Agents théranostiques à base de nanoclusters de magnétite pour IRM pondérée T2 et administration de doxorubicine sensible au pH

Résumé

Les nanostructures multifonctionnelles combinant médicaments anticancéreux et nanocristaux inorganiques émergent comme plateformes puissantes pour le diagnostic et la thérapie des tumeurs. Dans cette étude, nous avons fabriqué des nanoclusters (NC) de magnétite (Fe₃O₄) en combinant une microémulsion eau‑dans‑huile et une assemblage couche‑par‑couche (LBL). Les NC Fe₃O₄ étaient d'abord assemblés à partir de nanoparticules (NP) Fe₃O₄ coiffées d'acide oléique. L'adsorption séquentielle de poly(allylamine hydrochloride) (PAH), poly(sodium 4‑styrènesulfonate) (PSS) et chlorhydrate de doxorubicine (DOX) a donné des nanostructures hybrides Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX. Ces vecteurs présentent une libération de DOX sensible au pH, une cytotoxicité accrue contre les cellules de carcinome pulmonaire A549 et un contraste IRM pondéré T₂ supérieur (r₂ = 651 mM⁻¹ s⁻¹). L'émission fluorescente de DOX (λ_ex = 490 nm) facilite l'imagerie cellulaire. Notre travail établit une plateforme théranostique robuste à base de Fe₃O₄ intégrant IRM, imagerie par fluorescence et administration contrôlée de médicament.

Introduction

Les avancées récentes dans les systèmes d'administration de médicaments multifonctionnels ont permis l'imagerie et la thérapie simultanées, particulièrement par des designs sensibles aux stimuli exploitant les signaux du microenvironnement tumoral tels que l'acidité (pH ≈ 6,5–6,8). Les nanoparticules de magnétite (Fe₃O₄) sont particulièrement attractives pour les applications biomédicales en raison de leur superparamagnétisme, biocompatibilité et faible cytotoxicité. Cependant, les NP uniques de Fe₃O₄ souffrent souvent d'une faible réactivité magnétique et d'un chargement de médicament limité. L'assemblage de NP Fe₃O₄ en nanoclusters (NC) amplifie les effets magnétiques collectifs, améliorant la relaxivité T₂ et permettant des charges de médicament plus élevées lorsqu'elles sont combinées avec des multicouches polyélectrolytes. Malgré ces avantages, peu d'études ont rapporté des NC Fe₃O₄ fonctionnalisés avec PAH/PSS pour une libération de médicament déclenchée par pH.

Ici, nous rapportons une voie de fabrication évolutive pour des nanostructures hybrides Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX, combinant une auto‑assemblage par microémulsion et une adsorption électrostatique LBL. Les vecteurs résultants administrent la DOX avec une libération contrôlée, pH‑dépendante, démontrent un fort contraste IRM T₂ et tuent efficacement les cellules A549 in vitro.

Matériaux et méthodes

Matériaux

FeCl₃·6H₂O (99,99 %), FeCl₂·4H₂O (99,99 %), acide oléique (OA, 90 %), 1‑octadécène (ODE, 90 %), oléate de sodium (NaOA), éthanol, hexane, cyclohexane, isopropanol, dodécylbenzènesulfonate de sodium (SDBS), fluorure d'ammonium (NH₄F), NaOH, DMSO et ammoniaque étaient achetés chez Alfa Aesar et Sinopharm. PAH (PM 15 kDa), PSS (PM 70 kDa) et chlorhydrate de doxorubicine (DOX, > 98 %) provenaient de Sigma‑Aldrich et Shanghai Sangon Biotech. Le milieu APMI 1640 et le sérum fœtal bovin (FBS) étaient obtenus de Hyclone. Tous les réactifs étaient utilisés sans purification supplémentaire.

Préparation de l'oléate de fer

FeCl₃·6H₂O (2,59 g), NaOA (14,6 g), éthanol (32 mL), H₂O (24 mL) et hexane (56 mL) étaient mélangés dans un ballon de 150 mL et refluxés à 70 °C pendant 4 h pour former une solution transparente d'oléate de fer. La couche d'huile était séparée, l'hexane éliminé par évaporation rotative à 70 °C, et le résidu stocké sous vide.

Synthèse des NP Fe₃O₄

Olèate de fer (7,2 g), OA (1,28 mL) et ODE (50 mL) étaient chauffés à 300 °C pendant 40 min sous Ar ; le mélange était ensuite refroidi et oxydé à l'air pendant >12 h. Les nanocristaux étaient précipités avec l'isopropanol, lavés deux fois avec éthanol‑eau (1:1 v/v), et dispersés dans 200 mL de cyclohexane.

Préparation des NC Fe₃O₄

200 µL de NP Fe₃O₄ dans le cyclohexane étaient ajoutés à 4 mL de SDBS aqueux (14 mg). Un traitement ultrasonique (5 min × 4) formait une émulsion solide‑dans‑huile‑dans‑eau. L'agitation à température ambiante pendant 6 h évaporait le cyclohexane, permettant l'auto‑assemblage en NC quasi‑sphériques. Le produit était lavé trois fois à l'eau déionisée.

Préparation des nanostructures hybrides Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX

Les NC Fe₃O₄ (3 mL) étaient d'abord enrobés de PAH (10 g/L, 4 mM NaCl) par addition goutte à goutte et agitation pendant 24 h ; l'excès de PAH était éliminé par centrifugation. Les NC enrobés PAH étaient ensuite enrobés de PSS (10 g/L, 4 mM NaCl) sous conditions identiques, suivi de centrifugation. DOX (5 mg/mL) était ajouté (60 µL) à la solution Fe₃O₄ NC/PAH/PSS (3 mL) et agité pendant 24 h dans le noir. Les nanostructures hybrides finales Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX étaient isolées par centrifugation.

Mesures IRM

Les nanostructures hybrides étaient dispersées dans 1,2 mL d'agarose (1 % p/v) à des concentrations en Fe variant de 0 à 0,065 mM. L'imagerie était réalisée sur un système micro‑IRM Bruker 11,7 T (TR = 300 ms, TE = 4,5 ms, matrice 128 × 128, coupe 1,2 mm, FOV 2,0 × 2,0 cm, 2 moyennes).

Internalisation cellulaire et imagerie IRM

Les cellules A549 étaient incubées avec les nanostructures hybrides (Fe = 0–13,5 µM) pendant 2 h, lavées, et imagerie par IRM pondérée T₂.

Courbe étalon de DOX

La fluorescence de DOX (λ_ex = 490 nm) était mesurée pour concentrations 0–0,03 mg/mL. La régression linéaire donnait Y = 447,44 + 69 745 X (R² = 0,9992).

Chargement et libération de DOX

L'efficacité de chargement était calculée à partir de la différence entre la masse initiale de DOX (W₀) et la masse dans le surnageant (W_s) après centrifugation. La libération cumulative était surveillée dans PBS (pH 5,0 ou 7,4) à 37 °C using une poche de dialyse, prélevant 100 µL toutes les 1–3 h.

Cytotoxicité in vitro

Les cellules A549 étaient ensemencées en plaques 96 puits (8 × 10³ cellules/puits) et traitées avec DOX libre, Fe₃O₄ NC/PAH/PSS, ou Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX (0,1–2,0 µM équivalents DOX). Après 24 h, MTT (5 mg/mL) était ajouté, incubé 4 h, et l'absorbance mesurée à 490 nm.

Caractérisation

La microscopie électronique en transmission (MET, 200 kV) évaluait la morphologie ; la diffusion dynamique de la lumière (DLS) mesurait la taille hydrodynamique et le potentiel ζ ; la spectroscopie UV‑vis déterminait le chargement de DOX ; la spectroscopie de fluorescence surveillait la libération de DOX ; l'ICP‑AES quantifiait le contenu en Fe.

Résultats et discussion

Morphologie et taille des nanostructures

Les images MET révélaient que les NC Fe₃O₄ sont des agrégats quasi‑sphériques (~57 nm, DLS) formés par auto‑assemblage de NP primaires Fe₃O₄ de 15 nm. Le dépôt des couches (PAH, PSS, DOX) était confirmé par les décalages de potentiel ζ : −19,7 mV (NC), +32 mV (NC/PAH), −34 mV (NC/PAH/PSS), +1,9 mV (NC/PAH/PSS/DOX). Les nanostructures hybrides finales présentaient une taille monodispersée d'environ 84 nm (DLS).

Contraste IRM T₂ amélioré

La relaxivité transversale (r₂) était de 651,38 mM⁻¹s⁻¹, surpassant de nombreux agents commerciaux. La relation linéaire 1/T₂ versus concentration en Fe confirmait un contraste T₂ efficace.

Chargement et libération de DOX sensible au pH

Les spectres UV‑vis et de fluorescence confirmaient l'adsorption de DOX. L'efficacité de chargement atteignait 24,4 %. Dans PBS (pH 7,4) seulement ~20 % en poids de DOX était libéré sur 30 h, alors qu'à pH 5,0 ~80 % était libéré en 15 h, démontrant une forte réactivité pH due à la protonation de DOX et la réduction de la liaison électrostatique.

Internalisation cellulaire et cytotoxicité

La microscopie confocale montrait une internalisation temps‑dépendante des hybrides chargés DOX, avec une forte fluorescence rouge après 24 h. Les tests MTT révélaient une cytotoxicité négligeable de Fe₃O₄ NC/PAH/PSS seul (viabilité cellulaire > 85 % à 2 µM). DOX libre et hybrides chargés DOX exhibaient une élimination dose‑dépendante des cellules A549 (IC₅₀ ≈ 1–2 µM). La cytotoxicité accrue des hybrides est attribuée à la libération soutenue de DOX déclenchée par le pH endosomal.

IRM cellulaire

Les hybrides Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX internalisés dans les cellules A549 produisaient une réduction significative du signal T₂, confirmant leur utilité comme agents de contraste IRM cellulaires.

Conclusion

Nous avons conçu des nanostructures hybrides Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX combinant un fort contraste IRM T₂, une libération de DOX déclenchée par pH et une puissante activité antitumoral in vitro. Leur conception modulaire permet une fonctionnalisation supplémentaire (ex. ligands ciblant) pour applications in vivo, les positionnant comme plateformes théranostiques polyvalentes pour l'imagerie et la thérapie du cancer.