Capture efficace de chlorin e6 et transfert d'énergie amélioré dans les nanoparticules hybrides PS–PPO–PNIPAM

Résumé

Des nanoparticules de polystyrène (PS) dopées au diphenyloxazole (PPO) et coiffées d'une coquille de poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAM) réticulée forment des nanosystèmes hybrides PS-PPO-PNIPAM (NS). Les études de fluorescence de chlorin e₆ ajouté à ces NS démontrent un transfert d'énergie d'excitation électronique efficace (EEET) à la fois depuis le noyau PS et le PPO incorporé vers l'accepteur chlorin e₆. L'efficacité EEET augmente fortement dans la première heure après l'addition de chlorin e₆, indiquant que le PNIPAM continue d'incorporer le sensibilisateur pendant ce temps. Le chauffage des NS PS-PPO-PNIPAM-chlorin e₆ de 21 °C à 39 °C améliore davantage l'EEET, cohérent avec l'effondrement thermiquement induit du réseau PNIPAM qui raccourcit les distances donneur-accepteur. Néanmoins, seule une fraction modeste de chlorin e₆ libre s'associe au PNIPAM, suggérant qu'une optimisation supplémentaire est nécessaire.

Contexte

La limitation primaire de la thérapie photodynamique (PDT) pour le cancer est la pénétration superficielle de la lumière d'excitation dans les tissus. La thérapie photodynamique pilotée par rayons X (X-PDT) offre une solution, car les rayons X pénètrent profondément et peuvent activer des sensibilisateurs qui génèrent de l'oxygène singulet sous excitation par rayons X. Clé de la X-PDT est un transfert d'énergie d'excitation électronique (EEET) efficace entre un composant scintillant et un sensibilisateur. Les stratégies pour maintenir une proximité donneur-accepteur optimale incluent la conjugaison chimique, l'attraction électrostatique, les couches de surfactant ou les coquilles polymères. Dans un travail précédent, nous avons examiné l'EEET dans des nanoparticules PS-PPO-chlorin e₆, où le chlorin e₆ était attaché au PS-PPO via une coquille de dodécylsulfate de sodium.

Le poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAM) est un polymère sensible aux stimuli qui subit une transition conformationnelle au-dessus de sa température critique de solution inférieure (LCST) de 32 °C, devenant plus hydrophobe et se rétractant. Pour le PNIPAM réticulé, la LCST est plus élevée, permettant des changements de taille pilotés par température aux températures physiologiques. Nous avons fabriqué des nanoparticules PS-PPO enveloppées par une coquille PNIPAM réticulée, produisant des NS hybrides PS-PPO-PNIPAM. Nous avons investigué si cette coquille peut ancrer le chlorin e₆ et si l'effondrement température-dépendant du PNIPAM peut réduire les distances donneur-accepteur, augmentant ainsi l'EEET et l'efficacité de destruction des cellules tumorales.

Expérimental

Matériaux

Le styrène (ST, Ukraine) de qualité p.a. était purifié via des méthodes standard avant polymérisation. L'N-isopropylacrylamide (NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), le N,N'-méthylènebisacrylamide (BIS, Sigma-Aldrich Inc.), le persulfate de potassium (K₂S₂O₈, KPS, Ukraine), le phosphate de sodium monobasique dihydraté (NaH₂PO₄ × 2H₂O, Ukraine) et le surfactant anionique dodécylsulfate de sodium (SDS, Sigma-Aldrich Inc.) étaient de grade réactif et utilisés sans purification supplémentaire. Le chlorin e₆ (Frontier Scientific Inc.) était généreusement fourni par T.Y. Ohulchanskyy (Institute for Lasers, Photonics and Biophotonics, State University of New York at Buffalo). Un tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) servait de solvant.

Synthèse et caractérisation des nanosystèmes

Les nanoparticules cœurs PS-co-PNIPAM dopées au PPO étaient d'abord préparées par polymérisation en microémulsion. Brièvement, 0,2 g NIPAM, 0,2 g SDS et 0,01 g NaH₂PO₄ × H₂O étaient dissous dans 90 g H₂O. Subséquemment, 0,09 g PPO était dissous dans 1,8 g styrène et ajouté goutte à goutte sur 30 min. Le mélange était agité à 700 tr/min, purgé avec Ar pendant 30 min, puis chauffé à 70 °C. 0,01 g K₂S₂O₈ dissous dans 1 mL H₂O initiait la polymérisation. Après 4 h à 70 °C, une étape de réticulation était réalisée en ajoutant 0,69 g NIPAM et 0,06 g BIS en solution aqueuse, suivie de 3 h à 70 °C et 1 h à 90 °C. Le produit était refroidi à température ambiante et dialysé pendant 48 h contre une membrane de cellulose (COPM 3500 Da).

Les images de microscopie électronique à transmission (MET) (Fig. 2) confirment que les NS hybrides consistent en plusieurs cœurs PS-PPO liés par un réseau PNIPAM réticulé.

Mesures spectrales et préparation d'échantillons

Les spectres d'absorption étaient enregistrés avec un spectrophotomètre Specord M40 (Carl Zeiss, Allemagne). Les spectres d'excitation et d'émission de fluorescence étaient obtenus en utilisant un fluorimètre Cary Eclipse (Varian, Australie). Toutes les mesures étaient effectuées dans des cuves de quartz 1 × 1 cm à température ambiante. La solution PS-PPO-PNIPAM était diluée 100 fois dans le tampon Tris-HCl. Un stock de chlorin e₆ 10 mM en DMF était dilué à 1 mM dans le tampon, et une concentration finale de 2 µM de chlorin e₆ était ajoutée à la solution NS (DMF ≤ 0,02 %). Les spectres d'excitation et d'émission de fluorescence étaient collectés à 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 et 100 min après addition, avec saturation atteinte après ≈ 80 min.

Pour les études température-dépendantes, la solution NS avec chlorin e₆ était placée dans un porteur thermostaté (T = 23 °C). Après ≈ 88 min de saturation, l'échantillon était chauffé à 39 °C (au-dessus de la LCST du PNIPAM réticulé). Les spectres d'excitation de fluorescence (émission chlorin e₆ à 680 nm) étaient enregistrés à intervalles après chauffage. La transition conformationnelle du PNIPAM commençait ≈ 3 min après chauffage, avec coagulation survenant après ≈ 18 min — réversible au refroidissement. Les expériences étaient répétées trois fois avec des résultats cohérents.

Résultats et discussion

Les spectres d'absorption, d'excitation de fluorescence et d'émission des NS hybrides PS-PPO-PNIPAM dans le tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) sont montrés en Fig. 3. Le profil d'absorption affiche les bandes styrène (≈ 260 nm) et PPO (≈ 307 nm). L'excitation de fluorescence à 250 nm (absorption styrène) produit une émission PPO à 367 nm, confirmant un EEET quasi-complet du styrène vers le PPO. Le spectre d'excitation du PPO (émission 380 nm) illustre davantage la contribution de la bande styrène. La structure vibrationnelle dans l'émission PPO, absente dans le PPO aqueux, confirme son incorporation dans la matrice PS.

Lors de l'addition de chlorin e₆ (2 µM), son spectre d'absorption reste largement inchangé (Fig. 4), sauf pour une légère réduction de la densité optique de pointe. En contraste, l'addition de chlorin e₆ induit un quenching prononcé de la fluorescence PPO, qui s'intensifie sur environ une heure (Fig. 5). Ce quenching résulte à la fois de l'EEET (transfert d'énergie donneur-accepteur) et de la réabsorption (chevauchement émission donneur-absorption accepteur). Initialement, la réabsorption domine, mais au fil du temps, l'EEET devient le contributeur principal.

L'émission de chlorin e₆ apparaît sous excitation PS à 250 nm, se décalant vers des longueurs d'onde plus longues au fil du temps et atteignant la saturation après ≈ 60 min (Fig. 6). Ce décalage vers le rouge indique l'influence de l'environnement PNIPAM sur les molécules de chlorin e₆ liées. L'excitation à la propre bande Soret du chlorin e₆ (400 nm) produit seulement des changements mineurs dans l'émission, soulignant qu'une petite fraction de chlorin e₆ reste libre en solution.

Le spectre d'excitation du chlorin e₆ (émission à 680 nm) montre une bande PS-PPO faible initialement qui s'intensifie au fil du temps (Fig. 7), reflétant l'augmentation de l'EEET du donneur vers l'accepteur. La bande PS-PPO reste faible dans le spectre d'excitation enregistré à l'émission chlorin e₆ (660 nm) même après 100 min, confirmant que la plupart du transfert d'énergie se produit via le donneur PS-PPO.

Collectivement, ces résultats démontrent que le chlorin e₆ pénètre le réseau PNIPAM, permettant l'EEET du PS et PPO vers le sensibilisateur. L'efficacité EEET augmente pendant la première heure d'incubation et peut être encore améliorée en chauffant le système au-dessus de la LCST du PNIPAM réticulé, qui contracte le réseau polymère et raccourcit les distances donneur-accepteur.

Des études précédentes ont montré que les nanoparticules PS-PPO émettent une fluorescence PPO sous excitation par rayons X, suggérant que l'EEET observé ici sous illumination UV opérerait aussi sous irradiation par rayons X. Cependant, la détection d'émission induite par rayons X nécessite typiquement de hautes concentrations de NP ; l'incorporation de moieties contenant atomes lourds pourrait augmenter l'absorption des rayons X et améliorer la sensibilité.

Dans l'expérience température-dépendante (Fig. 8-9), le chauffage de 23 °C à 39 °C (post-saturation) a d'abord causé une baisse modeste du rapport I_ex320/I_ex404 (de 0,90 à 0,85), reflétant possiblement une affinité chlorin e₆-PNIPAM réduite. Subséquemment, le rapport est monté à 1,02, coïncidant avec une diffusion de lumière accrue — indicative de l'effondrement PNIPAM et d'une proximité donneur-accepteur plus proche, augmentant ainsi l'EEET.

En résumé, les NS hybrides PS-PPO-PNIPAM facilitent la capture de chlorin e₆ et l'EEET, avec une efficacité augmentant sur ~1 h d'incubation et augmentant davantage lors du chauffage au-dessus de la LCST. Néanmoins, seule une fraction limitée de chlorin e₆ se lie au PNIPAM, soulignant le besoin d'optimisation future.

Conclusions

L'analyse de fluorescence confirme que le chlorin e₆ est incorporé dans les NS hybrides PS-PPO-PNIPAM et que l'EEET depuis la matrice PS et le PPO incorporé vers le chlorin e₆ se produit. La capture sature après environ une heure. Le chauffage du système de 21 °C à 39 °C booste davantage l'EEET, cohérent avec l'effondrement piloté thermiquement de la coquille PNIPAM réticulée, qui rapproche donneur et accepteur. Bien qu'une quantité modeste de chlorin e₆ reste liée au PNIPAM, ces résultats soutiennent le potentiel de tels NS hybrides dans la thérapie photodynamique pilotée par rayons X et justifient des études supplémentaires pour améliorer le chargement du sensibilisateur.

Abréviations

EEET:

Transfert d'énergie d'excitation électronique

LCST:

Température critique de solution inférieure

NS:

Nanosystème

PNIPAM:

Poly-N-isopropylacrylamide

PPO:

Diphenyloxazole

PS:

Polystyrène

TEM:

Microscopie électronique à transmission