L'axe MALAT1/miR-143/VEGFA entraîne l'endommagement endothélial menant à l'anévrisme intracrânien

Résumé

Les rôles de certains ARN non codants longs (lncARN) dans l'anévrisme intracrânien (AI) ont été étudiés dans de nombreuses études. Cette étude vise à élucider le mécanisme de l'axe de signalisation lncARN MALAT1 (transcrit 1 associé à l'adénocarcinome pulmonaire métastatique) / microARN-143 (miR-143) / facteur de croissance endothélial vasculaire-A (VEGFA) dans l'AI induit par lésion endothéliale vasculaire. L'expression de MALAT1, miR-143 et VEGFA dans les tissus d'AI et artériels normaux a été détectée. La métalloprotéinase matricielle 9 (MMP-9) dans les tissus, le facteur de von Willebrand (vWF) dans le sérum et les tissus, et l'endothéline-1 (ET-1) dans le sérum ont été dosés. Des rats modèles d'AI ont été injectés avec MALAT1 silencé ou surexprimé pour détecter la lésion endothéliale vasculaire. Des cellules endothéliales vasculaires de patients atteints d'AI ont été isolées et transféctées avec MALAT1 silencé ou surexprimé pour vérifier les impacts sur la viabilité et l'apoptose cellulaire. Les connexions entre MALAT1, miR-143 et VEGFA ont été vérifiées par prédiction en ligne, essai d'activité luciférase et essai de pull-down d'ARN. Une surexpression de MALAT1 et VEGFA et une sous-expression de miR-143 ont été trouvées dans les tissus d'AI. La régulation négative de MALAT1 a inhibé la pression artérielle, l'expression d'ET-1, vWF et MMP-9, ainsi que l'indice apoptotique des cellules endothéliales vasculaires de rats avec AI. MALAT1 régulé négativement a inhibé l'apoptose et favorisé la viabilité des cellules endothéliales vasculaires dans l'AI. MALAT1 se lie à miR-143 et miR-143 cible VEGFA. Cette étude suggère que MALAT1 élève l'expression de VEGFA par liaison compétitive à miR-143, augmentant ainsi l'apoptose et atténuant la viabilité des cellules endothéliales vasculaires dans l'AI.

Introduction

L'anévrisme intracrânien (AI), aussi appelé anévrisme cérébral, est causé par l'augmentation de la pression intracrânienne induite par l'élargissement local anormal de la cavité de l'artère cérébrale ou de la paroi artérielle. L'AI est une maladie grave à haute mortalité et morbidité, avec une prévalence d'environ 1-3 % dans la population générale. Les principales manifestations cliniques sont le vasospasme cérébral, l'hémorragie cérébrale spontanée et la paralysie du nerf oculomoteur. Les facteurs de risque courants incluent les troubles hémodynamiques, la génétique, le vieillissement, les infections et les facteurs congénitaux. Les traitements cliniques principaux, clipping chirurgical et/ou embolisation endovasculaire, visent à prévenir la rupture. Cependant, le mécanisme détaillé sous-jacent à l'AI reste à élucider, reflétant le besoin urgent de méthodes plus efficaces dans la prise en charge de l'AI.

Les ARN non codants longs (lncARN) font plus de 200 nucléotides et appartiennent à une espèce d'ARN non codants. L'expression du lncARN 1 associé à l'arrêt de croissance est sous-régulée dans l'AI. Le transcrit 1 associé à l'adénocarcinome pulmonaire métastatique (MALAT1) est un lncARN hautement enrichi et largement exprimé, d'environ 8000 nt. MALAT1 module la dysfonction des cellules musculaires lisses dans l'anévrisme de l'aorte thoracique. Une étude a présenté l'expression anormale de lncARN et d'ARN messagers (ARNm) dans l'AI, les réseaux de co-expression lncARN-ARNm fournissant des indices sur la pathogenèse. MALAT1 favorise l'expression d'ostérix et module la différenciation ostéogénique via le ciblage de l'expression du microARN-143 (miR-143) dans les cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse humaine. Une étude a présenté le rôle du cluster miR-143/145 dans l'inversion de la régulation du facteur de type Krüppel 5 dans les cellules musculaires lisses et sa contractilité et prolifération dans l'AI. Selon Feng et al., la régulation négative de miR-143/145 et un niveau élevé de MMP-9 pendant la circulation peuvent être liés à la formation et rupture de l'AI. Une analyse a révélé que les miARN les plus dérégulés (miR-143 et miR-145) ciblent communément des gènes de voies de signalisation comme le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et d'autres gènes régulant le mouvement ou l'adhésion cellulaire. Une étude a révélé l'importance prédictive des variations de VEGFA dans l'AI. D'où notre recherche pour évaluer le mécanisme de l'axe de signalisation MALAT1/miR-143/VEGFA dans l'AI induit par lésion endothéliale vasculaire.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique de l'Hôpital affilié n°1 de l'USTC, Division des sciences de la vie et médecine, Université des sciences et technologies de Chine, et a suivi les préceptes de la Déclaration d'Helsinki. Les participants ont fourni un consentement éclairé écrit. Tous les expériences animales étaient conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de la santé. Le protocole a été autorisé par le Comité d'éthique des expériences animales du même hôpital.

Sujets d'étude

Vingt patients atteints d'AI (groupe AI) diagnostiqués par imagerie et ayant reçu un clipping neurochirurgical à l'Hôpital affilié n°1 de l'USTC ont été sélectionnés. 11 hommes, 9 femmes, âgés de 43,27 ± 6,25 ans. Les tissus d'AI ont été prélevés. Parallèlement, les tissus vasculaires artériels corticaux temporaux du pôle temporal ont été résections de 20 patients (groupe témoin) avec épilepsie du lobe temporal causée par sclérose amygdalienne et hippocampique. Les tissus résections ont été examinés comme tissus artériels normaux par histopathologie post-opératoire ; 13 hommes, 7 femmes, 44,18 ± 5,91 ans. Aucune différence significative en sexe et âge entre les groupes (P > 0,05). Échantillons de sang veineux (2 tubes) obtenus de tous les sujets à jeun le matin avant opération.

Établissement de modèles de rats d'AI

Soixante rats Sprague-Dawley mâles de grade propre (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, Chine), 200-250 g, élevés 7 jours (25 ± 2 °C, humidité 65-70 %, cycle 12 h jour/nuit, eau et nourriture à volonté). Les rats ont reçu de l'élastase pancréatique porcine dans l'artère carotide externe et autour de la bifurcation de la paroi artérielle. L'artère carotide externe a été ligaturée avec deux fils chirurgicaux à la branche à ~1,5 mm. L'artère a été coupée entre les deux fils pour former un anévrisme de l'artère carotide interne dans le segment aveugle de l'artère carotide externe. Les rats ont reçu 1 % de sérum physiologique pendant 1 semaine post-opératoire. Une angiographie cérébrale a été réalisée après 1 mois et la formation d'anévrisme observée.

Après établissement des modèles, 50 rats ont été répartis aléatoirement en 5 groupes (n=10 chacun) : groupe blanc (injection stéréotaxique de 100 μL PBS), groupe sh-NC (sh-MALAT1 NC), groupe sh-MALAT1 (sh-MALAT1 plasmid), groupe Oe-NC (Oe-MALAT1 NC plasmid), groupe Oe-MALAT1 (Oe-MALAT1 plasmid). Les plasmides ont été construits par Shanghai Genechem Co., Ltd.

Test de pression artérielle des rats

La pression artérielle de l'artère caudale a été mesurée aux semaines 1, 4 et 12 post-opératoire. Avant mesure, rats placés dans un dispositif de chauffage à température constante, puis maintenus au calme plusieurs minutes dans une cage spéciale. Si la pression variait fortement, elle était mesurée 2-3 fois à différents moments pour obtenir la moyenne.

Acquisition des tissus d'anévrisme

Après 3 mois, rats anesthésiés au pentobarbital sodique 1 % (40 mg/kg) IP pour prélèvement sanguin veineux. Rats euthanasiés, thorax ouvert, ventricule gauche intubé dans l'aorte, cave coupée pour libérer le sang. Perfusion cardiaque rapide avec 30 mL sérum physiologique hépariné pour chasser le sang, puis 10 mL de 10 % polyformaldéhyde/0,1 M PBS (pH 7,4) injectés dans le cerveau. Après perfusion et fixation, cerveau ouvert. La circulation artérielle à la base du crâne observée soigneusement, le tissu d'anévrisme séparé, les changements observés au microscope.

Essai immuno-enzymatique (ELISA)

Indices sériques testés par kits ELISA. Échantillons sanguins placés à 37 °C 1 h, centrifugés 3000 tr/min 10 min. Détection de l'endothéline-1 (ET-1) et du facteur de von Willebrand (vWF) selon instructions des kits (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Jiangsu, Chine).

Coloration hématoxyline-éosine (HE)

Échantillons fixés au formol 10 % > 24 h, inclus dans paraffine. Blocs déparaffinés au xylène 20 min, déshydratés série d'alcools décroissants (100 %, 95 %, 80 %, 75 %) 1 min, colorés hématoxyline 10 min. Rincés eau distillée, différenciés éthanol acide chlorhydrique 30 s, trempés eau chaude 50 °C 5 min. Colorés éosine, rincés, déshydratés alcools 70 % et 90 %, éclaircis xylène, montés gomme neutre. Morphologie observée au microscope à fort grossissement.

Observation au microscope électronique à transmission

Tissus de rechange fixés glutaraldéhyde 2,5 % et acide osmique 1 %, déshydratés, inclus résine Epon812. Coupes semi-fines colorées bleu toluène, rognées, coupes ultrafines. Colorées acétate d'uranyle et citrate de plomb, observées au MET JME-2000EX (Hitachi High-Technologies, Shanghai, Chine).

Coloration TUNEL

Coloration TUNEL pour observer l'apoptose des cellules endothéliales dans les rats AI selon kit TUNEL (Roche, Bâle, Suisse). Coupes d'anévrisme de rat lavées 2x xylène (5 min), déshydratées série d'alcools décroissants 3x (5 min). Traitées protéinase K 20 μg/mL sans DNase 15-30 min, 50 μL solution réaction TUNEL 60 min, développées 50 μL DAB 25 °C 10 min. Contre-colorées hématoxyline, déshydratées alcool gradient, éclaircies xylène, montées gomme neutre. Observées au microscope optique, indice apoptotique calculé.

Isolation et identification des cellules endothéliales vasculaires d'anévrisme

Isolation selon Boscolo et al. Tissus AI sectionnés en fragments 3 mm². Incubation collagénase B 0,1 % / dispase 0,1 % (Roche) 25 min 37 °C. Tissus pré-détachés triturés 2 min pipette 2 mL, filtrés tamis 100 μm (Thermo Fisher). Suspension cellulaire centrifugée, resuspendue milieu MV2 (facteurs de croissance + 20 % sérum fœtal bovin) (PromoCell, Heidelberg, Allemagne). Cellules ensemencées 1 × 10⁴ cellules/mL en flacon enduit fibronectine 1 μg/cm². Suivant Jackson et al., cellules 80-100 % confluence séparées avec billes (Dynabeads M-450 Tosylactived, Oxoid, Hampshire, UK) enduites Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) (Vector Laboratories, Peterborough, UK). Cellules endothéliales adhérentes aux billes lectine accumulées par concentrateur magnétique, cellules non conjuguées lavées milieu basal. Cellules UEA positives resuspendues milieu culture, ensemencées flacon enduit fibronectine pour améliorer adhérence et croissance.

Cellules cultivées MV2 sur lames chambre enduites fibronectine. À confluence 80-100 %, fixées acétone 4 °C, traitées Triton X-100 1 % 5 min, puis BSA 0,5 % 15 min. Anticorps primaire anti-vWF (1:300, Abcam, Cambridge, MA, USA) 2 h (NC sans anticorps primaire), anticorps secondaire peroxydase-conjugué IgG (1:150, Abcam) 30 min. Développement DAB 50 μL 25 °C 5 min, contre-coloration hématoxyline, différenciation HCl 0,1 %, déshydratation alcool, clarification xylène, montage gomme neutre. Photographiées au microscope inversé.

Groupement cellulaire et transfection

Cellules endothéliales vasculaires d'anévrisme en phase logarithmique réparties en 5 groupes : blanc (sans traitement), sh-NC (transfectées sh-MALAT1 NC), sh-MALAT1 (sh-MALAT1 plasmid), Oe-NC (Oe-MALAT1 NC), Oe-MALAT1 (Oe-MALAT1 plasmid). Plasmides synthétisés par Genechem. Transfection selon instructions réactif lipofectamine™ 2000 (11668-027, Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA).

Essai MTT

Cellules endothéliales vasculaires de chaque groupe ensemencées plaque 96 puits à densité 3 × 10⁴ cellules/mL, cultivées 37 °C, 5 % CO₂ 48 h. 5 puits parallèles/groupe, 20 μL solution MTT fraîche (5 mg/mL, Sigma, St. Louis, MO, USA) par puits. Après 4 h réaction, cellules mélangées 200 μL DMSO. Après dissolution complète, densité optique mesurée à 490 nm par lecteur microplaques (BioRad, Hercules, Californie, USA).

Cytométrie de flux

Distribution du cycle cellulaire testée par coloration iodure de propidium (PI). Cellules endothéliales détachées, centrifugées, resuspendues éthanol 75 % pré-refroidi, fixées overnight -20 °C. Centrifugées, surnageant éliminé. Resuspendues 450 μL PBS, ajout 100 μL RNase A, coloration 400 μL PI 4 °C 30 min à l'abri de la lumière. Cytomètre de flux (FACSCalibur, Becton Dickinson, NJ, USA) pour distribution cycle cellulaire.

Apoptose cellulaire testée par double coloration Annexin V/PI. Cellules endothéliales détachées, lavées PBS 3x. Resuspendues 100 μL tampon de liaison 1× pré-refroidi, mélangées 5 μL Annexin et 5 μL PI. Apoptose testée par cytomètre de flux. Annexin V axe transverse, PI axe longitudinal : quadrant sup. gauche = cellules mécaniquement lésées (Annexin V⁻/PI⁺), sup. droit = cellules apoptotiques tardives/nécrotiques (Annexin V⁺/PI⁺), inf. gauche = cellules normales négatives (Annexin V⁻/PI⁻), inf. droit = cellules apoptotiques précoces (Annexin V⁺/PI⁻). Total cellules apoptotiques (Annexin V⁺/PI⁻ + Annexin V⁺/PI⁺) calculé en pourcentage.

RT-qPCR

ARN totaux tissus et cellules extraits par Trizol (Takara Biotechnology, Dalian, Chine), concentration et pureté déterminées. Transcription inverse ARN en ADNc selon kit transcription inverse (K1621, Fermentas, Maryland, NY, USA). Séquences amorces MALAT1, miR-143, VEGFA (Tableau 1) conçues par Genechem. Pour évaluer l'expression lncARN, miARN, ARNm, RT-qPCR avec SYBR GreenPCR Master Mix (Takara, Tokyo, Japon) sur système Roche Real-Time PCR (Roche). U6 paramètre interne miR-143 ; MALAT1 et VEGFA avec GAPDH comme paramètres internes. Niveaux transcriptionnels relatifs calculés par méthode 2^(-ΔΔCt).

Analyse Western Blot

Protéines totales tissus et cellules extraites. Concentration protéique déterminée par kit acide bicinchoninique (Boster Biological Technology, Wuhan, Hubei, Chine). Protéines séparées électrophorèse gel polyacrylamide 10 % (Boster). Transfert sur membrane PVDF, blocage BSA 5 % 1 h. Incubation anticorps primaires : Ki-67 (1:1000), VEGFA (1:1000), vWF (1:1000), MMP-9 (1:1000, Abcam, Cambridge, UK), Cyclin D1 (1:1000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, USA), GAPDH (1:2000, Jackson Immuno Research, Grove, Pennsylvanie, USA) ; anticorps secondaire (1:500, Jackson Immuno Research) peroxydase. Membrane imagerie système Odyssey infrarouge deux couleurs, valeurs de gris bandes mesurées logiciel Quantity One.

Essai double rapporteur luciférase

Sites de liaison MALAT1 et miR-143 prédits par site bioinformatique (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). Relation de liaison vérifiée par essai rapporteur luciférase. Fragment gène MALAT1 3'UTR synthétique introduit dans vecteurs rapporteur pmiR-Report luciférase (Thermo Fisher Scientific) pour générer MALAT1 type sauvage (MALAT1-WT) par sites endonucléase Bamh1 et Ecor1. Séquence mutation complémentaire conçue sur MALAT1-WT, fragment inséré dans vecteurs pmiR-Report pour produire MALAT1 type mutant (MALAT1-MUT) par ligase T4 ADN après digestion endonucléase de restriction. MALAT1-WT et MALAT1-MUT correctement séquencés co-transfectés avec mimic NC et mimic miR-143 dans cellules endothéliales vasculaires. Cellules récoltées et lysées 48 h post-transfection, activité luciférase testée kit détection luciférase (BioVision, San Francisco, CA, USA) avec luminomètre (Glomax20/20, Promega, Madison, Wisconsin, USA).

Relation cible miR-143 et VEGFA et site liaison miR-143 et VEGFA 3'UTR prédits par site bioinformatique (https://www.targetscan.org/vert_72/). Séquence région promoteur VEGFA 3'UTR contenant site liaison miR-143 clonée dans vecteurs pmiR-Report pour générer VEGFA-WT. Sur ce rapporteur, site liaison VEGFA-WT et miR-143 muté pour former VEGFA-MUT. VEGFA-WT ou VEGFA-MUT co-transfectés avec mimic NC ou mimic miR-143 dans cellules endothéliales 48 h. Cellules lysées, activité luciférase testée kit détection.

Essai pull-down d'ARN

Pour vérifier liaison miR-143 et MALAT1, essai pull-down d'ARN réalisé. Trois séquences miARN biotinylées Bio-miR-143-WT, Bio-miR-143-MUT, Bio-miR-NC conçues et confiées à GenePharma (Shanghai, Chine). Oligonucléotides biotinylés transféctés cellules 48 h. Cellules récoltées, incubées lysat cellulaire spécifique (Ambion, Austin, Texas, USA) 10 min. Lysat incubé billes streptavidine M-280 pré-enduites RNase-free et ARNt levure (Sigma) 4 °C 3 h, lavé 2x solution lysat froid, 3x tampon sel bas, 1x tampon sel haut. Sonde miR-143 antagoniste comme NC. ARN total extrait Trizol, niveau enrichissement MALAT1 testé RT-qPCR.

Analyse statistique

Données analysées logiciel SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Données de mesure : moyenne ± écart-type. Comparaisons deux groupes : test t indépendant ; comparaisons multiples : ANOVA à un facteur, comparaisons par paires test de Tukey. Relation entre expression MALAT1 et caractéristiques clinicopathologiques AI : test du chi-carré. P < 0,05 = différence statistiquement significative.

Résultats

MALAT1 et VEGFA surexprimés et miR-143 sous-exprimé dans les tissus d'AI

L'expression d'ET-1 et vWF dans le sérum des groupes AI et témoin détectée par ELISA : ET-1 et vWF augmentés dans le groupe AI vs témoin (P < 0,05) (Fig. 1a, b).

MALAT1 et VEGFA surexprimés, miR-143 sous-exprimé dans les tissus d'AI. a ET-1 sérique patients AI et épilepsie lobe temporal par ELISA. b vWF sérique patients AI et épilepsie lobe temporal par ELISA. c Observation pathologique tissus AI et artériels normaux par coloration HE. d Observation morphologique tissus AI et artériels normaux par MET. e Expression ARNm MALAT1, miR-143, VEGFA tissus AI et artériels normaux par RT-qPCR. f Expression protéique VEGFA, MMP-9, vWF tissus AI et artériels normaux par Western blot. Cellules endothéliales (CE), lame élastique interne (LEI), cellules musculaires lisses (CML). Données : moyenne ± écart-type ; comparaisons groupes : test t indépendant.

Changements pathologiques tissus AI observés par coloration HE. Aucun dommage évident endoderme, cellules endothéliales, cellules musculaires lisses dans tissus artériels normaux, cellules rangées proprement, structure complète. Tissus AI : cellules endothéliales endommagées, cellules musculaires lisses dégénérées, paroi artérielle amincie, fibres élastiques rompues, cellules inflammatoires infiltrées (Fig. 1c).

Changements ultrastructuraux tissus AI et artériels normaux observés par MET. Cellules endothéliales complètes, structure adventice intacte, pas de membrane élastique interne rompue ni cellules musculaires lisses apoptotiques dans tissus normaux. Tissus AI : dégénérescence sévère paroi vasculaire, disparition majorité cellules endothéliales, lame élastique interne sévèrement rompue, cellules musculaires lisses sévèrement endommagées/dégénérées, désordre membrane externe vaisseau (Fig. 1d).

RT-qPCR pour expression ARNm MALAT1, miR-143, VEGFA ; Western blot pour expression protéique VEGFA, MMP-9, vWF dans tissus AI et artériels normaux. Par rapport aux tissus artériels normaux, expression MALAT1, VEGFA, MMP-9, vWF augmentée et miR-143 diminuée dans tissus AI (P < 0,05) (Fig. 1e, f).

Grade Hunt-Hess, degré de lésion endothéliale et antécédents tabagiques corrélés avec l'expression de MALAT1 dans les tissus d'AI

Selon expression médiane MALAT1, patients répartis en groupe faible expression et fort expression. Relation expression MALAT1 et caractéristiques clinicopathologiques patients AI analysée. Résultats : grade Hunt-Hess, degré lésion endothéliale, antécédents tabagiques associés expression MALAT1 (P < 0,05) ; âge, sexe, mode chirurgical non liés (P > 0,05) (Tableau 2).

Régulation négative de MALAT1 réprime la pression artérielle, l'expression d'ET-1, vWF, MMP-9 et l'indice apoptotique des cellules endothéliales vasculaires de rats avec AI

Comme Tableau 3, knockdown MALAT1 diminue, surexpression MALAT1 augmente la pression artérielle aux semaines 4 et 12.

ELISA : régulation négative MALAT1 réduit, régulation positive augmente ET-1 et vWF sériques rats AI (Fig. 2a, b).

Régulation négative MALAT1 réprime pression artérielle, expression ET-1, vWF, MMP-9 et indice apoptotique cellules endothéliales vasculaires rats AI. a ET-1 sérique rats ELISA. b vWF sérique rats ELISA. c Changements pathologiques tissus AI rats coloration HE. d Ultrastructure tissus AI rats MET. e Apoptose cellules endothéliales vasculaires coloration TUNEL. f Indice apoptotique cellules endothéliales vasculaires rats. g Expression ARNm MALAT1, miR-143, VEGFA tissus AI rats RT-qPCR. h Expression protéique VEGFA, MMP-9, vWF tissus AI rats Western blot. * P < 0,05 vs groupe sh-NC, # P < 0,05 vs groupe Oe-NC. Données : moyenne ± écart-type, comparaisons multiples : ANOVA un facteur suivi test de Tukey.

Changements pathologiques tissus AI chaque groupe coloration HE. Groupes blanc, sh-NC, Oe-NC : membrane interne endommagée, cellules endothéliales exfoliées, cellules musculaires lisses dégénérées, cellules et couches réduites, paroi artère amincie. Groupe sh-MALAT1 : endoderme, cellules endothéliales, couche cellules musculaires lisses, couche membrane externe artère intracrânienne légèrement endommagés mais rangés proprement. Groupe Oe-MALAT1 : couche intime disparue, cellules endothéliales exfoliées, fibres élastiques rompues, cellules inflammatoires infiltrées (Fig. 2c).

Tissus AI rats chaque groupe observés MET. Groupes blanc, sh-NC, Oe-NC : cellules endothéliales dénaturalisées, sous-couche endothéliale désintégrée, lame élastique interne disparue, cellules musculaires lisses diminuées. Groupe sh-MALAT1 : cellules endothéliales plates, noyau ovale, fibres collagènes augmentées mais sans couche élastique. Groupe Oe-MALAT1 : cellules endothéliales disparues, couche élastique séparée couche musculaire, désintégrée dans lumière (Fig. 2d).

Indice apoptotique cellules endothéliales vasculaires rat AI testé coloration TUNEL. Silençage MALAT1 réduit indice apoptotique, surexpression MALAT1 effet inverse (Fig. 2e, f).

RT-qPCR détection expression ARNm MALAT1, miR-143, VEGFA ; Western blot expression protéique VEGFA, MMP-9, vWF tissus AI : élimination MALAT1 déprime expression MALAT1, VEGFA, MMP-9, vWF, augmente miR-143. Inversement, élévation MALAT1 effets opposés (Fig. 2g, h).

Faible expression de MALAT1 favorise la viabilité et inhibe l'apoptose des cellules endothéliales vasculaires dans l'AI

Coloration immunohistochimique pour détecter expression marqueur endothélial spécifique vWF. Cytoplasme cellules endothéliales vasculaires AI recouvert fines particules brunes (positif), cytoplasme groupe NC sans particules brunes. Confirmation que cellules cultivées sont endothéliales (Fig. 3a, b).

Faible expression MALAT1 favorise viabilité et inhibe apoptose cellules endothéliales vasculaires AI. a Coloration immunohistochimique vWF cellules endothéliales vasculaires AI : particules fines jaunes. b Coloration immunohistochimique vWF cellules endothéliales vasculaires AI : pas particules brunes groupe NC. c Viabilité cellules endothéliales vasculaires chaque groupe essai MTT. d Expression protéique CyclinD1 et Ki-67 chaque groupe Western blot. e Changements cycle cellulaire chaque groupe coloration PI. f Taux apoptose cellulaire chaque groupe double coloration Annexin V/PI. g Expression protéique Bax et Bcl-2 chaque groupe Western blot. * P < 0,05 vs sh-NC, # P < 0,05 vs Oe-NC. Données : moyenne ± écart-type, comparaisons multiples : ANOVA un facteur suivi Tukey.

Essai MTT, cytométrie de flux, Western blot pour tester viabilité et apoptose cellules endothéliales vasculaires. Diminution MALAT1 favorise viabilité (augmente Cyclin D1 et Ki-67) et déprime apoptose (diminue cellules phase G0/G1, augmente phases S et G2/M, réduit Bax, augmente Bcl-2). Surexpression MALAT1 effets opposés sur viabilité et apoptose (Fig. 3c-g).

miR-143 se lie à MALAT1 et VEGFA est un gène cible de miR-143

Expression MALAT1, miR-143, VEGFA dans cellules endothéliales vasculaires chaque groupe vérifiée RT-qPCR et Western blot. Knockdown MALAT1 déprime MALAT1 et VEGFA, augmente miR-143. Surexpression MALAT1 : incrément MALAT1 et VEGFA, réduction miR-143 (Fig. 4a, b).

miR-143 se lie à MALAT1 et VEGFA est gène cible miR-143. a Expression ARNm MALAT1, miR-143, VEGFA cellules endothéliales anévrisme chaque groupe. b Expression protéique VEGFA cellules endothéliales anévrisme chaque groupe. c Sites liaison MALAT1 et miR-143 prédits site bioinformatique. d Relation régulatrice MALAT1 et miR-143 validée essai double rapporteur luciférase. e Relation liaison MALAT1 et miR-143 vérifiée essai pull-down ARN. f Sites liaison miR-143 et VEGFA prédits site bioinformatique. g Relation régulatrice miR-143 et VEGFA validée essai double rapporteur luciférase. * P < 0,05 vs sh-NC, # P < 0,05 vs Oe-NC. Données : moyenne ± écart-type, comparaisons deux groupes : test t indépendant, comparaisons multiples : ANOVA un facteur suivi Tukey.

Région liaison spécifique MALAT1 et miR-143 prédite logiciel analyse en ligne (Fig. 4c). Résultats essai double rapporteur luciférase : activité luciférase altérée groupe MALAT1-WT + mimic miR-143 vs MALAT1-WT + mimic-NC (P < 0,05). Pas différence distincte groupe MALAT1-MUT + mimic miR-143 vs MALAT1-MUT + mimic-NC (P > 0,05), indiquant liaison spécifique miR-143 à MALAT1 (Fig. 4d). Résultats essai pull-down ARN : niveau enrichissement MALAT1 groupe Bio-miR-143-WT augmenté vs Bio-miR-NC (P < 0,05), pas différence groupe Bio-miR-143-MUT (P > 0,05) (Fig. 4e).

Logiciel bioinformatique prédit relation ciblée miR-143 et VEGFA (Fig. 4f). Activité luciférase : activité relative réprimée après co-transfection VEGFA-WT + mimic miR-143 dans cellules endothéliales (P < 0,05). Activité relative non affectée co-transfection VEGFA-MUT + mimic miR-143 (P > 0,05) (Fig. 4g). Indique VEGFA gène cible direct miR-143.

Discussion

L'AI est une maladie intracrânienne grave, menant principalement à l'hémorragie sous-arachnoïdienne. Une étude précédente a démontré l'implication de réseaux d'ARN compétitifs endogènes liés aux lncARN dans l'AI. Une étude récente a apporté la preuve qu'un polymorphisme fonctionnel dans la région promotrice du gène miR-143/145 est lié au risque d'AI. Dans l'étude de Xu et al., la surexpression de facteurs angiogéniques comme VEGFA peut être liée à la formation et rupture d'AI. Pour expliquer le mécanisme moléculaire de MALAT1 dans l'AI, une série d'essais a été menée et les résultats ont révélé que l'AI induit par lésion endothéliale vasculaire était régulé par l'axe de signalisation MALAT1/miR-143/VEGFA.

Premièrement, notre étude apporte des preuves substantielles que MALAT1 et VEGFA sont surexprimés et miR-143 sous-exprimé dans les tissus d'AI. Une étude récente a présenté que MALAT1 est l'un des lncARN les plus surexprimés dans l'ischémie cérébrale. Une autre étude a montré que MALAT1 est surexprimé dans les cellules cancéreuses ovariennes et participe à l'apoptose, migration, prolifération. Une étude sur le profil d'expression d'AI non rompus et rompus a démontré que l'expression de facteurs angiogéniques comme VEGFA est surexprimée dans l'anévrisme rompu. De plus, une étude clinique a présenté que le cluster miR-143/145 de patients AI est sous-exprimé vs sujets sains. En outre, il a été discuté que miR-143/145 participe à divers processus biologiques associés à la formation d'anévrisme et est sous-exprimé dans l'AI. Tous ces résultats font écho aux explorations antérieures.

Outre ces résultats, cette étude a exploré le rôle fonctionnel de MALAT1 dans l'AI par essais gain-de-fonction et perte-de-fonction. Résumé : régulation négative MALAT1 réduit pression artérielle, taux sériques ET-1, expression vWF et MMP-9 dans tissus AI. Il a été suggéré que la régulation négative de MALAT1 réprime la surexpression du produit de transcription ET-1 induit par le glucose. L'expression ectopique de MALAT1 est l'inducteur de la génération de vWF. Une étude a vérifié que la déplétion de MALAT1 dans les macrophages dérivés de moelle osseuse inhibe l'expression de MMP-9.

Des expériences cellulaires ont confirmé les fonctions de MALAT1 dans l'AI. Résultats : knockdown MALAT1 favorise viabilité cellules endothéliales vasculaires et déprime apoptose dans l'AI. Similairement, la perturbation de MALAT1 améliore l'architecture de la paroi aortique et retarde la croissance de l'anévrisme. Complémentaire, une étude montre que la faible expression de MALAT1 induit l'apoptose et réprime la prolifération des cellules leucémiques myéloïdes aiguës. Une autre a démontré les effets inhibiteurs du knockdown MALAT1 sur la prolifération des cellules cartilagineuses d'arthrose humaine. Une recherche antérieure confirme que la régulation négative de MALAT1 peut induire l'apoptose et atténuer la prolifération des cellules gliomateuses. De plus, la faible expression de MALAT1 induite par interférence ARN favorise l'apoptose et supprime la prolifération des cellules myélome multiple. Collectivement, ces études expliquent dans une certaine mesure le mécanisme moléculaire de MALAT1 dans l'AI.

En outre, cette study a prouvé que miR-143 se lie à MALAT1 et VEGFA est gène cible de miR-143. Similairement, un article soutient que MALAT1 se lie directement à miR-143 et supprime son expression. Zhu et al. ont trouvé que MALAT1 exerce ses rôles via interaction avec miR-143 dans cellules carcinome cervical. Il est confirmé que MALAT1 module indirectement VEGFA via miR-200b-3p. Une autre étude suggère que miR-143-3p médie l'effet de ZFPM2 sur plusieurs cibles protéiques dans le sang, incluant VEGFA. Néanmoins, les interactions entre MALAT1, miR-143 et VEGFA dans l'AI n'ont pas été discutées et nécessitent plus d'études.

Conclusion

De ces résultats, il est clair que le knockdown de MALAT1 déprime l'apoptose et favorise la viabilité des cellules endothéliales vasculaires dans l'AI en modulant l'axe miR-143/VEGFA. Le réseau de co-expression suggère la connexion entre MALAT1 et miR-143 avec l'implication de VEGFA. Les résultats de cette étude dévoilent partiellement la pathogenèse de l'initiation et progression de l'AI, et les cibles étudiées peuvent être un point d'entrée potentiellement notable pour révéler la pathologie de l'AI sous un autre angle. Toutefois, des études à plus grande échelle sont nécessaires pour illustrer complètement les mécanismes de l'axe MALAT1/miR-143/VEGFA dans l'AI.