Nanoparticules d'Oxyhydroxyde de Cuivre Dopées Ligand : Stratégie Antimicrobienne Efficace

Résumé

La résistance bactérienne aux thérapies antimicrobiennes est un problème clinique croissant. Cela est aussi vrai pour applications topiques que thérapie systémique. Topiquement, ions cuivre peuvent être antimicrobiens efficaces et bon marché agissant via multiples voies limitant opportunités bactéries pour résistance. Cependant, chimie cuivre ne se prête pas à formulations faciles libérant ions cuivre à pH biologiquement compatibles. Ici, nous avons développé nanoparticules d'hydroxyde de cuivre adipate tartrate (CHAT) comme matériau bon marché, sûr, aisément synthétisé permettant libération antimicrobienne ions cuivre dans environnement plaie infectée.

Premièrement, nous avons synthétisé CHAT et montré tailles particules aquatées dispersées 2–5 nm et potentiel zêta moyen −40 mV. Ensuite, dilué dans milieu bactérien, CHAT démontré efficacité similaire chlorure cuivre contre Escherichia coli et Staphylococcus aureus, activité dose-dépendante principalement 12,5–50 mg/L cuivre. En effet, à ces niveaux, CHAT se dissout très rapidement et, confirmé par biosenseur cuivre bactérien, montre chargement intracellulaire identique ions cuivre dérivés chlorure cuivre. Cependant, formulé 250 mg/L dans matrice appliquée topiquement, hydroxyéthylcellulose, avantage CHAT sur chlorure cuivre apparent. Premier donna libération rapide soutenue cuivre gamme bactéricide, mais chlorure cuivre, formant précipités insolubles telle concentration et pH, atteignit libération maximum 10 ± 7 mg/L cuivre à 24 h.

Nous fournissons formulation pratique thérapie antimicrobienne topique base cuivre. Études supplémentaires, surtout in vivo, méritées.

Contexte

Infections microbiennes contribuent millions décès globalement [1]. Souvent, inefficacité traitement antimicrobien due résistance microbienne antibiotiques conventionnels [2–5]. Nouveaux antimicrobiens ardemment recherchés. Cuivre longtemps reconnu effets antimicrobiens et potentiel longévité clinique supérieure antibiotiques standards car agit via multiplicité mécanismes contre bactéries, incluant interaction protéines et ADN bactériens, production espèces réactives oxygène (ROS), disruption intégrité membrane [6, 7]. Pour même raison, suggéré potentiel résistance antimicrobienne souches pathogènes bactériennes cuivre et autres métaux limité [7–9]. En outre, cuivre relativement bon marché et faible toxicité humains car essentialité traces assuré évolution contrôle homéostatique strict [10–12]. Usage commun ce métal mesures préventives infection, surtout éviter formation biofilms bactériens surfaces zones haut risque hôpitaux, maisons retraite [13, 14]. En contraste, cuivre n'a pas trouvé usage thérapeutique significatif formulations antimicrobiennes topiques, contrairement argent largement employé [15].

Bactéries sensibles chargement cuivre environnement intracellulaire, efficacité source cuivre liée capacité libérer ions cuivre [16, 17]. Défis significatif antimicrobiens base cuivre : formulation concentrée permettant libération soutenue cuivre antimicrobien concentrations effectives fluides exsudat plaie. Car cuivre ion hydrolytique et concentration augmentée pH formulations topiques typiques (près neutre), tendance hydrolyse former oxyhydroxydes insolubles [18]. pH physiologiques, ces oxyhydroxydes pas bons substrats libération ions cuivre solubles, donc potentiellement efficaces [16, 19, 20].

Récemment, but trouver supplément fer biodisponible, problème libération effective ions ferrique source oxyhydroxyde concentré conditions physiologiques résolu modification structurelle particules primaires. Ce travail, fer précipité présence ligands GRAS dopage cristal, acides adipique et tartrique, pour déstabiliser structure finale oxyhydroxyde ferrique. Cette stratégie avantages (a) prévention agglomération irréversible particules oxyhydroxyde ferrique et (b) augmentation grande labilité (facilité solubilité) conditions physiologiques appropriées. Matériel nommé « fer [oxy-]hydroxyde adipate tartrate » ou IHAT [21, 22]. Par analogie, nous considérons ici si cuivre [oxy-]hydroxyde adipate tartrate (CHAT) pouvait être synthétisé formulé hautes concentrations mais encore libérer ions cuivre niveaux antimicrobiens effectifs. But ce travail : développer processus synthétique bon marché évolutif produisant nanoparticules oxyhydroxyde cuivre qui, contrairement matériaux précédemment rapportés, devraient libérer aisément concentrations biocides ions cuivre environnement plaie simulé.

Ainsi, cette étude, nous avons synthétisé CHAT caractérisé capacité délivrer cuivre biodisponible et démontrer activité antimicrobienne. Concentrés souches Escherichia coli comme espèces « indicateurs » bactéries Gram-négatif [19, 23] mais démontré preuve-principe effets contre Staphylococcus aureus, bactéries Gram-positif souvent obtiennent multirésistance. Étude visait évaluer valeur développement CHAT applications cliniques thérapie antimicrobienne topique.

Méthodes

Sauf indication contraire, toutes expériences effectuées eau ultra-haute pureté (UHP) (osmose inverse ; 18,2 ΩM/cm), température ambiante (20 ± 2 °C), réactifs achetés Sigma Aldrich.

Formulations Cuivre et Nanoparticules CHAT

Solutions mères chlorure cuivre (40 mM cuivre) préparées dissolvant CuCl₂·2H₂O eau. Nanoparticules oxyde cuivre (CuO NPs ; Sigma 544868) solutions mères préparées poudre commerciale exempte impuretés, taille particule primaire 34 nm (intervalle 10–50 nm), précédemment testée agent antimicrobien [24–26]. Solutions mères préparées 1,3 g/L cuivre dispersant poudre eau agitation vigoureuse. Suspensions colloïdales CHAT nanoparticules synthétisées méthode co-précipitation [27]. Brièvement, chlorure cuivre, acide tartrique, acide adipique dissous eau rapport molaire cuivre/acide tartrique/acide adipique suspension finale 2:1:1 concentration cuivre 2,5 g/L. pH initial mélange toujours <2,5, cuivre entièrement solubilisé. pH alors augmenté lentement addition goutte à goutte solution concentrée NaOH (5 M) agitation constante jusqu'à pH 8,2 ± 0,2.

Teneur Cuivre et Distribution Phase Suspensions CHAT

Teneur cuivre suspensions colloïdales déterminée spectrométrie émission optique plasma couplage inductif (ICP-OES, Jobin Yvon 2000, Horiba). Tous échantillons dilués concentrations <100 mg/L 5 % HNO₃ (v/v) au moins 24 h avant analyse assurer solubilité complète cuivre. Étalons calibrage (0,1–100 mg/L cuivre) matrix-matched 5 % HNO₃, quantification cuivre 324,754 nm. Fractionnement cuivre pourcentages aggloméré, nanoparticulaire, soluble réalisé filtration ultrafiltration stocks CHAT. Suspensions filtrées (coupure 200 nm), rétentat considéré fraction agglomérée. Isoler cuivre soluble distinguer nanoparticulaire, suspension colloïdale ultrafiltrée filtre 3 KDa (Sartorius Vivaspin 500 VS0192 ; 16 000×g, 5 min) correspondant coupure <1 nm (Zetasizer Software 7.11, Malvern Instruments Ltd). Teneur cuivre toutes fractions (total, filtrat 200 nm, ultrafiltrat 3 KDa) déterminée ICP-OES, fractions exprimées pourcentage relation teneur totale cuivre :

$$ {\displaystyle \begin{array}{l}\%\mathrm{Soluble}\ \mathrm{Cuivre}\ \left(<1\mathrm{nm}\right)\%\kern0.5em =\frac{\kern0.5em {Cu}_{3\mathrm{KDa}}}{Cu_{\mathrm{Total}}}\times 100\\ {}\%\mathrm{Agglomerated}\ \mathrm{Cuivre}=\frac{\ {Cu}_{\mathrm{Total}}-{Cu}_{<200\mathrm{nm}}\kern0.5em }{Cu_{\mathrm{Total}}}\kern0.5em \times 100\\ {}\%\mathrm{Nanoparticulate}\kern0.5em \mathrm{Cuivre}\kern0.5em =100-\%\mathrm{Agglomerated}\ \mathrm{copper}-\%\mathrm{Soluble}\ \mathrm{copper}\end{array}} $$

Détermination Teneur Cuivre et Ratios Cuivre/Ligand Nanoparticules CHAT Sèches

Nanoparticules CHAT agglomérées précipitées permettre récupération élimination composants non liés. Éthanol ajouté suspensions colloïdales CHAT (2,5 g/L cuivre) ratio 2:1 éthanol/suspension (v/v), agglomérats CHAT résultants récupérés centrifugation (4500×g × 15 min Mistral 6000). Phase solution, contenant ligands non liés, éliminée. Détermination teneur cuivre solide CHAT : poudre produite séchage four pellet éthanol précipité poids constant 45 °C. Broyée 35,2 ± 0,3 mg (n = 2) digérée 11 ± 1 g 70 % HNO₃, poids précis enregistrés. Une fois digestion complète, solution diluée 20 fois eau concentration cuivre déterminée ICP-OES. Ratios cuivre/ligand déterminés directement agglomérats CHAT séchés précipités éthanol. Agglomérats d'abord resuspendus eau volume original faciliter dissolution moindres quantités HCl — exigence chromatographie liquide haute performance (HPLC) analyse. Aliquotes soit dissous 5 % HNO₃ analyse ICP-OES cuivre (décrit ci-dessus) soit 80 mM HCl analyse HPLC ligands (acides tartrique adipique). Analyse ligands système chromatographie phase inverse standard (colonne C18 Waters Alliance 2690/5 détecteur 2998 PDA ; détails Fichier additionnel 1).

Caractérisation Physicochimique Suspensions CHAT

Distribution taille particule hydrodynamique déterminée diffusion lumière dynamique (DLS ; Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd). Aliquotes suspensions colloïdales CHAT (2,5 g/L cuivre) transférées cuvette 1 mL jetable, mesures (n = 3) 25 ± 2 °C. Potentiel zêta suspensions CHAT déterminé micro-électrophorèse Doppler laser (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd) cellules capillaires pliées jetables (DTS1070) assumant constante diélectrique 78,5 viscosité 0,89 cP. Caractérisation microscopie électronique transmission (MET) goutte suspension CHAT grilles carbone perforé séchage 50 °C nuit. Grilles imagerie MET (FEI-Philips CM100) 120 kV mode champ clair.

Activité Antimicrobienne Formulations Cuivre

Essais menés milieu MOPS métaux lourds (HMM), milieu reconnu compatible ions métalliques (Fichier additionnel 3), supplémenté 0,4 % glucose 0,1 % caséine hydrolysat acide, pH ajusté 7,2 ± 0,2 [28]. Avant addition composés cuivre, Escherichia coli (NCTC11100) et Staphylococcus aureus RN4220 [29] cultivés overnight 30 °C agitation constante incubateur Infors HT Minitron 80 tr/min. Après, suspensions bactériennes diluées densité optique 0,05–0,1 (ca. 10⁶ cellules/mL) 595 nm E. coli (Multiskan RC 351 Labsystem) ou 600 nm S. aureus (Multiskan plaque lecteur, ThermoFisher Scientific). Ensuite, solutions mères chlorure cuivre et CHAT colloïdal diluées HMM ajoutées suspensions bactériennes obtenir concentrations finales cuivre entre 0,4 et 100 mg/L. Incubation 6–9 h, croissance bactérienne déterminée surveillance densité optique mesure biomasse bactérienne.

Solubilité cuivre temps milieu croissance bactérienne déterminée diluant chlorure cuivre et CHAT colloïdal stocks HMM 12,5, 25, 50 mg/L cuivre déterminant fraction cuivre soluble 0, 2, 4, 8 h ultrafiltration (3 KDa) analyse ICP-OES, comme décrit.

Biodisponibilité Intracellulaire Formulations Cuivre

Bactéries bioluminescentes recombinantes senseur Cu, E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), répondant quantités sous-toxiques cuivre biodisponible augmentant bioluminescence utilisées quantifier biodisponibilité composés cuivre [30]. Suspensions bactériennes préparées comme essai activité antimicrobienne incubées série dilutions chlorure cuivre CHAT (0–50 mg/L cuivre) plaques 96 puits 4 h. Bioluminescence mesurée luminomètre plaque Orion II (Berthold Detection Systems), induction bioluminescence calculée :

$$ Bioluminescence\ induction, Fold\ Change=\frac{ Bioluminescence\ in\ Cu\ exposure}{Bioluminescence\ without\ Cu } $$

Stress Intracellulaire Induit Formulations Cuivre

Capacité composés cuivre induire anions superoxyde intracellulaires et brins simple ADN évaluée bactéries bioluminescentes recombinantes, E. coli K12::soxRSsodAlux et E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) respectivement [17]. Cultures bactériennes préparées comme essai antimicrobien, bactéries exposées série dilutions chlorure cuivre CHAT (0–50 mg/L cuivre) plaques 96 puits blanches 4 h. Performances biosenseurs contrôlées exposant bactéries chimique inducteur anions superoxyde ménadione (0,04–30 µg/L), ou peroxyde hydrogène (0,1–150 mg/L), contrôles positifs E. coli K12::soxRSsodAlux ou E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) respectivement. Bactéries incubées plaques 96 puits blanches bioluminescence mesurée Orion II induction bioluminescence calculée Éq. 5.

Incorporation Formulations Cuivre Gels Hydroxyéthylcellulose

Solutions mères chlorure cuivre, CHAT, nanoparticules CuO commerciales non modifiées diluées eau UHP 250 mg/L cuivre. Suspensions résultantes CHAT CuO NPs pH quasi neutre incorporées directement gel, mais solution chlorure cuivre encore acide après dilution ajustée pH 7,0 ± 0,2. Hydroxyéthylcellulose (HEC) dissoute directement (2 % p/v) diverses solutions mères diluées mélangeur rouleau (Denley Spiramix 5) jusqu'à gels homogènes formés. Dix grammes chaque gel transférés tubes Falcon laissés reposer nuit. Ensuite, 10 mL tampon bicarbonate sodium 50 mM fraîchement préparé (dissous poudre NaHCO₃ pH ajusté 7,0 ± 0,2) transférés chaque tube soin minimiser perturbations interface gel-liquide (surface spécifique 7,1 cm²). Aliquotes prélevées analysées ICP-OES déterminer libération cuivre temps.

Résultats

Comme décrit section « Méthodes », CHAT synthétisé façon similaire analogue fer IHAT [21, 22], dopant oxyhydroxyde cuivre (2,5 g/L cuivre) acides tartrique adipique. Produit suspensions colloïdales stables tout cuivre passait filtre 200 nm mais très peu (5 %) filtre 3 KDa. Indiquait plupart cuivre nanoparticulaire (95 % ; Fig. 1a) peu cuivre « libre » pas agglomérats gros détectables — encore analogue IHAT [21, 22]. Précipité éthanol, éliminer ligands non liés, séché, CHAT contenait 31 ± 1 % cuivre (p/p) analyse ICP-OES. Ratios molaire cuivre/ligand, ce dernier déterminé HPLC, 2:1 cuivre/tartrate 2:0,3 cuivre/adipate. Particules CHAT apparaissaient quasi monodisperses diamètres 2–3 nm imagerie MET (Fig. 1b). Conclusions cohérentes données dimensionnement hydrodynamique CHAT plus coquille hydratation diamètre médian volume 3,4 nm eau UHP (Fig. 1c) distribution étroite (2,4–5,6 nm 80 % volume) évaluée diffusion lumière dynamique. Potentiel zêta moyen −39 mV (Fig. 1d), cohérent nanoparticules formant dispersion aquatée stable [27], et stock suspension CHAT stable plusieurs années (Fichier additionnel 4).

Ensuite, activité antimicrobienne CHAT stocks dilués milieux croissance bactérienne concentrations associées activité antimicrobienne sels cuivre. CHAT et chlorure cuivre, courbe inhibition croissance très similaire E. coli et S. aureus plupart activité concentrations totales cuivre entre 12,5 et 50 mg/L (Fig. 2). Inhibition complète croissance E. coli observée incubation 18,8 (CuCl₂) et 25 (CHAT) mg/L cuivre, tandis S. aureus, inhibition complète croissance obtenue 75 (CuCl₂) et 100 (CHAT) mg/L cuivre (Fig. 2 ; Pourcentage inhibition croissance vs concentration cuivre Fichier additionnel 5).

En effet, concentrations antimicrobiennes, au moins 94 % CHAT rapidement solubilisé (dans 15 min), encore jugé ultrafiltration analyse ICP-OES (Fig. 3a). Nous anticipions efficacité antimicrobienne CHAT liée labilité chimique, dissolution rapide nanoparticules permettant acquisition intracellulaire bactérienne ions cuivre. Testé, nous défié senseur Cu E. coli, MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), bioluminescence augmente réponse concentrations sous-toxiques ions cuivre intracellulaires [30], avec 0–50 mg/L cuivre CHAT ou chlorure cuivre. Concentrations croissantes milieu culture deux sources cuivre menèrent bioluminescence croissante senseur cuivre E. coli (Fig. 3b), cohérent hausses cuivre intracellulaire. Pente courbe dose-réponse identique jusqu'à 6,25 mg/L deux sources cuivre confirmant cuivre biodisponible CHAT comparable source entièrement solubilisée. Par la suite, concentrations jusqu'à 50 mg/L cuivre, luminescence n'augmenta pas dû toxicité deux composés cuivre (Fig. 3b).

Parallèle étude cuivre intracellulaire E. coli exposé solutions préparées CHAT ou chlorure cuivre, nous testâmes capacité ces solutions déclencher anions superoxyde intracellulaires ou causer dommages ADN bactériens différents biosenseurs E. coli-basés. Aucun cas effet significativement observable, malgré capteurs répondant contrôles positifs pertinents, peroxyde hydrogène et ménadione respectivement (Fig. 3c, d). Ensemble, réponses équivalentes trois biosenseurs bactériens solutions préparées différentes formes chimiques cuivre soutiennent fortement notion que, deux cas, bactéries exposées même cuivre soluble, malgré une formulation partant nanoparticulaire.

Enfin, avantage CHAT sels cuivre solubles apparent seulement si formulation concentrée permet premier retenir labilité chimique contrairement second. Utilisant hydroxyéthylcellulose (HEC), base aqueuse courante formulations topiques [31–33], incorporé 250 mg/L cuivre soit chlorure cuivre, CHAT, ou CuO NPs commerciaux. Quand 10 mL tampon 50 mM NaHCO₃, exsudat plaie simplifié, ajoutés 10 g chaque gel HEC incorporé cuivre (2,5 mg cuivre), libération soutenue cuivre préparation CHAT, >60 mg/L 24 h (Fig. 4). Libération relativement rapide concentrations antimicrobiennes actives atteintes 2–4 h. Contraste, chlorure cuivre pH-neutralisé pauvre substrat libération cuivre, anticipé tendance hydrolyse former agglomérats oxyhydroxydes cuivre, donc 24 h seulement 10 ± 7 mg/L cuivre solution (Fig. 4). CuO NPs commerciaux aucune libération cuivre discernable (Fig. 4).

Discussion

Nous montrons ici nanomatériau base cuivre, CHAT, peut être formulé hautes concentrations, contrairement nanoparticules base cuivre précédemment décrites [34, 35], retenant propriétés source labile cuivre biodisponible efficacité antimicrobienne. Synthèse CHAT inspirée années travail antérieur analogue fer IHAT [21, 22]. Ce dernier inspiré solution nature rotation rapide minéraux in vivo, recyclage efficace ions métalliques essentiels, molécules organiques utilisées déstabiliser structure cristalline particules minérales primaires [21, 22]. Versions synthétiques, ligands GRAS incorporés méta oxyhydroxydes forment solution polymères réticulés [21, 22]. Par déstabilisation structurelle, assure labilité phase minérale finale et génère nanoparticules hautement négatives — démontré mesure potentiel zêta — repoussent agglomération agrégation, produisant suspensions nanoparticules stables années. Ici, et comme précédemment montré IHAT, tartrate ligand dominant réalisant changements physicochimiques structure oxyhydroxyde cuivre incorporation ~3 fois supérieure adipate — ce dernier se comportant plus tampon synthèse [21, 22].

Absence modification, oxyhydroxydes métalliques fraîchement précipités agglomèrent agrègent commencent vieillir, se condensent augmentent progressivement cristallinité. Transitions taille phase minérale réduisent capacité structures participer réaction inverse, i.e. re-dissoudre. Pas surprenant quand oxyhydroxyde cuivre fraîchement formé, neutralisation pH solution chlorure cuivre, au moins cuivre soluble libéré essai libération gel (Fig. 4), alors CuO NPs commerciaux, agglomérés phase minérale plus condensée (oxyde cuivre), cuivre indétectable libéré. Manque dissolution commerciaux nanoparticules 30 nm — indépendamment état agrégation, présenteraient grande surface dissolution — montre phase minérale pilote clé libération ions cuivre et, comme noté, modification particules primaires minéral, réalisée ici dopage ligand, vraiment requise apporter changement marqué caractéristiques dissolution. De plus, synthèse CHAT température ambiante, température synthèse élevée favorise phases moins amorphes qui peuvent réduire taux dissolution. Synthèse température ambiante bénéfice réduire coûts énergétiques fabrication échelle.

Bien qu'autres façons formuler hautes concentrations stables cuivre permettant libération soutenue dissolution rapide ions requises, nous ne pouvons envisager autre synthèse si simple et coût matières (réactifs) si bas. Facteurs importants car infections topiques résistance bactérienne pas restreintes pays développés. Pays développement de plus en plus fléau résistance bactérienne solutions abordables efficaces urgentes [36, 37]. Bien qu'études insuffisantes solutions concrètes, preuves résistance ions métaux toxiques plus difficile bactéries atteindre résistance antibiotiques conventionnels [7]. Théorie prédidée idée cuivre argent probablement pas voies discrètes activité antimicrobienne mais plutôt impact multiples cibles incluant divers systèmes enzymatiques déstabiliser structure globale cellule bactérienne [17, 19, 38]. Démontré bactéries restent sensibles cuivre certains autres ions métaux malgré expositions siècles [6, 7, 39]. Intéressant, preuves récentes antimicrobiens base métaux peuvent même restaurer sensibilité bactérienne antibiotiques conventionnels malgré résistance antérieure [40, 41].

Conclusions

Ici, nous avons démontré que problème ions cuivre biodisponibles, pH physiologiques hautes concentrations, peut être résolu dopant nanominéral cuivre acides organiques, stratégie similaire utilisée analogues fer [21, 22]. Ces nanoparticules base cuivre (termes CHAT) se dissolvent aisément milieu bactérien, montrant absorption intracellulaire cuivre équivalente activité antibactérienne sels cuivre solubles. Critiquement, cependant, contrairement sels cuivre simples, CHAT peut être concentré formulation pH-neutre retenant labilité libération ions cuivre. En effet, CHAT libère ions cuivre gamme bactéricide pourrait base nouvel agent antimicrobien topique novel seul ou améliorant efficacité antibiotiques résistants. Résistance antibiotiques croissante, nouveaux antimicrobiens topiques nécessaires CHAT peu coûteux, aisément synthétisé, composants généralement reconnus sûrs (GRAS). Études in vivo méritées.

Abréviations

CHAT:

Nanoparticules cuivre [oxy-]hydroxyde adipate tartrate

CuO NPs:

Nanoparticules oxyde cuivre

DLS:

Diffusion lumière dynamique

Escherichia coli :

E. coli

GRAS:

Généralement reconnu sûr

HEC:

Hydroxyéthylcellulose

HMM:

Milieu MOPS métaux lourds

HPLC:

Chromatographie liquide haute performance

ICP-OES:

Spectrométrie émission optique plasma couplage inductif

IHAT:

Nanoparticules fer [oxy-]hydroxyde adipate tartrate

MOPS:

3-(N-morpholino) propanesulfonique acide

Staphylococcus aureus :

S. aureus

UHP:

Ultra-haute pureté