Nec-1 atténue la neurotoxicité induite par les nanoparticules de dioxyde de titane dans les cellules SH-SY5Y via la modulation de RIP1

Résumé

Les nanomatériaux de dioxyde de titane sont appliqués dans de nombreux domaines grâce à leurs excellentes caractéristiques physico-chimiques, ce qui pose une menace potentielle pour la santé humaine. Récemment, de nombreuses études in vivo ont révélé que les nanoparticules de dioxyde de titane (TNP) peuvent être transportées dans le cerveau animal après exposition par diverses voies. Les TNP absorbées peuvent s'accumuler dans le cerveau et perturber les cellules neuronales, entraînant des dysfonctionnements cérébraux. Des études in vitro ont vérifié la neurotoxicité des TNP. Les mécanismes sous-jacents restent obscurs. L'implication de la nécroptose dans la neurotoxicité des TNP est inconnue. Nous avons donc réalisé une étude in vitro et trouvé que les TNP induisaient une lésion inflammatoire dans les cellules SH-SY5Y de manière dose-dépendante, atténuée par prétraitement à la nécrostatine-1 (Nec-1). La kinase 1 interagissant avec le récepteur (RIP1) étant la cible rapportée de Nec-1, nous l'avons silenciée par siRNA. Nous avons exposé cellules mutantes et sauvages aux TNP et évalué la lésion inflammatoire. Le silence de l'expression de RIP1 inhibait la lésion inflammatoire induite par l'exposition aux TNP. Ensemble, Nec-1 améliore la neurotoxicité des TNP via RIP1. Cependant, davantage d'études sont nécessaires pour évaluer complètement la corrélation entre neurotoxicité des TNP et RIP1.

Introduction

Grâce à leurs propriétés physico-chimiques splendides, les nanomatériaux de dioxyde de titane sont synthétisés et largement utilisés : cosmétiques, industrie, domaines médicaux. Cette utilisation généralisée peut poser une grande menace pour la santé. Une fois exposés, la majorité des TNP pénètrent dans le corps par inhalation et ingestion. Système respiratoire, digestif, cardiovasculaire peuvent être perturbés par les TNP absorbés. Le cerveau, partie la plus importante du système nerveux central, peut aussi être perturbé, car les TNP dans la circulation peuvent franchir la barrière hémato-encéphalique, et les NP inhalées pourraient être transportées au cerveau via la voie olfactive. Une fois dans le cerveau, elles peuvent s'y accumuler et causer des dommages, menant à dysfonctionnements. Les dommages cérébraux sont généralement irréversibles et sévères, toute cause potentielle doit être investiguée.

Bien qu'aucune étude épidémiologique n'ait exploré l'association exposition TNP / maladies cérébrales, de nombreuses études in vivo et in vitro ont confirmé la neurotoxicité des TNP. L'accent majeur a été mis sur la découverte des mécanismes sous-jacents. Nous avons précédemment révisé les mécanismes moléculaires connus de la neurotoxicité des TNP et trouvé que les processus de mort cellulaire programmée (MCP), comme l'apoptose et l'autophagie, étaient impliqués.

La nécroptose, aussi appelée nécrose régulée, est un autre type de MCP. Contrairement à l'apoptose (caspase-dépendante), la nécroptose est dépendante des kinases 1/3 interagissant avec le récepteur (RIP1/RIP3). RIP1 activé recrute RIP3 pour former un nécrosome, qui active la protéine MLKL (mixed lineage kinase domain-like) pour initier la nécroptose. La nécroptose régule mort cellulaire et neuroinflammation, toutes deux impliquées dans la neurotoxicité des TNP. Nous avons donc émis l'hypothèse que la nécroptose est impliquée dans la neurotoxicité causée par les TNP.

Pour tester notre hypothèse, nous avons réalisé une étude in vitro explorant le rôle de la nécroptose dans la neurotoxicité des TNP. Viabilité cellulaire, fuite LDH, cytokines inflammatoires (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) mesurées après exposition TNP. Premièrement, cellules SH-SY5Y cultivées avec diverses concentrations TNP. Deuxièmement, cellules exposées TNP avec/sans Nec-1 (inhibiteur puissant nécroptose). Troisièmement, expression gène RIP1 (supprimée par Nec-1) silenciée par siRNA, puis cellules mutantes et sauvages traitées TNP. Cette étude éclaire la compréhension complète des mécanismes moléculaires sous-jacents à la neurotoxicité des TNP.

Résultats

Les TNP inhibent la viabilité cellulaire

Pour vérifier cytotoxicité TNP sur cellules SH-SY5Y, viabilité cellulaire évaluée par test CCK8. Cellules cultivées concentrations TNP 5–160 μg/mL pendant 24, 48, 72 h. Fig. 1 : viabilité inchangée 5, 10, 20, 40 μg/mL après 24 h. 48 et 72 h : viabilité inchangée seulement groupe 5 μg/mL (p=0,4507 à 48 h, p=0,1002 à 72 h). Viabilité dramatiquement plus faible 80 μg/mL après 48 h (p=0,0007) et 72 h (p=0,0008). Conclusion : TNP diminuent viabilité manière dose- et temps-dépendante, exposition long terme plus toxique.

Les TNP endommagent l'intégrité membranaire

Analyse effets toxiques TNP intégrité membranaire après 72 h exposition. Intégrité membranaire évaluée fuite LDH. Fig. 1b : taux LDH significativement augmentés cellules traitées TNP doses >5 μg/mL. Production LDH augmentée 40, 80, 160 μg/mL (p<0,0001). Résultats : TNP augmentent LDH manière dose-dépendante, similaire test CCK8.

L'exposition aux TNP favorise l'inflammation

Réponse inflammatoire après exposition TNP analysée ELISA. Après traitement diverses concentrations TNP 72 h, niveaux TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 mesurés. Fig. 2 : sécrétion IL-8 augmentée toutes cellules traitées TNP ; TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 uniformément élevés doses >5 μg/mL (p<0,01). Inflammation significativement plus élevée doses >10 μg/mL (p<0,0001). Ensemble : TNP augmentent inflammation manière dose-dépendante.

Nos résultats indiquent que TNP induisent lésion inflammatoire dose-dépendante. Concentration TNP 80 μg/mL et période exposition 72 h adoptées expériences suivantes explorer rôle nécroptose neurotoxicité TNP.

Co-traitement Nec-1 inhibe neurotoxicité TNP

Pour analyser rôle nécroptose lésion inflammatoire, co-traitement cellules Nec-1 (inhibiteur nécroptose) et TNP. Fig. 3a : cellules SH-SY5Y exposées TNP ou TNP+Nec-1 (1, 5, 10, 15, 20 μM) : Nec-1 améliore dramatiquement réduction viabilité induite TNP (10, 15, 20 μM) (p<0,0001). Viabilité groupes 15 μM et 20 μM pas supérieure groupe 10 μM (p=0,6643, p=0,6292) → co-traitement 10 μM Nec-1 analyser effet intégrité membranaire.

Après culture cellules TNP ou TNP+Nec-1 : taux LDH groupe TNP+Nec-1 bien plus bas que TNP seul (p=0,0005). Traitement Nec-1 seul n'augmente pas fuite LDH (p=0,9878). Conclusion : 10 μM Nec-1 inhibe efficacement cytotoxicité TNP sans toxicité cellulaire.

Analyse capacité anti-inflammatoire Nec-1 : cellules cultivées TNP ou TNP+Nec-1. Fig. 4 : production TNF-α (p=0,003), IL-1β (p=0,0013), IL-6 (p<0,0001), IL-8 (p=0,0004) significativement plus faible groupe TNP+Nec-1 vs TNP. Résultats impliquent Nec-1 atténue réponses inflammatoires induites exposition TNP.

Silence RIP1 atténue lésion inflammatoire induite par TNP

Pour déterminer si Nec-1 abroge lésion inflammatoire TNP via RIP1, expression RIP1 efficacement silencée siRNA (Fig. 5, p<0,0001). Lésion inflammatoire après exposition TNP cellules mutantes et sauvages mesurée. Fig. 6a : viabilité groupe TNP+si-RIP1 remarquablement plus élevée que TNP+si-NC (p=0,0002). Production LDH (Fig. 6b, p<0,0001) et niveaux TNF-α (p<0,0001), IL-1β (p=0,0001), IL-6 (p<0,0001), IL-8 (p=0,0001) (Fig. 7) dramatiquement plus bas groupe TNP+si-RIP1 vs TNP+si-NC. Résultats indiquent TNP favorisent lésion inflammatoire via RIP1.

Discussion

Cette étude révèle que l'exposition aux TNP induit cytotoxicité cellules SH-SY5Y manière dose-dépendante et que la nécroptose est impliquée dans la neurotoxicité des TNP. Pour explorer rôle nécroptose, cellules exposées TNP avec/sans Nec-1 (inhibiteur puissant nécroptose), mesure viabilité, fuite LDH, cytokines inflammatoires. Données suggèrent co-traitement Nec-1 atténue lésion inflammatoire induite TNP. Études montrent Nec-1 exerce effets en supprimant activité RIP1, nous avons transfecté cellules si-RIP1 déterminer si RIP1 impliqué effets protecteurs Nec-1. Cellules mutantes et sauvages traitées TNP, lésion inflammatoire évaluée. Viabilité groupe si-RIP1 plus élevée que si-NC, niveaux fuite LDH et cytokines inflammatoires plus bas groupe si-RIP1 vs si-NC après exposition TNP. Conclusion : étude révèle pour première fois nécroptose impliquée dans lésion inflammatoire induite TNP sur cellules.

Neurotoxicité TNP reconfirmée étude in vitro. Cellules SH-SY5Y exposées diverses concentrations TNP divers temps incubation, viabilité évaluée CCK8. Fig. 1a : exposition TNP réduit viabilité dose-dépendante ; 48 h et 72 h, viabilité groupes 80 et 160 TNP diminuée dramatiquement vs contrôle (p<0,001). Confirmation cytotoxicité : mesure fuite LDH. Fig. 1b : production LDH augmente dose-dépendante 72 h exposition, niveaux LDH groupes 40, 80, 160 remarquablement plus élevés contrôle (p<0,0001). Études antérieures : neuroinflammation promue exposition TNP [19] → niveaux TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 mesurés. Fig. 2 : quatre cytokines inflammatoires significativement régulées à la hausse vs contrôle, dramatiquement plus élevées groupes 20–160 μg/mL (p<0,0001). Ensemble : TNP induisent neurotoxicité dose-dépendante, cohérent études antérieures. TNP absorbées cellules neuronales inhibent prolifération [20-22]. Exposition TNP peut diminuer viabilité et promouvoir fuite LDH dose-dépendante [23-27].

Co-traitement Nec-1 clarifier implication nécroptose neurotoxicité TNP. Cellules traitées concentrations indiquées TNP avec/sans Nec-1, viabilité, fuite LDH, inflammation évaluées. Fig. 3a : réduction viabilité post-exposition TNP significativement inhibée co-traitement 10 μM Nec-1. Fig. 3b : traitement 10 μM Nec-1 n'augmente pas LDH, niveaux LDH groupe TNP+Nec-1 dramatiquement plus bas TNP seul. Effets co-traitement Nec-1 inflammation induite TNP mesurés. Fig. 4 : niveaux TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 remarquablement plus bas cellules TNP+Nec-1. Résultats reverifient Nec-1 protège cellules mort et processus inflammatoires [28, 29].

Enfin, RIP1 cible Nec-1, évaluation si RIP1 régule neurotoxicité TNP. Cellules mutantes construites silence expression RIP1 (Fig. 5). Données Fig. 6, 7 : post-exposition TNP, viabilité plus élevée, LDH, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 plus bas groupe si-RIP1 vs si-NC, suggérant TNP favorisent cytotoxicité via RIP1. Plusieurs études : RIP1 régule mort cellulaire et processus inflammatoires [30, 31].

Bien que nous rapportions pour première fois Nec-1 atténue neurotoxicité TNP en supprimant voie signalisation nécroptose, étude a limitations. Premièrement, cytotoxicité nano-matériaux diffère formes bulk, largement influencée propriétés surface [32], expliquant résultat contraire viabilité accrue Sebastián et al. [33]. Essentiel évaluer nanotoxicité sujets multiples aspects : prolifération cellulaire, intégrité membranaire, stress oxydatif, inflammation, fonction mitochondriale, cycle cellulaire, cytosquelette, épigénétique. Deuxièmement, RIP1 recrute RIP3 former nécrosome fonctionnel, activateur vital MLKL, initier nécroptose [34]. Hypothèse RIP3/MLKL impliqués neurotoxicité TNP, explorer travaux futurs. Associations RIP3/MLKL neurotoxicité TNP évaluer. Troisièmement, espèces réactives oxygène (ROS), mécanismes principaux neurotoxicité TNP [35, 36], signal amont RIP1 [37]. Si ROS amont RIP1 neurotoxicité TNP discuter davantage. Quatrièmement, cellules exposées concentrations non-toxiques (TNP <5 μg/mL) long terme (>72 h) évaluer cytotoxicité chronique. Cinquièmement, évaluer rôle nécroptose neurotoxicité TNP plus lignées cellulaires neuronales et cellules neuronales primaires humaines/animales.

Conclusions

Notre étude révèle nécroptose comme autre mécanisme mort cellulaire programmée impliqué neurotoxicité causée TNP. TNP induisent lésion inflammatoire cellules SH-SY5Y dose-dépendante ; Nec-1 (inhibiteur puissant nécroptose) co-traitement améliore effets nocifs. RIP1, cible Nec-1, silencé si-RNA, atténue efficacement lésion inflammatoire induite exposition TNP. Conclusion : Nec-1 inhibe lésion inflammatoire cellules SH-SY5Y induite exposition TNP en ciblant voie RIP1. Voies signalisation amont/aval RIP1 impliquées neurotoxicité TNP évaluer davantage.

Matériaux et Méthodes

Préparation TNP et culture cellulaire

TNP préalablement caractérisés et préparés selon procédure publiée [38]. Brièvement : TNP dissous RPMI 1640 concentrations 5, 10, 20, 40, 80, 160 μg/mL. Solution TNP stérilisée, soniquée (300 W, 10 min) température ambiante éviter agrégation avant traitement. Cellules milieu culture non exposées TNP = groupe contrôle. Cellules SH-SY5Y (Banque cellules Institut des sciences de la vie Shanghai, Académie chinoise des sciences) cultivées RPMI 1640 (HyClone) + 10 % sérum fœtal bovin (Gibco) + 100 U/mL pénicilline + 100 μg/mL streptomycine, 37 °C, incubateur humidifié 5 % CO₂.

Test viabilité cellulaire et fuite LDH

Viabilité cellulaire mesurée kit comptage cellules-8 (CCK8, Dojindo, cat no.CK04). 1×10⁴ cellules SH-SY5Y plaque 96 puits, incubateur 37 °C (5 % CO₂) 24 h avant exposition TNP. Cellules incubées TNP concentrations diverses (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μg/mL) 24 h supplémentaires. Après traitement, incubation CCK-8 2 h. DO mesuré 450 nm lecteur microplaques (BioTek). Viabilité chaque groupe (%) = (DO_treated−DO_blank)/(DO_control−DO_blank) × 100%.

Intégrité membranée mesurée kit commercial (Institut bioingénierie Nanjing, Chine). Après exposition cellules SH-SY5Y diverses concentrations TNP 72 h, sécrétion LDH analysée selon instructions fabricant.

Réponse inflammatoire

ELISA appliqué mesurer niveaux TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 produits cellules SH-SY5Y. Brièvement : cellules exposées TNP 72 h, surnageant collecté analyse selon instructions fabricant (Elabscience Biotechnology Co., Ltd.).

Transfection siRNA

Suivant protocole fabricant, 100 nM si-RIP1 ou siRNA contrôle négatif (si-NC) transfécté cellules Lipofectamine 2000. Efficacité silence gène siRNA estimée PCR temps réel.

PCR temps réel

ARN cellules exposées diverses concentrations TNP isolé kit RNAqueous (Ambion Inc., Austin, TX, USA) selon instructions. Expression relative RIP1 mesurée PCR temps réel. Niveaux ARNm relatifs RIP1 normalisés expressions β-actine.

Analyse statistique

Logiciel SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) analyse données. ANOVA à un facteur comparer moyennes groupes. p<0,05 considéré significatif.

Disponibilité des Données et Matériaux

Disponible depuis le manuscrit.

Abréviations

TNP :

Nanoparticules de dioxyde de titane

Nec-1 :

Nécrostatine-1

RIP :

Kinase interagissant avec le récepteur

MLKL :

Protéine de type kinase à domaine de lignée mixte

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène