Les nanoparticules d'oxohydroxyde de cuivre dopé au ligand sont des antimicrobiens efficaces

Contexte

Les infections microbiennes contribuent à des millions de décès dans le monde [1]. Souvent, l'inefficacité d'un traitement antimicrobien est due à la résistance microbienne aux antibiotiques conventionnels [2,3,4,5]. En tant que tels, de nouveaux antimicrobiens sont recherchés avec impatience. Le cuivre est reconnu depuis longtemps pour ses effets antimicrobiens et peut avoir le potentiel d'une plus grande longévité clinique que les antibiotiques standard car il semble agir via une multiplicité de mécanismes contre les bactéries, y compris l'interaction avec les protéines bactériennes et l'ADN, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) , et la rupture de l'intégrité membranaire [6, 7]. Pour la même raison, il est suggéré que le potentiel de résistance antimicrobienne des souches bactériennes pathogènes au cuivre et à d'autres métaux est limité [7,8,9]. De plus, le cuivre est relativement bon marché et peu toxique pour l'homme puisque son caractère essentiel à l'état de traces a assuré l'évolution d'un contrôle homéostatique strict [10,11,12]. Il existe donc une utilisation courante de ce métal pour des mesures préventives contre les infections, principalement pour éviter la formation de biofilm bactérien sur les surfaces dans les zones à haut risque telles que les hôpitaux et les maisons de retraite [13, 14]. En revanche, le cuivre n'a pas trouvé d'utilisation thérapeutique significative dans les formulations antimicrobiennes topiques, contrairement à l'argent qui est largement utilisé [15].

Les bactéries sont sensibles à la charge de cuivre dans leur environnement intracellulaire, et l'efficacité d'une source de cuivre est liée à sa capacité à libérer des ions cuivre [16, 17]. À cet égard, un défi important pour les antimicrobiens à base de cuivre est la réalisation d'une formulation concentrée qui permet la libération prolongée de cuivre antimicrobien à des concentrations efficaces dans des fluides tels que l'exsudat de la plaie. En effet, le cuivre est un ion métallique hydrolytique et, à mesure que sa concentration augmente au pH des formulations topiques typiques (c'est-à-dire presque neutre), sa tendance à induire une hydrolyse et à former des oxo-hydroxydes insolubles augmente également [18]. Aux pH physiologiques, ces oxo-hydroxydes ne sont pas de bons substrats pour la libération d'ions cuivre solubles ou donc potentiellement efficaces [16, 19, 20].

Récemment, dans le but de trouver un supplément de fer biodisponible, le problème de la libération efficace d'ions ferriques à partir d'une source d'oxo-hydroxyde concentrée dans des conditions physiologiques a été résolu par une modification structurelle des particules primaires. Dans ce travail, le fer a été précipité en présence de ligands GRAS à dopage cristallin, à savoir les acides adipique et tartrique, pour déstabiliser délibérément la structure finale de l'oxo-hydroxyde ferrique. Cette stratégie avait l'avantage de (a) empêcher l'agglomération irréversible des particules d'oxo-hydroxyde ferrique et (b) d'augmenter considérablement leur labilité (facilité de solubilité) dans des conditions physiologiques appropriées. Ce matériau a été appelé « fer [oxo-] hydroxyde adipate tartrate » ou IHAT [21, 22]. Par analogie, nous avons examiné ici si le cuivre [oxo-] hydroxyde adipate tartrate (CHAT) pouvait être synthétisé et formulé à des concentrations élevées tout en libérant des ions cuivre à des niveaux antimicrobiens efficaces. En particulier, l'objectif de ce travail était de développer un processus synthétique bon marché et évolutif qui produit des nanoparticules d'oxo-hydroxyde de cuivre qui, contrairement aux matériaux précédemment rapportés, devraient facilement libérer des concentrations biocides d'ions cuivre dans un environnement de plaie simulée.

Ainsi, dans cette étude, nous avons synthétisé le CHAT et caractérisé sa capacité à fournir du cuivre biodisponible et, par conséquent, à démontrer une activité antimicrobienne. Nous nous sommes concentrés sur les souches d'Escherichia coli comme espèce « indicateur » pour les bactéries Gram-négatives [19, 23] mais ont en outre démontré des effets de preuve de principe contre Staphylococcus aureus , en tant que bactéries Gram-positives qui obtiennent souvent une multirésistance aux médicaments. Par conséquent, l'étude visait à évaluer la valeur du développement de CHAT pour des applications cliniques dans le traitement antimicrobien topique.

Méthodes

Sauf indication contraire, toutes les expériences ont été réalisées avec de l'eau ultra-haute pureté (UHP) (purification par osmose inverse ; 18,2 ΩM/cm), à température ambiante (20 ± 2 °C) et tous les réactifs ont été achetés auprès de Sigma Aldrich.

Formulations de cuivre et nanoparticules CHAT

Des stocks de chlorure de cuivre (40 mM de cuivre) ont été préparés en dissolvant du CuCl₂ ·2H₂ O dans l'eau. Des stocks de nanoparticules d'oxyde de cuivre (CuO NPs ; Sigma 544868) ont été préparés à partir d'une poudre commerciale exempte d'impuretés, ayant une taille de particule primaire de 34 nm (plage de 10 à 50 nm) et préalablement testée en tant qu'agent antimicrobien [24, 25,26]. Ces stocks ont été préparés à 1,3 g/L de cuivre en dispersant la poudre dans l'eau sous agitation vigoureuse. Des suspensions colloïdales de nanoparticules CHAT ont été synthétisées en utilisant une méthode de co-précipitation [27]. En bref, du chlorure de cuivre, de l'acide tartrique et de l'acide adipique ont été dissous dans de l'eau pour obtenir un rapport molaire cuivre/acide tartrique/acide adipique dans la suspension finale de 2:1:1 et une concentration en cuivre de 2,5 g/L. Le pH initial du mélange était toujours inférieur à 2,5 et le cuivre était totalement solubilisé. Le pH a ensuite été lentement augmenté par une addition goutte à goutte d'une solution concentrée de NaOH (5 M) sous agitation constante jusqu'à pH 8,2 ± 0,2.

Contenu en cuivre et répartition des phases des suspensions de CHAT

La teneur en cuivre des suspensions colloïdales a été déterminée par spectrométrie d'émission optique plasma à couplage inductif (ICP-OES, Jobin Yvon 2000, Horiba). Tous les échantillons ont été dilués jusqu'à des concentrations inférieures à 100 mg/L dans 5 % de HNO₃ (v /v ) au moins 24 h avant l'analyse pour garantir la pleine solubilité du cuivre. Les étalons d'étalonnage (0,1 à 100 mg/L de cuivre) ont été appariés en matrice dans 5 % de HNO₃ , et la quantification du cuivre a été effectuée à 324,754 nm. Le fractionnement du cuivre en pourcentages de cuivre aggloméré, nanoparticulaire et soluble a été obtenu par filtration et ultrafiltration des stocks de CHAT. Les suspensions ont été filtrées (seuil de 200 nm) et le rétentat a été considéré comme la fraction agglomérée. Afin d'isoler le cuivre soluble et de le distinguer du cuivre nanoparticulaire, la suspension colloïdale a été ultrafiltrée à travers un filtre 3-KDa (Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16 000×g , 5 min) car cela correspond à une coupure inférieure à 1 nm (Zetasizer Software 7.11, Malvern Instruments Ltd). La teneur en cuivre de toutes les fractions (total, filtrat 200 nm, ultrafiltrat 3 KDa) a été déterminée par ICP-OES, et les fractions exprimées en pourcentage par rapport à la teneur totale en cuivre sont les suivantes :

Détermination de la teneur en cuivre et des rapports cuivre/ligand dans les nanoparticules CHAT sèches

Les nanoparticules CHAT ont été agglomérées et précipitées pour permettre la récupération et l'élimination des composants non liés. Pour permettre cela, de l'éthanol a été ajouté aux suspensions colloïdales de CHAT (2,5 g/L de cuivre) à un rapport de 2 : 1 éthanol/suspension (v /v ), et les agglomérats de CHAT résultants ont été récupérés par centrifugation (4500×g × 15 min dans un Mistral 6000). La phase de solution, contenant des espèces de ligand non liées, a été rejetée. La détermination de la teneur en cuivre dans le CHAT en phase solide était la suivante. Une poudre a été produite en séchant au four la pastille précipitée à l'éthanol jusqu'à poids constant à 45 °C. Celui-ci a ensuite été broyé et 35,2 ± 0,3 mg (n = 2) a été digéré dans 11 ± 1 g de HNO à 70 %₃ , avec des poids précis enregistrés. Une fois complètement digérée, cette solution a été diluée 20 fois dans de l'eau et la concentration en cuivre déterminée par ICP-OES. Les rapports ligand/cuivre ont été déterminés directement à partir d'agglomérats de CHAT séchés et précipités à l'éthanol. Les agglomérats ont d'abord été remis en suspension dans l'eau jusqu'à leur volume d'origine pour faciliter la dissolution avec des quantités inférieures de HCl, une exigence pour l'analyse par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Les aliquotes ont été soit dissoutes dans 5% de HNO₃ pour l'analyse ICP-OES du cuivre (comme décrit ci-dessus) ou dans du HCl 80 mM pour l'analyse HPLC des ligands (acides tartrique et adipique). L'analyse du ligand a été réalisée dans un système de chromatographie en phase inverse standard (colonne C18 dans un Waters Alliance 2690/5 équipé d'un détecteur PDA 2998 ; plus de détails sont fournis dans le fichier supplémentaire 1).

Caractérisation physico-chimique des suspensions CHAT

La distribution hydrodynamique de la taille des particules a été déterminée par diffusion dynamique de la lumière (DLS; Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd). Des aliquotes de suspensions colloïdales CHAT (2,5 g/L de cuivre) ont été transférées dans une cuvette jetable de 1 mL, et les mesures (n = 3) ont été effectués à 25 ± 2 °C. Encore une fois, les paramètres exacts sont indiqués dans le fichier supplémentaire 2. Le potentiel zêta des suspensions CHAT a été déterminé par microélectrophorèse laser Doppler (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd) en utilisant des cellules capillaires pliées jetables (DTS1070) et en supposant une constante diélectrique de 78,5 et une viscosité de 0,89 cP. La caractérisation par microscopie électronique à transmission (MET) a été réalisée en appliquant une goutte de suspension de CHAT sur des grilles perforées en carbone perforé et en séchant à 50 °C pendant la nuit. Les grilles ont ensuite été imagées sur le TEM (FEI-Philips CM100) à 120 kV en mode fond clair.

Activité antimicrobienne des formulations de cuivre

Les dosages ont été effectués dans un milieu MOPS aux métaux lourds (HMM), un milieu reconnu compatible avec les ions métalliques (Fichier supplémentaire 3), qui a été complété par 0,4 % de glucose et 0,1 % d'hydrolysat acide de caséine, et le pH a été ajusté à 7,2 ± 0,2 [28] . Avant l'ajout de composés de cuivre, Escherichia coli (NCTC11100) et Staphylococcus aureus Les RN4220 [29] ont été cultivés pendant une nuit à 30 °C sous agitation constante dans un incubateur Infors HT Minitron à 80 tr/min. Ensuite, les suspensions bactériennes ont été diluées à une densité optique de 0,05 à 0,1 (environ 10 ⁶ cellules/mL) à 595 nm pour E. coli ( Multiskan RC 351 Labsystem) ou 600 nm pour S. aureus (Lecteur de plaques Multiskan, ThermoFisher Scientific). Ensuite, des stocks de chlorure de cuivre et de CHAT colloïdal ont été dilués dans du HMM et ajoutés aux suspensions bactériennes pour obtenir des concentrations finales de cuivre comprises entre 0,4 et 100 mg/L. L'incubation a ensuite eu lieu pendant une période de 6 à 9 h, et la croissance bactérienne a été déterminée en surveillant la densité optique en tant que mesure de la biomasse bactérienne.

La solubilité du cuivre au fil du temps dans le milieu de croissance bactérienne a été déterminée en diluant du chlorure de cuivre et des stocks colloïdaux de CHAT dans du HMM à 12,5, 25 et 50 mg/L de cuivre et en déterminant la fraction de cuivre soluble à 0, 2, 4 et 8 h par ultrafiltration (3 KDa) et analyse ICP-OES, comme décrit ci-dessus.

Biodisponibilité intracellulaire des formulations de cuivre

Bactéries bioluminescentes recombinantes sensibles au Cu, E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), qui répondent à des quantités subtoxiques de cuivre biodisponible en augmentant leur bioluminescence ont été utilisés pour quantifier la biodisponibilité des composés du cuivre [30]. Des suspensions bactériennes ont été préparées comme décrit pour le test d'activité antimicrobienne et incubées avec une série de dilutions de chlorure de cuivre et de CHAT (0 à 50 mg/L de cuivre) sur des microplaques à 96 puits pendant 4 h. La bioluminescence a été mesurée avec un luminomètre à plaque Orion II (Berthold Detection Systems), et l'induction de la bioluminescence a été calculée comme suit :

Stress intracellulaires induits par les formulations de cuivre

La capacité des composés de cuivre à induire des anions superoxydes intracellulaires et des cassures d'ADN simple brin a été évaluée avec des bactéries bioluminescentes recombinantes, E. coli K12::soxRSsodAlux et E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), respectivement [17]. Les cultures bactériennes ont été préparées comme décrit pour le test antimicrobien, et les bactéries ont été exposées à une série de dilutions de chlorure de cuivre et de CHAT (0 à 50 mg/L de cuivre) sur des microplaques blanches à 96 puits pendant 4 h. Les performances des biocapteurs ont été contrôlées en exposant les bactéries à la ménadione chimique induisant des anions superoxydes (0,04-30 μg/L), ou au peroxyde d'hydrogène (0,1-150 mg/L), comme témoins positifs pour E. coli K12::soxRSsodAlux ou E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), respectivement. De nouveau, les bactéries ont été incubées sur des microplaques blanches à 96 puits et la bioluminescence a été mesurée avec un luminomètre à plaque Orion II et l'induction de la bioluminescence a été calculée comme dans l'Eq. 5.

Incorporation de formulations de cuivre dans des gels d'hydroxyéthylcellulose

Des stocks de chlorure de cuivre, de CHAT et de nanoparticules d'oxyde de cuivre commerciales non modifiées (CuO NP) ont été dilués dans de l'eau UHP à 250 mg/L de cuivre. Les suspensions résultantes de CHAT et CuO NPs étaient à un pH proche de la neutralité et pouvaient être incorporées directement dans le gel, mais la solution de chlorure de cuivre était encore acide après dilution et a donc été ajustée à un pH de 7,0 ± 0,2. L'hydroxyéthylcellulose (HEC) a ensuite été dissoute directement (2% w /v ) dans les différentes souches diluées à l'aide d'un mélangeur à rouleaux (Denley Spiramix 5) jusqu'à formation de gels homogènes. Dix grammes de chaque gel ont été transférés dans des tubes Falcon et laissés reposer pendant une nuit. Ensuite, 10 mL de tampon de bicarbonate de sodium 50 mM fraîchement préparé (dissous à partir de NaHCO₃ poudre et ajusté à pH 7,0 ± 0,2) a été transféré dans chaque tube avec soin pour minimiser les perturbations à l'interface gel-liquide (surface spécifique de 7,1 cm ² ). Des aliquotes ont ensuite été collectées et analysées par ICP-OES pour déterminer la libération de cuivre au fil du temps.

Résultats

Comme décrit dans la section « Méthodes », CHAT a été synthétisé de la même manière que son analogue du fer, IHAT [21, 22], en dopant l'oxo-hydroxyde de cuivre (2,5 g/L de cuivre) avec des acides tartrique et adipique. Cela produisait des suspensions colloïdales stables dans lesquelles tout le cuivre passait à travers un filtre de 200 nm mais très peu (5 %) passaient un filtre de 3 KDa. Cela indiquait que la plupart du cuivre était nanoparticulaire (95 % ; Fig. 1a) avec peu de cuivre « libre » et aucun gros agglomérat détectable, encore une fois comme l'analogue IHAT [21, 22]. Lorsqu'il est précipité dans l'éthanol, pour éliminer les espèces de ligands non liés, puis séché, le CHAT contient 31 ± 1% de cuivre (w /w ) par analyse ICP-OES. Les rapports molaires du cuivre au ligand, ce dernier déterminé par HPLC, étaient de 2:1 pour le cuivre au tartrate et de 2:0,3 pour le cuivre à l'adipate. Les particules CHAT sont apparues presque monodisperses avec des diamètres de 2 à 3 nm par imagerie MET (Fig. 1b). Ces résultats étaient cohérents avec les données de dimensionnement hydrodynamique pour CHAT plus une coquille d'hydratation puisque le diamètre médian en volume dans l'eau UHP était de 3,4 nm (Fig. 1c) et la distribution de la taille était étroite (2,4 à 5,6 nm pour 80 % du volume) lorsque évalué par diffusion dynamique de la lumière. Le potentiel zêta moyen était de − 39 mV (Fig. 1d), cohérent avec les nanoparticules qui forment une dispersion aquatée stable [27], et, en effet, la suspension mère CHAT s'est avérée stable pendant plusieurs années (Fichier supplémentaire 4).

Caractérisation de la solution mère de CHAT. un Distribution de la phase cuivre à 2,5 g/L CHAT :soluble (< 3 KDa) et pourcentage de nanoparticules. b Imagerie de dispersion de nanoparticules par MET. c Distribution hydrodynamique de la taille des particules de particules fraîchement préparées, déterminée par diffusion dynamique de la lumière. d Distribution potentielle Zeta (n = 3; les barres d'erreur représentent les écarts types)

Ensuite, nous avons examiné l'activité antimicrobienne du CHAT lorsque les suspensions mères ont été diluées dans des milieux de croissance bactériens à des concentrations associées à l'activité antimicrobienne des sels de cuivre. Pour le CHAT et le chlorure de cuivre, la courbe d'inhibition de la croissance était très similaire pour E. coli et S. aureus la plus grande partie de l'activité se produisant à des concentrations de cuivre total comprises entre 12,5 et 50 mg/L (Fig. 2). Complétez E. coli une inhibition de la croissance a été observée lors de l'incubation avec 18,8 (CuCl₂ ) et 25 (CHAT) mg/L de cuivre, tandis que pour S. aureus , une inhibition complète de la croissance a été obtenue à 75 (CuCl₂ ) et 100 (CHAT) mg/L de cuivre (Fig. 2 ; Le pourcentage d'inhibition de la croissance par rapport à la concentration de cuivre est fourni dans le fichier supplémentaire 5).

Escherichia coli (en haut) et Staphylococcus aureus (en bas) courbes de croissance, représentées ici sous forme de densité optique, lors d'une exposition à différentes concentrations de chlorure de cuivre (à gauche) ou de CHAT (à droite) dans du HMM supplémenté.

En effet, à ces concentrations antimicrobiennes, au moins 94 % du CHAT était rapidement solubilisé (en 15 min), encore une fois à en juger par l'ultrafiltration et l'analyse ICP-OES (Fig. 3a). Nous avons donc anticipé que l'efficacité antimicrobienne du CHAT était liée à cette labilité chimique, avec une dissolution rapide des nanoparticules permettant l'acquisition bactérienne intracellulaire des ions cuivre. Pour tester cela, nous avons mis au défi le Cu-sensing E. coli , MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), dans lequel la bioluminescence augmente en réponse à des concentrations sous-toxiques d'ions cuivre intracellulaires [30], avec 0 à 50 mg/L de cuivre sous forme de CHAT ou de chlorure de cuivre. Des concentrations croissantes dans le milieu de culture des deux sources de cuivre ont conduit à une augmentation de la bioluminescence dans le E. coli contrainte du capteur de cuivre (Fig. 3b), compatible avec des augmentations du cuivre intracellulaire. La pente de la courbe dose-réponse était identique jusqu'à 6,25 mg/L pour les deux sources de cuivre, confirmant que le cuivre biodisponible de CHAT était comparable à une source entièrement solubilisée. Par la suite, à des concentrations allant jusqu'à 50 mg/L de cuivre, la luminescence n'a pas augmenté en raison de la toxicité des deux composés du cuivre (Fig. 3b).

un Profil de dissolution du CHAT dans le HMM supplémenté à 12,5, 25 et 50 mg/L de cuivre. Dose-réponse de l'induction par bioluminescence de bactéries luminescentes recombinantes :b E. coli MC1061 Bactéries pSLcueR/pDNPcopAlux, c E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) et d E. coli K12::soxRSsodAlux après exposition pendant 4 h dans du HMM supplémenté au chlorure de cuivre, au CHAT (concentration en mg Cu/L) et aux témoins respectifs (ménadione en c et H₂ O₂ en d )

Parallèlement à l'étude du cuivre intracellulaire chez E. coli exposés à des solutions préparées avec du CHAT ou du chlorure de cuivre, nous avons également testé la capacité de ces solutions à déclencher des anions superoxydes intracellulaires ou à endommager l'ADN bactérien dans différents E. coli -à base de biocapteurs. Dans aucun des cas, il n'y a eu d'effet significativement observable, malgré les capteurs répondant aux contrôles positifs pertinents, à savoir le peroxyde d'hydrogène et la ménadione, respectivement (Fig. 3c, d). Prises ensemble, les réponses équivalentes des trois biocapteurs bactériens aux solutions préparées à partir de différentes formes chimiques de cuivre soutiennent fortement l'idée que, dans les deux cas, les bactéries étaient exposées au même cuivre soluble, malgré une formulation au départ nanoparticulaire.

Enfin, comme indiqué ci-dessus, l'avantage du CHAT par rapport aux sels de cuivre solubles ne serait apparent que si une formulation concentrée permettait au premier de conserver sa labilité chimique contrairement au second. En utilisant de l'hydroxyéthylcellulose (HEC), une base aqueuse courante pour les formulations topiques [31,32,33], nous avons incorporé 250 mg/L de cuivre sous forme de chlorure de cuivre, de CHAT ou de NP CuO commerciales. Lorsque 10 mL de 50 mM NaHCO₃ tampon, en tant qu'exsudat simplifié de la plaie, ont été ajoutés à 10 g de chacun des gels HEC incorporés au cuivre (c'est-à-dire 2,5 mg de cuivre), il y a eu une libération prolongée de cuivre de la préparation contenant du CHAT, à plus de 60 mg/L par 24 h (Fig. 4). De plus, la libération était relativement rapide, les concentrations antimicrobiennes étant atteintes en 2 à 4 heures. En revanche, le chlorure de cuivre à pH neutre était un mauvais substrat pour la libération de cuivre, comme prévu par sa tendance à s'hydrolyser et à former des agglomérats d'oxo-hydroxydes de cuivre, donc en 24 h, seulement 10 ± 7 mg/L de cuivre avaient été obtenus en solution (Fig. 4). Les NP CuO commerciales n'ont produit aucune libération de cuivre perceptible (Fig. 4).

Libération de cuivre des matrices HEC contenant du CHAT, du chlorure de cuivre ou des nanoparticules d'oxyde de cuivre (CuO NP), le tout à 250 mg/L de cuivre

Discussion

Nous montrons ici qu'un nanomatériau à base de cuivre, à savoir le CHAT, peut être formulé à des concentrations élevées, contrairement aux nanoparticules à base de cuivre décrites précédemment [34, 35], tout en conservant ses propriétés de source labile de cuivre biodisponible avec une efficacité antimicrobienne. Comme indiqué ci-dessus, la synthèse de CHAT a été inspirée après de nombreuses années de travaux antérieurs sur l'analogue du fer, IHAT [21, 22]. Ceci, à son tour, a été inspiré par la solution de la nature au renouvellement rapide des minéraux in vivo, pour le recyclage efficace des ions métalliques essentiels, grâce à laquelle des molécules organiques sont utilisées pour déstabiliser la structure cristalline des particules minérales primaires [21, 22]. Dans les versions synthétiques, les ligands GRAS sont incorporés dans des oxo-hydroxydes métalliques lorsqu'ils se forment en solution à partir de polymères de réticulation [21, 22]. Par déstabilisation structurelle, cela garantit la labilité de la phase minérale finale et génère également des nanoparticules très négatives - comme le montre la mesure du potentiel zêta - qui repoussent l'agglomération et l'agrégation, produisant ainsi des suspensions de nanoparticules stables pendant des années. Ici, et comme indiqué précédemment pour l'IHAT, le tartrate était le ligand dominant dans la réalisation de ces changements physico-chimiques de la structure de l'oxo-hydroxyde de cuivre puisque son incorporation était d'environ. 3 fois supérieur à celui de l'adipate, ce dernier se comportant davantage comme un tampon lors de la synthèse [21, 22].

En l'absence de modification, les oxo-hydroxydes métalliques fraîchement précipités s'aggloméreront et s'agrégeront et commenceront à vieillir, moyennant quoi ils se condenseront et augmenteront progressivement leur cristallinité. Ces transitions de taille et de phase minérale réduisent la capacité des structures à participer à la réaction inverse, c'est-à-dire à se redissoudre. Il n'était donc pas surprenant que lorsque l'oxo-hydroxyde de cuivre était fraîchement formé, à partir de la neutralisation du pH d'une solution de chlorure de cuivre, au moins une partie du cuivre soluble était libérée dans notre test de libération de gel (Fig. 4), alors que pour les NP CuO commerciales, qui étaient aggloméré et composé d'une phase minérale plus condensée (c'est-à-dire de l'oxyde de cuivre), du cuivre indétectable a été libéré. L'absence de dissolution des nanoparticules commerciales de 30 nm - qui, quel que soit leur état d'agrégation, auraient présenté une grande surface de dissolution - montre que la phase minérale est un facteur clé dans la libération d'ions cuivre et que, comme indiqué ci-dessus, la modification des particules primaires du minéral, obtenu ici par dopage du ligand, est vraiment nécessaire pour provoquer un changement marqué des caractéristiques de dissolution. De plus, la synthèse de CHAT a été réalisée à température ambiante, car une température de synthèse élevée favorise des phases moins amorphes qui peuvent par conséquent réduire les vitesses de dissolution. De plus, la synthèse à température ambiante a l'avantage de réduire les coûts énergétiques lors de la fabrication à grande échelle.

Bien qu'il puisse exister d'autres moyens de formuler des concentrations élevées et stables de cuivre qui permettent une libération prolongée et une dissolution rapide des ions lorsque cela est nécessaire, nous ne pouvons pas envisager une autre synthèse aussi simple et le coût des marchandises (pour les réactifs) si bas. Ce sont des facteurs importants car la question des infections topiques et de la résistance bactérienne ne se limite en aucun cas aux pays développés. Les pays en développement sont de plus en plus en proie à des problèmes de résistance bactérienne et des solutions efficaces et abordables sont donc requises de toute urgence [36, 37]. Bien qu'il n'y ait pas suffisamment d'études pour parvenir à des solutions concrètes, il est prouvé que la résistance aux ions métalliques toxiques est plus difficile à atteindre pour les bactéries que la résistance aux antibiotiques conventionnels [7]. La théorie repose sur l'idée que le cuivre et l'argent n'ont probablement pas de voies distinctes d'activité antimicrobienne, mais peuvent plutôt avoir un impact sur plusieurs cibles, y compris divers systèmes enzymatiques, et peuvent ainsi déstabiliser la structure cellulaire bactérienne globale [17, 19, 38]. En effet, il a été démontré que les bactéries restent sensibles au cuivre et à certains autres ions métalliques malgré des expositions au cours des siècles [6, 7, 39]. Fait intéressant, il existe des preuves récentes que les antimicrobiens à base de métaux peuvent même rendre la sensibilité bactérienne aux antibiotiques conventionnels malgré une résistance antérieure [40, 41].

Conclusions

Ici, nous avons démontré que le problème des ions cuivre biodisponibles, à des pH physiologiques et à des concentrations élevées, peut être résolu en dopant un nanominéral de cuivre avec des acides organiques, dans une stratégie similaire à celle précédemment utilisée pour les analogues du fer [21, 22]. Ces nanoparticules à base de cuivre (appelées CHAT) se sont facilement dissoutes dans le milieu bactérien, montrant une absorption de cuivre intracellulaire et une activité antibactérienne équivalentes aux sels de cuivre solubles. De manière critique, cependant, et contrairement aux simples sels de cuivre, le CHAT peut être concentré dans une formulation au pH neutre et conserver sa labilité en termes de libération d'ions cuivre. En effet, CHAT a libéré des ions de cuivre dans la plage bactéricide et pourrait ainsi être la base d'un nouvel agent antimicrobien topique, seul ou améliorant l'efficacité de la résistance aux antibiotiques. Avec l'augmentation de la résistance aux antibiotiques, de nouveaux antimicrobiens topiques sont nécessaires et le CHAT est peu coûteux, facilement synthétisé et utilise des composants généralement reconnus comme sûrs (GRAS). Des études in vivo sont méritées.

Abréviations

CHAT :

Nanoparticules de cuivre [oxo]-hydroxyde adipate tartrate

NP CuO :

Nanoparticules d'oxyde de cuivre

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

Escherichia coli :

E. coli

GRAS :

Généralement reconnu comme sûr

HEC :

Hydroxyéthylcellulose

HMM :

Heavy metal MOPS moyen

HPLC :

Chromatographie liquide haute performance

ICP-OES :

Spectrométrie d'émission plasma-optique à couplage inductif

IHAT :

Nanoparticules de fer [oxo]-hydroxyde adipate tartrate

MOPS :

3-(N -morpholino) acide propanesulfonique

Staphylococcus aureus :

S. aureus

UHP :

Ultra-haute pureté