteindre les tissus cérébraux [1, 2]. Le passage de la BHE est devenu une difficulté majeure dans la recherche sur les systèmes d'administration de médicaments (DDS) [3, 4]. La plupart des médicaments ouvrent la BHE par des moyens biologiques, chimiques ou physiques ; parmi elles, les méthodes physiques sont aujourd'hui les plus utilisées en clinique [5]. En raison des défauts insurmontables de l'administration intracrânienne de médicaments basés sur une technologie invasive, la production de promédicaments lipophiles ou de substrats de transport actif par modification chimique de la surface du médicament présente plus d'avantages [6]. Parmi elles, les nanoparticules sont l'un des meilleurs choix pour réaliser l'administration intracrânienne de médicaments en ciblant activement la BHE [7,8,9].

Les nano-DDS sont devenues le centre de la recherche sur le cerveau et comprennent des nanoparticules polymères, des nanoparticules organiques, des liposomes, des nanofibres et des micelles qui ont été conçues pour fournir des traitements et des diagnostics [6, 10, 11, 12]. Les nanoparticules chargées de médicaments et les médicaments lipophiles à petites molécules peuvent traverser la BHE. La différence est que les nanoparticules chargées de médicament sont plus susceptibles de passer par la diffusion passive par adsorption sur la paroi capillaire dans le cerveau. De plus, les médicaments libres sont confrontés à une deuxième barrière, la barrière hémato-encéphalique (B-CSF) [13]. Contrairement à d'autres homologues de la barrière, la plupart des médicaments sont relativement perméables à travers le LCR et diffusent dans le parenchyme cérébral. Cependant, en raison du processus de diffusion très lent, la concentration de médicaments libres dans le LCR est beaucoup plus élevée que celle dans le parenchyme cérébral, et la concentration élevée dans le LCR entraînera une certaine toxicité [14, 15]. Dans ce processus, les nanoparticules présentent des avantages uniques et significatifs. Si la surface du nanosupport est recouverte d'un tensioactif hydrophile, l'ApoE s'adsorbera à la surface et le LCR peut favoriser le mouvement des nanoparticules vers le parenchyme cérébral à travers l'espace autour des vaisseaux sanguins [16]. Des nanoparticules enrobées du tensioactif non ionique polysorbate 80 préparé par Kreuter et al. [17] ont été les premiers médicaments délivrés avec succès au système cérébral et transportés via l'adsorption de la protéine sérique ApoE dans le plasma. Par conséquent, la modification du polysorbate 80 à la surface des nanoparticules pour former un composite spécifique au médicament permet le ciblage de la reconnaissance du médicament et du récepteur BBB endogène, augmentant considérablement la biodisponibilité des médicaments [18,19,20].

À l'heure actuelle, le donépézil (DZP) inhibiteur de l'acétylcholinestérase (AChE) est couramment utilisé pour le traitement de la MA modérée, mais en raison de sa solubilité dans les graisses, une mauvaise dissolution in vivo , et une faible biodisponibilité orale, les comprimés de donépézil conventionnels doivent être pris quotidiennement pour maintenir l'effet thérapeutique [21, 22]. Étant donné que la capacité cognitive des patients atteints de MA est gravement altérée, ce qui entraîne de grands inconvénients pour le maintien d'un programme de traitement, le développement d'une préparation de DZP à libération prolongée à action prolongée est urgent. L'hypothèse de la cascade amyloïde suggère que la cause de la MA est le dépôt de plaques amyloïdes autour du parenchyme cérébral et des parois cérébrovasculaires. Un grand nombre de taches diffuses sont également observées dans les zones cérébrales, qui sont composées de dépôts extracellulaires d'Aβ amorphes, hautement fibreux et insolubles [23, 24]. Boridy et al. ont découvert que les nanoparticules de polysaccharide pullulane qui sont non toxiques et facilement dégradables peuvent former un complexe avec la protéine Aβ et empêcher efficacement l'agrégation des protéines et peuvent être rapidement éliminées des cellules pour inhiber la toxicité cellulaire [25]. Le pullulane modifié de manière hydrophobe (CHP) est une substance amphiphile qui peut s'auto-assembler en une nanostructure avec un noyau hydrophobe et une enveloppe hydrophile à chaîne glucidique dans une solution aqueuse [26, 27]. Dans le même temps, les nanoparticules de cogénération peuvent adsorber la protéine Aβ pour empêcher son dépôt et son agrégation, jouant un rôle synergique. En tant que nanosupport, la cogénération a une supériorité significative.

Sur la base des connaissances ci-dessus, l'équipe de recherche a conçu une nanopréparation DZP-CHP à un stade précoce et a déterminé le rapport de dosage optimal du médicament au nanosupport. Ensuite, le polysorbate a été adsorbé à la surface des nanoparticules pour cibler activement le passage à travers la BHE afin d'enrichir le cerveau. Dans cette étude, une série de nanosolutions DZP-CHP ont été caractérisées et le processus de libération du médicament in vitro a été exploré et étudié. Une fois les nanoparticules préparées avec succès, Aβ25-35 a été utilisé pour induire des dommages aux cellules nerveuses afin d'établir un modèle de cellule AD [28, 29]. Ensuite, l'effet protecteur de la nanosolution DZP-CHP a été étudié dans des modèles cellulaires PC12 et SH-SY5Y.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Les éléments suivants ont été utilisés :pullulane modifié hydrophobe-cholestérol (fait maison) [30]; donépézil (Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.); polysorbate 80 (Institut des réactifs de Tianjin Fuchen); colorant vert d'indocyanine (ICG) (Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.); polysorbate 80 (Tween 80, PS) (Tianjin Fuchen Reagent Office); souris noires (Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd.); Aβ25-35 (US Sigma); sel de tétraméthylazozole (MTT) (US Sigma); sérum bovin nouveau-né (U.S. Gibco); kit de lactate déshydrogénase (LDH) (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.); Kit de fluorescence à double coloration AO/EB (Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); et des cellules PC12 (cellules de phéochromocytome surrénalien de rat) obtenues auprès du Département de neurologie, Second Xiangya Hospital, Central South University. Les cellules SH-SY5Y (cellules de neuroblastome de la moelle osseuse humaine) ont été achetées auprès de l'ATCC Cell Bank (Manassas, VA, États-Unis).

Préparation de nanoparticules

Trois types de nanoparticules avec différents rapports DZP et CHP (w/w) (10:20, 4:20 et 2:20) ont d'abord été préparés avec succès par dialyse à l'eau selon les méthodes rapportées dans la littérature [31]. Une certaine concentration de nanoparticules de DZP-CHP a été ajoutée dans un bécher avec un volume constant de 10 mL puis aspirée dans un autre bécher contenant un émulsifiant polysorbate 80 (PS) (concentration 0,7 mmol) pour décanter pendant 1 h. Le mélange a ensuite été placé dans un tube EP et soniqué pendant 3 min (puissance de sortie 100 W, mode de fonctionnement par impulsions intermittentes :largeur d'impulsion 2,0 s, temps d'intermittence 2,0 s). L'opération a été répétée trois fois jusqu'à l'obtention d'une dispersion uniforme [32]. Des nanoparticules de donépézil émulsifié polysorbate 80 (PS-DZP-CHP) ont finalement été obtenues après élimination des impuretés par filtration.

Caractérisation des nanoparticules

Morphologie des nanoparticules

La forme, la morphologie de surface et la taille des nanoparticules DZP-CHP (DCP) avec des rapports DZP à CHP de 1:2, 1:5 et 1:10 ont été analysées avec un microscope électronique à transmission Tecnai F20. Une goutte de nanoparticules CHP, DZP-CHP et PS-DZP-CHP a été placée sur une maille de cuivre recouverte de carbone pour former un mince film liquide. Ensuite, une solution d'acide phosphotungstique à 2 % (p/v) a été utilisée pour obtenir une coloration négative de l'échantillon après séchage naturel du film. La solution aqueuse de nanoparticules fraîchement préparée a été ajoutée goutte à goutte à une plaquette de silicium propre, séchée à température ambiante, puis placée sous un microscope électronique à balayage à émission de champ JSM-6700F pour observer la structure de la surface.

Taille des nanoparticules et potentiel Zeta

La taille, le coefficient de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta des nanoparticules DZP-CHP et PS-DZP-CHP ont été analysés à l'aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). La taille moyenne des particules et la distribution granulométrique de la suspension homogène obtenue ont été mesurées trois fois chacune.

Libération de médicament in vitro

La libération de donépézil a été mesurée par dialyse dynamique à l'eau. Un milligramme de nanoparticules de DZP-CHP et PS-DZP-CHP a été dissous dans 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4, concentration 0,01 M) puis transféré dans un sac de dialyse, qui a été maintenu dans la même solution à une température ambiante. température constante de 37 °C sous agitation magnétique. Quatre millilitres de PBS à 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 et 72 h ont été dilués avec le même volume de PBS au même pH. La spectrophotométrie ultraviolet-visible a été utilisée pour détecter l'absorbance du dialysat à 312 nm à différents moments ; le contenu de la solution a été déterminé avec une courbe étalon, et le test de libération a été répété trois fois in vitro. Le pourcentage de libération du donépézil a été calculé selon la formule suivante :

$$Q\% ={{(C{\text{n}} \times V + V{\text{n}}\sum\nolimits_{{{\text{t}} ={0}}}^{ {\text{n}}} {{\text{Ci}}} )} \mathord{\left/ {\vphantom {{(C{\text{n}} \times V + V{\text{n} }\sum\nolimits_{{{\text{t}} ={0}}}^{{\text{n}}} {{\text{Ci}}} )} {(WNP \times LC\% } }} \right. \kern-\nulldelimiterspace} {(WNP \times LC\% }})$$

Cn est la concentration de l'échantillon à l'instant Tn, g/mL ; V est le volume total de la solution de libération de PBS, en mL ; Vn est le volume de liquide de libération de PBS à l'instant Ti, en mL ; et Ci est la concentration de donépézil à l'instant Ti, g/mL.

Calorimétrie à titrage isotherme (ITC)

Une certaine concentration de solution de PS a été versée goutte à goutte sur des solutions de nanoparticules de cogénération et les changements de chaleur ont été mesurés avec l'ITC (vip-itc, Microcal, Northampton, MA, USA). La solution de nanoparticules de cogénération comprenait trois types de nanoparticules avec différents rapports DZP/CHP (1:2, 1:5 et 1:10). Toutes les solutions ont été dégazées avant titrage. La température de l'ensemble du système a été maintenue constante à 25 °C.

Expériences animales pour observer le ciblage cérébral

Préparation de nanoparticules de Donepezil CHP étiquetées ICG

Quatre cents milligrammes de CHP-DZP et 20 mg d'ICG ont été pesés à l'aide d'une balance analytique, et une quantité appropriée de DMSO a été ajoutée pour mélanger et dissoudre soigneusement. Ensuite, la solution obtenue ci-dessus a été ajoutée goutte à goutte dans le sac de dialyse avec une pipette, et l'eau distillée a été remplacée une fois toutes les heures. Trois heures plus tard, l'eau distillée a été remplacée toutes les 2 heures et 400 à 800 ml d'eau distillée ont été ajoutés à chaque fois pendant 48 heures jusqu'à ce que le DMSO soit complètement dialysé. Après cela, la solution ci-dessus a été transférée avec une pipette dans une fiole jaugée pour obtenir un volume constant, puis traitée avec une onde ultrasonore pendant 2 min. La filtration à travers une membrane filtrante de 0,45 μm a donné des nanoparticules de DZP-CHP marquées par ICG (ICG-DZP-CHP), qui ont été emballées séparément et conservées au réfrigérateur à 4 °C pour une utilisation future.

Préparation de nanoparticules fluorescentes émulsifiées de Donepezil CHP

Une quantité appropriée d'ICG-DZP-CHP a été placée dans un bécher de 10 ml, et 1 (v/v) d'émulsifiant polysorbate 80 (PS) a été ajouté. Le bécher a été conservé pendant 1 h puis transféré dans un tube EP pour ultrasonication pendant 2 min à 100 W. L'opération ci-dessus a été répétée trois fois jusqu'à obtention d'une nanosolution uniforme. Enfin, des nanoparticules de donépézil émulsifié filtrées et marquées par ICG ont été obtenues (PS-ICG-DZP-CHP).

Expériences MST pour vérifier la liaison de l'APOE aux nanoparticules

Toutes les expériences MST ont été réalisées sur un système Monolith NT.115 (201810-BR-N024). Toutes les solutions ont été préparées avec de l'eau déminéralisée et des réactifs de qualité analytique. Les tampons ont été préparés et conservés à température ambiante. Les échantillons de protéines ont été conservés sur de la glace jusqu'à leur utilisation [33]. Les nanoparticules PS-ICG-CHP (55,6 μM) ont été diluées à 40 nM avec de l'eau déminéralisée, et l'ICG a été chargé pour la fluorescence. Une solution d'APOE (30 μl, 55,6 μM) a été préparée et 16 tubes capillaires ont été étiquetés de 1 à 16 ; d'abord, 20 μl d'APOE ont été ajoutés au tube 1, et 10 μl ont été ajoutés aux tubes 2 à 16. Ensuite, 10 L de solution ont été transférés du tube 1 au tube 2 et mélangés soigneusement. Après cela, 10 l de solution ont été retirés du tube 2 et transférés dans le tube 3. Cette opération a été répétée jusqu'à ce que 10 l de solution soient finalement retirés du tube 16 pour s'assurer que la solution dans chaque tube était du même volume. Dix microlitres de nanoparticules diluées ont été ajoutés à chaque tube et soigneusement mélangés pour démarrer la mesure. Les données du test MST ont été analysées avec le logiciel d'analyse NT et l'ajustement KD a été effectué conformément à la loi de l'action de masse en suivant les instructions du logiciel.

Technologie d'imagerie par fluorescence in vivo pour l'observation du ciblage cérébral

Un lot de souris noires en bonne santé pesant environ 18 à 22 g chacune a été choisi et divisé au hasard en 2 groupes :le groupe PS-ICG-DZP-CHP et le groupe ICG-DZP-CHP. Chaque souris a reçu une injection de 200 μl de 200 μg/ml des médicaments du groupe ci-dessus via la veine caudale, et 0,5 h plus tard, les souris ont été anesthésiées avec du pentobarbital sodique à 1 % (50 mg/kg). Après cela, toutes les souris ont été placées dans la zone de photographie de l'imageur en direct avec les paramètres d'imagerie définis sur une longueur d'onde d'excitation de 765 nm-815 nm et une longueur d'onde d'absorption de 815 nm-845 nm pour obtenir une image de fluorescence de l'animal entier . Après imagerie, toutes les souris ont été disséquées et les reins, le cœur, la rate, les poumons, le foie et le cerveau ont été prélevés pour obtenir des images de fluorescence. Les paramètres d'imagerie étaient cohérents avec ceux décrits ci-dessus.

Étude sur la distribution tissulaire de nanoparticules

Regroupement et échantillonnage de souris

Quarante-cinq souris C57BL/6 ont été réparties au hasard en 15 groupes :5 groupes ont reçu une injection de donépézil libre (groupe libre), 5 de nanoparticules de donépézil (nano-groupe) et 5 autres de nanoparticules de donépézil modifié par PS (groupe PS) à 0,25 mg/kg à travers la queue de la veine. Ensuite, le sang a été prélevé à 1 h, 3 h et 6 h après l'injection. Après cela, tous les animaux ont été sacrifiés et les tissus du cœur, du cerveau, du foie et des reins ont été collectés et déchiquetés. Ensuite, 0,2 g du tissu ci-dessus a été pesé avec précision et ajouté à environ 1 ml de solution de NaCl à 0,9 % et homogénéisé avec un homogénéisateur (65 Hz, 150 s). Cent microlitres d'homogénat de tissu ont été aspirés avec précision dans un tube EP de 1,5 mL avec 0,7 mL de méthanol, mélangés au vortex pendant 30 s pour la précipitation des protéines, puis centrifugés à 12 000 r·min −1 pendant 10 minutes. Enfin, 100 L de surnageant ont été transférés dans un flacon d'injection pour analyse.

Méthode de détermination

La HPLC a d'abord été utilisée pour l'examen, mais la sensibilité n'était pas suffisamment élevée. Par conséquent, des expériences de suivi LC-MS ont été réalisées, qui ont montré une forte spécificité et aucune substance endogène n'interférant avec la détermination du médicament. Le protocole LC-MS était conforme aux directives pour la détermination des échantillons biologiques. Les conditions chromatographiques étaient les suivantes :phase mobile A, eau (contenant 0,1 % d'acide formique); phase mobile B, méthanol (contenant 0,1% d'acide formique); élution isocratique :A30 %-B70 %; débit, 0,3 mL· min −1 ; température de la colonne, 35 °C ; volume d'injection, 10 L. Les conditions de collision étaient les suivantes :température de la source d'ionisation électrospray (ESI), 150 °C ; débit de gaz de désolation, 550 L·h −1 ; température du gaz de désolation, 500 °C. Les conditions de détection des ions positifs étaient les suivantes :tension capillaire, 3 kV ; tension de cône, 30 V ; mode de balayage, surveillance des réactions multiples (MRM).

Expériences cellulaires

Culture cellulaire et passage

Les cellules PC12 et SH-SY5Y ont été cultivées dans du DMEM riche en sucre additionné de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS) et de 1 % (v/v) de pénicilline et de streptomycine, puis conservées dans un incubateur contenant 5 % CO2 à 37 °C. Les cellules ont été utilisées dans diverses expériences ou repiquées dès qu'elles ont atteint 80 % de confluence. Avant les expériences, les cellules PC12 et SH-SY5Y ont été ensemencées sur des plaques pré-enduites de collagène de type I à la densité cellulaire requise selon l'échelle expérimentale.

Cryoconservation cellulaire

Lorsqu'on a observé leur croissance jusqu'à la phase log au microscope, les cellules PC12 et SH-SY5Y ont été congelées et lavées deux fois avec du PBS, trypsinisées pour former une suspension cellulaire et placées dans un tube à centrifuger stérile pour la collecte par centrifugation (1000 r × min − 1 , 3 minutes). Ensuite, une solution de cryoconservation des cellules a été ajoutée et les cellules ont été conservées dans un tube avec le nom et la date de la cellule marqués. Les cellules ont été placées dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 1 h, - 20 °C pendant 2 h, - 80 °C (congelées) pendant une nuit et finalement transférées dans un réservoir d'azote liquide.

Méthode MTT pour détecter le taux de survie cellulaire

La viabilité cellulaire a été mesurée en utilisant un test de réduction MTT. Brièvement, les cellules PC12 et SH-SY5Y ont été ensemencées dans des plaques 96 puits (pré-revêtues de collagène de type I) à une densité de 1 × 10 4 cellules/mL pour permettre aux cellules d'adhérer à chaque puits. Après incubation pendant 24 h, les cellules ont été préincubées avec différentes concentrations de nanosolution de donépézil CHP ou de solution de donépézil libre pendant 2 h. Par la suite, Aβ25-35 (concentration finale 20 μM) a été ajouté à chaque puits. La plaque 96 puits traitée a été incubée à 37 °C pendant 24 h. Après cela, du MTT (50 μL, 5 mg/mL) a été ajouté et incubé avec les cellules traitées à 37 °C pendant 4 h. Enfin, le milieu a été soigneusement retiré, et les cristaux de formazan ont été dissous dans 150 L de DMSO. L'absorbance a été obtenue à 490 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage de cellules vivantes dans le groupe traité et en pourcentage de cellules vivantes dans le groupe témoin non traité.

Détermination de l'activité LDH dans le surnageant cellulaire

Les cellules PC12 et SH-SY5Y ont été ensemencées dans des plaques de culture à 96 puits (prérevêtues de collagène de type I) à des densités de 2 × 10 5 et 3 × 10 5 cellules/mL, respectivement. Après incubation pendant 24 h, les cellules ont été préincubées avec différentes concentrations de nanosolution de donépézil CHP ou de solution de donépézil libre pendant 2 h. Par la suite, Aβ25-35 (concentration finale 20 μM) a été ajouté à chaque puits. L'activité LDH a été mesurée selon les instructions fournies par le kit. Brièvement, les cellules cultivées avec le milieu ont été recueillies puis centrifugées à 3 500 tr/min. Le surnageant (50 L) a été mélangé avec un volume égal de réactif pour initier la réaction LDH. L'absorbance a été obtenue à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques et l'activité LDH a été calculée.

Méthode de coloration AO/EB pour observer la morphologie de l'apoptose

Le colorant fluorescent AO/EB a été utilisé pour évaluer les caractéristiques des cellules apoptotiques. Les cellules PC12 et SH-SY5Y ont été ensemencées dans des plaques de culture noires à 12 puits (pré-revêtues de collagène de type I) à des densités de 3 × 10 5 et 4 × 10 5 cellules/puits, respectivement. Après incubation pendant 24 h, les cellules ont été préincubées avec différentes concentrations de nanosolution de donépézil CHP ou de solution de donépézil libre pendant 2 h. Par la suite, Aβ25-35 (concentration finale 20 μM) a été ajouté à chaque puits. Après le traitement, les opérations ont été effectuées selon le kit. La lumière a été évitée tout au long de l'expérience. Enfin, la morphologie cellulaire a été observée.

Méthode de coloration à la rhodamine 123 pour la détection du potentiel de la membrane mitochondriale

La MMP a été mesurée à l'aide d'un colorant fluorescent rhodamine 123 (Rh123), un colorant cationique perméable aux cellules qui est préférentiellement distribué dans les mitochondries en raison de ses propriétés hautement négatives. Les cellules PC12 et SH-SY5Y ont été ensemencées dans des plaques de culture noires à 24 puits (pré-revêtues de collagène de type I) à des densités de 2 × 10 5 et 3 × 10 5 cellules/puits, respectivement. Après incubation pendant 24 h, les cellules ont été préincubées avec différentes concentrations de nanosolution de donépézil CHP ou de solution de donépézil libre pendant 2 h. Par la suite, Aβ25-35 (concentration finale 20 μM) a été ajouté à chaque puits. Après le traitement, les cellules ont été lavées avec du PBS et incubées avec 10 ug/mL de rhodamine 123 pendant 30 min dans l'obscurité à 37 °C. Après incubation, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS et l'intensité de fluorescence a été mesurée à 488 nm et 510 nm à l'aide d'un lecteur de plaques à fluorescence.

Traitement statistique et analyse des données

Toutes les expériences ont été répétées trois fois, et les résultats sont exprimés en moyenne  ± déviation standard. Le logiciel statistique GraphPad Prism a été utilisé, et ANOVA unidirectionnelle, Student's t test et d'autres méthodes ont été utilisées pour l'analyse statistique. P < 0,05 indique qu'une différence est statistiquement significative.

Résultats

Caractéristiques des nanoparticules

La cogénération s'auto-agrège pour former des nanoparticules avec des noyaux hydrophobes, qui peuvent être chargés de DZP. Les nanoparticules de cogénération chargées en DZP (DCN) avec des rapports médicament/nanomatériau de 1:2, 1:5 et 1:10 ont été nommées DCN1, DCN2 et DCN3. Selon les résultats de la microscopie électronique à balayage, les nanoparticules de CHP ont montré une structure sphérique, et après chargement DZP, les DCN étaient également sphériques, comme le montre la figure 1. ± 0,27 mV, respectivement. Après chargement DZP, les tailles moyennes étaient de 273 ± 3,72, 260,7 ± 1,76 et 266,8 ± 4,56 nm, et les potentiels zêta étaient de -6,20 ± 0,40, − 5,75 ± 0,64 et -9,30 ± 0,39 mV pour DCN1, DCN2 et DCN3, respectivement , comme indiqué dans le tableau 1. Les pourcentages de piégeage du médicament étaient de 42,00 ± 5,65%, 86,54 ± 1,31 % et 59,71 ± 4,43%, et les pourcentages de charge médicamenteuse étaient de 12,02 ± 1,90%, 13,42 ± 2,03 % et 7,40 ± 1,72%, respectivement.

Images de microscopie électronique à balayage (a , a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3), distribution des tailles (b a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) et potentiel zêta (c a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) de nanoparticules

Mesure ITC

Pour les DCN, pendant tout le processus de réaction, la réaction a principalement montré un pic ascendant (Fig. 2), et la réaction était endothermique car le pic ascendant indique une réaction de libération de chaleur. Par conséquent, le PS peut être spontanément adsorbé sur la surface du DCN. L'affinité PS était de (14,7 ± 2,76) × 10 4 M −1 , (29,8 ± 1,66) × 10 4 M −1 et (36,7 ± 3,84) × 10 4 M −1 , et le degré de couverture PS était de 2,65 ± 0,193, 2,70 ± 0,372 et 1,49 ± 0,434 pour DCN1, DCN2 et DCN3, respectivement. Ce résultat indique que PS adsorbé à la surface du DCN avec une affinité élevée et avait une plus grande quantité de couverture sur DCN2. ∆H> 0 et ∆S> 0 indique que les trois particules étaient principalement liées par des interactions hydrophobes avec le PS.

Données de calorimétrie isotherme pour le titrage PS (0,9 mM) dans a DCN1, b DCN2 et c Solutions de DCN3 (0,02 mM) à 25 °C. Degré de couverture, affinité (KA) et changements d'enthalpie et d'entropie pour la liaison de PS avec des nanoparticules (NP) après titrage dans des solutions de NP

Caractérisation des trois types de nanoparticules

Les NP de CHP et les DCN préparés par dialyse ont montré une forme sphérique uniforme (Fig. 3a). Selon l'étude ci-dessus, nous avons choisi les nanoparticules DZP-CHP avec un rapport médicament sur nanomatériaux de 1:5 comme sujets de l'expérience suivante. Les nanoparticules de DZP-CHP avaient une taille de particule relativement uniforme de 260,7 ± 1,76 nm et l'indice de dispersion était de 0,196 ± 0,019. Bien que la taille des particules soit restée relativement stable après le chargement du médicament, elle a fortement augmenté jusqu'à 335,2 ± 5,46 nm après l'adsorption de PS. Le potentiel zêta des nanoparticules de DZP-CHP était de − 0,66 ± 0,04 mV, et après revêtement avec du polysorbate 80, le potentiel zêta est tombé à − 2,22 ± 0,86 mV (Fig. 3b).

Caractérisation de différentes nanoparticules. un a Photographie en microscopie électronique à transmission de NP de cogénération, b photographie de microscopie électronique à transmission de DZP-CHP NPs, c photographie en microscopie électronique à transmission de NP PS-DZP-CHP. B :Diagramme granulométrique et diagramme de potentiel zêta des NPs CHP-DZP (rapport d'alimentation 1:5) et des NPs DZP-CHP modifiés avec du polysorbate 80 (rapport d'alimentation 1:5)

Libération de médicaments in vitro de nanoparticules

Les résultats ont montré que par rapport au donépézil libre, les NPs DZP-CHP et PS-DZP-CHP libèrent du DZP pendant 72 h avec des effets de libération contrôlée évidents. Le taux de libération rapide précoce des nanoparticules chargées de médicament peut être dû à la dissolution et à la libération rapides des molécules de médicament, puis le ralentissement peut être causé par la diminution de la concentration du médicament, qui ne peut être affectée que par la dissolution et la diffusion. La libération de médicament in vitro de DZP-CHP NPs enrobées et non enrobées de polysorbate 80 a ensuite été étudiée. La libération plus lente des NP PS-DZP-CHP peut être due à une forte adsorption du polysorbate 80 sur de petits médicaments moléculaires hydrophobes (Fig. 4).

Courbes de libération de médicament in vitro pour les NPs DZP, DZP-CHP (1:5) et PS-DZP-CHP

Effet de ciblage cérébral par nanoparticules

Observation du ciblage cérébral à l'aide de la technologie d'imagerie par fluorescence en direct

Les cerveaux des souris injectées avec l'ICG libre n'ont montré aucune fluorescence, mais les cerveaux injectés avec des nanoparticules émulsifiées avec PS présentaient une fluorescence plus forte dans le cerveau que ceux injectés avec des nanoparticules non émulsifiées car les deux nanoparticules ont pu atteindre le cerveau après injection par la veine caudale (Fig. . 5a). Pour le vérifier, nous avons disséqué les souris 30 min après l'injection intraveineuse des solutions ICG-DZP-CHP et PS-ICG-DZP-CHP, retiré tous les organes nécessaires à l'étude, puis réalisé une imagerie par fluorescence. Les nanoparticules PS-ICG-DZP-CHP présentaient une forte fluorescence dans le cerveau, mais aucune n'a été observée dans d'autres organes (Fig. 5b). Les images ont montré que les nanoparticules modifiées avec PS présentaient la fluorescence la plus forte dans le tissu cérébral, tandis que celles non modifiées présentaient une fluorescence faible. Aucune fluorescence n'a été observée dans le tissu cérébral des souris injectées avec de l'ICG libre (Fig. 5c).

Images de fluorescence in vivo après injection de différentes solutions via la veine caudale. un Images de fluorescence d'animaux entiers injectés via la veine caudale avec 200 μg/ml de nanoparticules DZP-CHP ou PS-DZP-CHP chargées d'ICG comme colorant. une solution ICG gratuite (intensité de fluorescence × 10 9 ), b ICG-DZP-CHP nanoparticles (fluorescence intensity × 10 7 ), c ICG-DZP-CHP nanoparticles modified by PS (fluorescence intensity × 109). b Fluorescence images of various organs after injection of DZP-CHP nanoparticles modified by PS via the tail vein. c Fluorescence images of the brain after dissection. d Brain of mice injected with ICG-PS-DZP-CHP nanoparticles, e brain of mice injected with ICG-DZP-CHP nanoparticles modified with PS, f brain of mice injected with free ICG

Tissue Distribution of Nanoparticles in Mice

Donepezil was distributed in various tissues and mainly in the brain after injection of PS-DZP-CHP nanoparticles. Because it is metabolized through the kidney, the concentration of donepezil is very high in the kidney at certain times (Fig. 6a). In the brain, the concentration of free donepezil reached a peak in a very short time and then decreased rapidly. However, the concentration of donepezil nanoparticles reached a peak much more slowly and then decreased, especially nanoparticles modified with PS, which indicates a sustained-release effect with a delayed peak and prolonged retention time. Obviously, the nanoparticles improved the bioavailability of the drug (Fig. 6b).

a The concentration of donepezil in the brain, heart, liver and kidney at different times. b The concentrations of free DZP, DZP-CHP nanosolution and DZP-CHP nanosolution modified with PS in brain tissue at different times

MST Results

MST results showed that the thermal surge changed regularly with increasing ligand concentration, and the KD value was 3.63 μM, indicating that the ligand effectively binds to the target protein, which verifies that PS can bind to Apo E and is relatively stable. After surface modification with PS, CHP nanoparticles can promote adsorption of Apo E, theoretically confirming that the nanoparticles we designed can specifically target brain tissue because the nanoparticles adsorbed Apo E, which may mediate passage through the blood–brain barrier (Fig. 7).

a Raw MST data. The fluorescently labeled molecules were observed for 5 s. At this time, the infrared laser was turned on, and a small part of the capillary tube was heated to 2–5 °C. The molecules migrated along a thermal gradient, resulting in changes in fluorescence intensity. When the infrared laser is turned off, the molecules diffuse along the concentration gradient. b The binding curve is generated by the difference between the initial fluorescence intensity and the intensity in the presence of heat, and the curve conforms to the standard 1:1 binding model

Establishment of a Nerve Injury Model Induced by Aβ25–35

MTT tests were used to detect the effect of different concentrations of Aβ25-35 on the activity of PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 8a (i), Fig. 8b (i)], and the results showed that with increasing Aβ25–35 concentration, PC12 and SH-SY5Y cell proliferation activity gradually decreased compared with that in the normal control group. When PC12 and SH-SY5Y cells were treated with 20 μM Aβ25–35 , PC12 cell activity decreased to 49.5 ± 3.3% that observed in the control group (P  < 0.01), and SH-SY5Y cell activity decreased to 49.7 ± 0.8% (P  < 0.01). An LDH kit was used to detect the effect of different concentrations of Aβ25–35 on LDH activity in both cell supernatants. Colorimetric tests showed that activity in both supernatants increased gradually with increasing Aβ25–35 concentration. After treatment of the cells with 20 μM Aβ25–35 , PC12 cell LDH release increased to 359.3 ± 18.3% that in the control group (P  < 0.01), and SH-SY5Y cell LDH release increased to 360.0 ± 18.2% (P  < 0.01). Rhodamine 123 staining was used to detect the effect of different concentrations of Aβ25 35 on the mitochondrial membrane potential in both cell lines [Fig. 8a (ii), b (ii)]. The test showed that the mitochondrial membrane potential in both cell lines decreased gradually with increasing Aβ25 35 concentration (5, 10, 20, 40 μmol/L). Treatment of the cells with 20 μM Aβ25–35 decreased the PC12 cell mitochondrial membrane potential to 51.3 ± 1.6% that in the control group (P  < 0.01); for SH-SY5Y cells, the MMP decreased to 47.9 ± 1.7% that in the control group (P  < 0.01).

Effects of different concentrations of Aβ25–35 on injury to PC12 and SH-SY5Y cells. a , b The effect of different concentrations of Aβ25–35 on the cell survival rate, LDH activity and cell mitochondrial membrane potential in PC12 cells and SH-SY5Y cells (*P  < 0.05, ** P  < 0.01 vs control group). c The effect of different concentrations of Aβ25 35 on damage to the morphology of PC12 cells:a control group, b 25 35 (5 μM) injury group, c 25 35 (10 μM) injury group, d 25 35 (20 μM) injury group, e 25 35 (40 μM) injury group. D:the effect of different concentrations of Aβ25 35 on injury to the morphology of SH-SY5Y cells:f—control group, g 25 35 (5 μM) injury group, h—Aβ25 35 (10 μM) injury group, i—Aβ25 35 (20 μM) injury group, j—Aβ25 35 (40 μM) injury group

Inverted fluorescence microscopy was used to observe morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells injured by different concentrations of Aβ25 35 (Fig. 8c, d). The PC12 and SH-SY5Y cells in the control group had higher density, fusiform shapes, fuller cell bodies and longer protrusions. As the concentration of Aβ25 35 increased (5, 10, 20, 40 μmol/L), the number of cells in both cell lines gradually decreased, the cell bodies shrank slightly, and the protrusions began to shrink sharply. When the concentration of Aβ25 35 was increased to 40 μmol/L, the protrusions broke significantly, most of the cells contracted sharply, their shape became irregular, and some cells detached and became suspended in the solution.

Therefore, we treated PC12 and SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h to establish a nerve injury model.

Neuroprotective Effect of Drug-Loaded Nanoparticles (DZP-CHP)

MTT assays were used to detect the activity of different concentrations of DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) in PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 9a (i), b(i)]. Tests showed that treatment of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.4 ± 2.8% that in the control group (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) solutions, the viability of PC12 cells increased significantly. The viability of PC12 cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.05). Similarly, treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25 35 alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.5 ± 4.0% that in the control group (P  < 0.01), while after pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (2.5 μM, 5 μM, 10 μM, respectively), the viability of SH-SY5Y cells increased significantly. The viability of SH-SY5Y cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.05).

Effect of DZP-CHP on Aβ25-35-injured PC12 and SH-SY5Y cells. a and b The effects of DZP-CHP on the cell survival rate, LDH activity, and mitochondrial membrane potential of PC12 and SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35 (#P  < 0.05, ## P  < 0.01 vs Aβ25-35 group; ▲ P  < 0.05 vs DZP group). c The effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of PC12 cells injured by Aβ25-35; a—control group, b—Aβ25-35 injury group, c—DZP (5 µM), d—DZP -CHP (5 µM), e—DZP (10 µM), f—DZP-CHP (10 µM). D:the effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35; g—control group, h—Aβ25-35 injury group, i—DZP (5 µM), j—DZP-CHP (5 µM), k—DZP (10 µM), l—DZP-CHP (10 µM). E:red/green fluorescence ratio

LDH kits were used to detect the effects of different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) on the release of LDH from PC12 and SH-SY5Y cells into the culture medium [Fig. 9a (ii), b (ii)]. Colorimetric measurements showed that the release of LDH from PC12 cells that were exposed to 20 μM Aβ25-35 alone increased significantly by 355.1 ± 16.6% (P  < 0.01). In the presence of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from PC12 cells dropped significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.01). Similarly, the release of LDH from SH-SY5Y cells exposed to 20 μM Aβ25-35 increased significantly to 357.8 ± 12.5% (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from SH-SY5Y cells decreased significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.05).

According to previous reports, depolarization of the MMP leads to loss of Rh123 from mitochondria, which in turn leads to a decline in intracellular fluorescence. Therefore, to characterize changes in the mitochondrial membrane potential in PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35, DZP, and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), rhodamine 123 was used for detection [Fig. 9a (iii), b (iii)]. The results showed that the fluorescence intensity of rhodamine 123 decreased significantly to 44.3 ± 3.8% (P  < 0.01) after incubation of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM) solutions resulted in a significant increase in fluorescence intensity in a dose-dependent manner, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.05). Similarly, after treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h, the fluorescence intensity of rhodamine 123 significantly decreased to 42.5 ± 4.6% (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), the fluorescence intensity increased significantly, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group.

An AO-EB double staining kit was used to detect morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells treated with different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) (Fig. 9c, d). After AO-EB double staining, the nuclei of living cells presented green fluorescence under a fluorescence, and the fluorescence of apoptotic cells was orange-red; the higher the degree of apoptosis is, the brighter the fluorescence. Compared with the untreated control group, PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35 alone showed typical apoptotic characteristics, such as highly condensed and broken nuclei and obvious cell injury. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (5 μM and 10 μM) significantly inhibited cell damage and improved cell morphology.

Discussion

Although nanoparticles have been shown to be an effective delivery medium for nervous system diseases, the complexity of their structure and performance makes it challenging to detect and evaluate their physical–chemical properties and biological safety [34,35,36]. Therefore, after nanodrugs are designed, experiments to verify the safety and effectiveness of the nanomaterials at the cell and animal levels are extremely necessary. In the early laboratory stage, PS-DZP-CHP nanoparticles were successfully synthesized, and the optimal dosing ratio of the drug to CHP was set at 1:5. Due to the stable adsorption of PS to apolipoproteins ApoB and ApoE, brain targeting of nanoparticles can be achieved by permeation through the BBB [37]. The expected goal is that nanoparticles begin to decompose after reaching the brain; DZP is released and increases the concentration of cholinesterase; CHP reduces Aβ protein deposition and improves the brain environment; and administration frequency decreases because of the sustained release from nanoparticles [38,39,40,41].

Therefore, this study conducted an in vitro drug release test to assess the sustained release effect of nanoparticles. Compared with free DZP, nanoparticles achieved local sustained release in the brain, and PS can adsorb plasma proteins and reduce the loss of nanoparticles and prolong the release time to achieve a long cycle. After injection of ICG-labeled DZP-CHP and PS-DZP-CHP nanoparticles into rats, emulsified nanoparticles showed stronger fluorescence in the brain than those not emulsified with Tween 80. After organ biopsy, fluorescence imaging of various organs revealed that only the brain presented strong fluorescence, while other organs did not, indicating that nanoparticles did not release the drug until they reached the brain, which met the expected goal. In addition, nanoparticles modified with polysorbate 80 adsorbed ApoE to the surface and simulated low-density lipoprotein to bind to lipoprotein receptors on the surface of endothelial cells and enter the brain through LDLR induction [42, 43]. Moreover, the mechanisms by which nanoparticles regulate the tight junctions between endothelial cells and the inhibition of P-glycoprotein may produce a synergistic effect on their transcellular transport into the brain parenchyma [44]. However, since polysorbate 80 is prone to produce toxic substances, which cause untoward reactions, such as hypotension, dyspnea and shock, the dosage should be strictly controlled [45, 46]. Although a large number of nanodrugs have been developed for treatment of CNS diseases, most have shown poor effects [4]. In this study, we built a brain model of AD patients to evaluate the protective effect of nanoparticles on the brain. Because the toxicity of the Aβ protein to nerve cells varies with the concentration, it is better to screen an appropriate concentration to better simulate the brain environment of AD patients. The model was treated with DZP and DZP-CHP nanosolutions in advance to investigate the protective effect of DZP-CHP against PC12 and SH-SY5Y cell damage induced by Aβ25-35. The results showed that both solutions improved the cell proliferation activity caused by Aβ25-35, LDH release declined, and the mitochondrial potential rose. The inhibitory effect of the DZP-CHP nanosolution on cell damage induced by Aβ25-35 was significantly better than that of free DZP solution, and a concentration of 10 M DZP-CHP nanosolution proved to be the best, which may be due to the optimal drug concentration approach.

Basically, this study deduced the activity process of nanoparticles in vivo , verifying that PS-DZP-CHP nanoparticles have strong brain targeting, a good sustained release effect and a good AD therapeutic effect, thus demonstrating that they are clinically promising nanodrugs. The difficulty of treating the brain with medication has always been a major problem for researchers. The BBB leads to difficulty in curing CNS diseases, such as Parkinson's disease, brain tumors and brain stroke [47]. PS-DZP-CHP nanoparticles can effectively pass the BBB without destroying it, and DZP can be replaced as a model drug. Loading other drugs with high fat solubility and poor dissolution in vivo into the hydrophobic center of the NPs can not only increase brain targeting but also improve the water solubility of the drug. In addition, the design of CHP nanoparticle solutions is simple, and the drug dosage of the hydrophobic center can be flexibly controlled to ensure the best therapeutic effect while minimizing cytotoxicity [48, 49]. In future work, we will conduct in vivo research on DZP-CHP nanoparticles, such as evaluation of drug metabolism and side effects. These studies supplied a new strategy for brain drug delivery, and it is advantageous to clinical application of nanodrug with AD treatment.

Conclusion

DZP-CHP nanoparticles showed an optimal drug to nanomaterials dosing ratio of 1:5, which led to higher PS coverage and drug loading. DZP-CHP nanoparticles with PS adsorption exhibited slow release and significant brain targeting. Nanoparticle surface modification with PS can promote adsorption of Apo E and thus is vital for brain targeting. DZP-CHP nanoparticles had a protective effect on neurotoxicity and were superior to free donepezil.

Availability of Data and Materials

Not applicable.


Nanomatériaux

  1. Les scientifiques d'IBM sont les premiers à faire une démonstration de moteurs browniens à bascule pour les nanoparticules
  2. Nanoparticules d'or pour capteurs chimio
  3. Nanoparticules d'or multifonctionnelles pour des applications diagnostiques et thérapeutiques améliorées :une revue
  4. Nanoparticules pour le traitement du cancer :progrès actuels et défis
  5. Zebrafish :Un système modèle en temps réel prometteur pour l'administration de médicaments neurospécifiques par la nanotechnologie
  6. Nanoparticules chargées de médicaments en polysorbate 80-émulsifié à visée cérébrale pour la neuroprotection
  7. Nanofibres polymères électrofilées décorées de nanoparticules de métaux nobles pour la détection chimique
  8. Membranes composites contenant des nanoparticules d'échangeurs d'ions inorganiques pour le dessalement électrodialytique du glycérol
  9. Simulations informatiques pour les maladies neurodégénératives