Dépôt MAPLE assisté par laser de nanoparticules à conversion ascendante fonctionnalisées par anticorps : amélioration des performances de culture cellulaire

Résumé

Un substrat de culture cellulaire performant repose sur une surface optimale qui soutient la fonction et la communication cellulaires. Des travaux récents montrent que les revêtements nanostructurés peuvent améliorer l'adhésion cellulaire, mais les méthodes conventionnelles en solution introduisent souvent des contaminants. L'évaporation pulsée laser assistée par matrice (MAPLE) offre une voie propre et non destructive pour déposer des biopolymères sur divers substrats. Dans cette étude, nous avons synthétisé des nanoparticules à conversion ascendante (UCNP) de NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ et leurs homologues fonctionnalisés par l'immunoglobuline G (IgG) via une méthode en une seule étape. Les UCNP présentent un diamètre moyen de 50 ± 8 nm, et les images MET confirment la présence d'IgG à leur surface. En utilisant un laser Nd:YAG à 532 nm (10 Hz), nous avons déposé des UCNP — avec et sans IgG — sur des boîtes de culture à fond de verre par MAPLE. Des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) ont ensuite été ensemencées sur ces substrats et comparées à des témoins en verre revêtus de gélatine. Les essais de viabilité cellulaire n'ont révélé aucune cytotoxicité, tandis l'analyse morphologique a montré une amélioration de l'adhésion et de la prolifération sur les deux surfaces revêtues d'UCNP. Ces résultats démontrent que les UCNP déposés par MAPLE et fonctionnalisés par des anticorps peuvent servir de revêtements biocompatibles et performants pour les applications de culture cellulaire.

Introduction

Les cellules épithéliales tapissent les surfaces internes et externes du corps humain, jouant un double rôle de barrière physique et de participant actif aux processus physiologiques tels que la fonction barrière, la signalisation et la défense immunitaire [1]. En ingénierie tissulaire, l'interaction entre les cellules et les surfaces des substrats est un déterminant critique de l'adhésion, de la morphologie et de la fonction cellulaires. Les revêtements protéiques traditionnels — collagène, gélatine, fibronectine — sont employés depuis longtemps pour améliorer l'attachement cellulaire sur le verre ou le plastique. Les avancées récentes montrent que les revêtements nanostructurés peuvent moduler le comportement cellulaire en fournissant des indices topographiques et en augmentant la surface effective, améliorant ainsi l'adhésion et la prolifération [2-4].

Les nanoparticules à conversion ascendante (UCNP) dopées aux ions lanthanides, telles que NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺, présentent une excitation efficace dans le proche infrarouge (NIR) et une émission visible ou NIR, offrant des avantages pour l'imagerie en profondeur et la biosensibilité grâce à leur faible phototoxicité et leur haute photostabilité [5-9]. La fonctionnalisation de surface des UCNP avec des biomolécules — avidine, ADN, anticorps — a permis l'imagerie ciblée, la détection et le marquage cellulaire [19-21]. Cependant, peu de travaux ont exploré les UCNP fonctionnalisés par anticorps comme revêtements de surface pour la culture cellulaire.

Les techniques de dépôt conventionnelles (sol-gel, centrifugation, trempage) souffrent d'une épaisseur non contrôlée, de résidus de solvant et de dénaturation potentielle des biomolécules. La MAPLE contourne ces problèmes en piégeant le matériau cible dans une matrice de solvant gelé ; l'énergie laser est absorbée par la matrice, entraînant un transfert doux du matériau sur le substrat sans ablation directe de la biomolécule [24,25]. La MAPLE a été appliquée dans l'administration de médicaments, l'électronique organique et les revêtements biomédicaux [31-35], mais son impact sur les substrats de culture cellulaire reste peu exploré.

Dans ce travail, nous rapportons la synthèse d'UCNP NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ et de leurs analogues fonctionnalisés par l'IgG, suivie de leur dépôt par MAPLE sur des boîtes de culture à fond de verre. Nous évaluons ensuite la biocompatibilité et l'influence sur le comportement des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), posant les bases pour de futures applications en ingénierie tissulaire.

Matériels et méthodes

Matériaux

Tous les réactifs étaient de grade analytique : Gd(NO₃)₃·6H₂O (99,9 %), Yb(NO₃)₃·5H₂O (99,9 %), Er(NO₃)₃·5H₂O (99,9 %), NaF (≥ 99 %), polyéthylénimine ramifiée (PEI, Mw ≈ 800), anti-IgG humain (spécifique Fab, marqué FITC), DAPI, Phalloïdine-TRITC, et solvants (éthylène glycol, isopropanol). Les matériaux ont été achetés chez Sigma-Aldrich, Fisher Scientific et Caledon.

Synthèse des UCNP avec et sans IgG par un procédé en une seule étape

Les UCNP (NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺) ont été synthétisés via une voie hydrothermale modifiée. En bref, 720 mg Gd(NO₃)₃·6H₂O, 170 mg Er(NO₃)₃·5H₂O, 160 mg Yb(NO₃)₃·5H₂O et 20 mL d'éthylène glycol ont été mélangés dans un ballon à trois cols. 0,7 g de PEI a été ajouté, suivi de l'addition goutte à goutte de 336 mg NaF dissous dans 10 mL d'éthylène glycol. Le mélange a été chauffé à 200 °C sous azote et refluxé pendant 6 h. Le produit a été collecté par centrifugation, lavé à l'éthanol et à l'eau, puis séché à 60 °C.

Pour la fonctionnalisation par l'IgG, 15 mg de poudre d'UCNP ont été dispersés dans 15 mL d'eau distillée, puis 5 mL de tampon borate salin (pH 8) et 20 µg d'IgG ont été ajoutés. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 2 h, puis lavé et pelleté par centrifugation. Le conjugué, UCNP-IgG, a été stocké dans un tampon aqueux.

Schéma de la synthèse en une seule étape des UCNP et UCNP-IgG

Dépôt des UCNP avec/sans IgG par MAPLE

Le dépôt MAPLE a été réalisé avec un système MAPLE 2000 (PVD Products, Inc.) utilisant un laser Nd:YAG à 532 nm. La solution de nanoparticules (1 % p/v dans l'isopropanol) a été gelée dans un porte-cible refroidi à l'azote liquide. Paramètres laser : 10 Hz, largeur d'impulsion 200 µs, fluence 150 mJ cm⁻², surface de spot 0,63 cm². Les substrats en verre, pré-revêtus de 2 % p/v de gélatine, étaient positionnés à 4,5 cm de la cible et maintenus à 25 °C sous 1 × 10⁻⁶ Torr. Les porte-cible et porte-substrat tournaient à 10 et 25 tr/min respectivement pendant un dépôt de 2 h. Les films résultants ont été caractérisés par EDX, FTIR et spectroscopie de photoluminescence (PL).

Schéma du dépôt MAPLE des UCNP et UCNP-IgG

Caractérisation des matériaux

Les UCNP et UCNP-IgG avant dépôt ont été examinés par microscopie électronique à transmission (MET, Philips CM-10, 80 kV). Les spectres infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) ont été enregistrés sur un Bruker Vector 22 (600-4500 cm⁻¹, résolution 4 cm⁻¹, 64 balayages). Les spectres PL ont été mesurés avec un spectrofluoromètre QuantaMaster 40 (Horiba). Les films post-dépôt ont été inspectés par EDX (Hitachi S-3400 N avec INCA PentaFET-x3) et microscopie confocale (Zeiss LSM 5 Duo). La cytocompatibilité a été évaluée par essai MTT sur des HUVEC cultivés pendant 24 h.

Étude du comportement cellulaire

Des HUVEC (ATCC) ont été ensemencés à ~1 × 10⁵ cellules par boîte sur des substrats en verre (témoin gélatine, UCNP, UCNP-IgG). Après 24 h d'incubation à 37 °C, les cellules ont été fixées au formol 4 %, colorées à la Phalloïdine-TRITC (actine) et au DAPI (noyaux), et imagées par microscopie confocale. La surface cellulaire, la longueur de connexion, la longueur cellulaire et le nombre de cellules ont été quantifiés avec ImageJ.

Essai de cytotoxicité

Le MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-tétrazolium bromide) a été ajouté au milieu de culture après 24 h, incubé pendant 3 h, et l'absorbance mesurée à 490 nm avec un lecteur Bio-Tek EL340I. Les expériences ont été réalisées en triplicat.

Résultats et discussion

Caractérisation des UCNP et UCNP-IgG avant dépôt MAPLE

Les images MET confirment la morphologie cubique des UCNP avec un diamètre moyen de 50 ± 8 nm. La MET à haute résolution révèle un espacement de réseau de 0,312 nm, correspondant au plan (111) du NaGdF₄ cubique (JCPDS 27-0697). Après conjugaison à l'IgG, la taille des particules augmente à 54 ± 8 nm, et la couche d'anticorps (~10 ± 5 nm) est visible sous forme de halo périphérique (Fig. 3b).

Micrographies MET des a UCNP et b UCNP-IgG avant dépôt MAPLE

La diffraction des rayons X sur poudre montre des pics caractéristiques à 32°, 37°, 54° et 65° (111, 200, 220, 311), confirmant la phase cubique (Fig. 4).

Profil XRD des nanoparticules à conversion ascendante NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺

Les spectres FTIR révèlent des pics d'amines (1515 cm⁻¹, 1511 cm⁻¹) provenant du PEI et de l'IgG, des étirements -CH₂-/C-C (2987, 2900, 1400 cm⁻¹), et des bandes carboxyle et amide (1249, 1650 cm⁻¹) confirmant la fixation de l'IgG (Fig. 5).

Spectres FTIR des UCNP-IgG et UCNP, respectivement, obtenus par le procédé en une seule étape

Caractérisation des UCNP après dépôt MAPLE

La cartographie EDX des substrats en verre revêtus d'UCNP et d'UCNP-IgG confirme la présence de Gd, Er, Yb et F (Fig. 6a,b). Les mesures PL montrent une émission verte (540 nm) et rouge (650 nm) conservée sous excitation à 980 nm, avec seulement de légères variations d'intensité attribuables à des défauts de surface ou à l'erreur de mesure.

Spectres EDX des a échantillons après traitement MAPLE et b échantillons sans traitement MAPLE (verre nu)

Le FTIR des surfaces revêtues confirme la préservation des groupes fonctionnels : la bande -OH à 3648 cm⁻¹ (IgG) n'apparaît que dans les UCNP-IgG (Fig. 7a), tandis que la bande amine à 1575 cm⁻¹ est évidente dans les UCNP (Fig. 7b). L'absence de ces bandes dans le verre nu (Fig. 7c) souligne le dépôt réussi des couches de nanoparticules.

Spectres FTIR du verre nu et du verre revêtu d'UCNP-IgG et d'UCNP, respectivement

Comportement cellulaire sur les différents revêtements

Les images confocales après 24 h de culture révèlent un nombre de cellules comparable sur toutes les surfaces, mais les surfaces UCNP-IgG présentent un étalement cellulaire plus important, des extensions cytoplasmiques plus longues et une connectivité intercellulaire accrue (Fig. 8). L'analyse quantitative montre des augmentations de 11,2 % et 22,2 % de la surface cellulaire pour les UCNP et UCNP-IgG, respectivement, par rapport aux témoins gélatine ; les longueurs de connexion augmentent de 12,5 % et 17,5 % ; les longueurs cellulaires croissent de 8,2 % et 17,3 % ; et les comptages cellulaires augmentent d'environ 8 % sur les surfaces revêtues de nanoparticules (Fig. 9). Ces métriques confirment que les UCNP et UCNP-IgG améliorent l'adhésion et l'étalement endothéliaux sans induire de cytotoxicité.

Micrographies confocales des HUVEC sur a témoin, b UCNP, et c UCNP modifiés par IgG

HUVEC cultivés sur différents revêtements : a surface cellulaire, b longueur de connexion, c longueur cellulaire, d comptage cellulaire

Effet du revêtement sur la viabilité cellulaire

Les essais MTT démontrent une viabilité relative >99 % sur verre nu, UCNP et UCNP-IgG, dépassant le seuil de >85 % pour les matériaux biocompatibles. La légère augmentation de viabilité (105 % pour UCNP, 104 % pour UCNP-IgG) suggère un effet stimulant modéré des revêtements nanoparticulaires, probablement dû à une rugosité de surface accrue et à l'adsorption de protéines.

Viabilité cellulaire des HUVEC sur verre nu, UCNP, UCNP-IgG et témoin revêtu de gélatine

Conclusions

Nous avons démontré que les UCNP NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ et leurs homologues fonctionnalisés par l'IgG peuvent être synthétisés en un seul procédé hydrothermal et déposés sur des boîtes de culture en verre par MAPLE sans compromettre leur intégrité structurelle ou photoluminescente. MET, FTIR, XRD et EDX confirment la synthèse, la conjugaison et le dépôt réussis. Les essais de biocompatibilité n'ont révélé aucune cytotoxicité, tandis que la microscopie confocale montre une adhésion, un étalement et un réseautage intercellulaire améliorés des HUVEC sur les surfaces revêtues de nanoparticules. Ces résultats positionnent les UCNP fonctionnalisés par anticorps et déposés par MAPLE comme des revêtements prometteurs, à faible contamination, pour les plateformes d'ingénierie tissulaire et de médecine régénérative avancées.

Abréviations

DAPI :

4′,6-Diamidine-2′-phénylindole dihydrochlorure

EG :

Éthylène glycol

HUVEC :

Cellules endothéliales de veine ombilicale humaine

IgG :

Immunoglobuline G

MAPLE :

Évaporation pulsée laser assistée par matrice

PEI :

Polyéthylénimine

Phalloïdine-TRITC :

Phalloïdine-Tétraméthylrhodamine B isothiocyanate

UCNP :

Nanoparticules à conversion ascendante