Spectroscopie intégrée à la microscopie : Analyse UV-Vis-NIR précise d'échantillons micro-échelle

Instrument hyphéné : microscope-spectrophotomètre

Un instrument hyphéné est celui qui mélange les capacités de deux technologies différentes pour former une nouvelle technique analytique avec des capacités novatrices. Le microscope-spectrophotomètre est un tel instrument hyphéné ; c'est un hybride qui combine le pouvoir grossissant d'un microscope optique avec les compétences analytiques d'un spectrophotomètre UV-visible-proche infrarouge. En tant que tel, les microscope-spectrophotomètres peuvent être utilisés pour mesurer les spectres moléculaires de zones d'échantillon microscopiques de l'ultraviolet profond au proche infrarouge. Ils peuvent être configurés pour de nombreux types différents de spectroscopie et, en tant que tels, sont utilisés pour mesurer l'absorbance, la réflectance, et même les spectres d'émission, tels que la fluorescence et la photoluminescence, d'échantillons de taille micron. Avec l'ajout d'algorithmes spécialisés, le microscope-spectrophotomètre peut également être utilisé pour mesurer l'épaisseur de couches minces ou agir comme un colorimètre pour des échantillons microscopiques.

Il y a de nombreuses raisons d'utiliser le microscope-spectrophotomètre. La plus évidente est que les spectres peuvent être acquis à partir d'une zone d'échantillon plus petite qu'un micron. De plus, ces instruments ne nécessitent que de petites quantités d'échantillons sous forme solide ou liquide. Un autre avantage est que très peu ou aucune préparation n'est requise pour de nombreux échantillons. Et les comparaisons de couleur par spectroscopie tendent à être plus précises avec les spectrophotomètres car ces instruments ont une gamme spectrale plus large, peuvent corriger les variations d'éclairage, et peuvent mesurer l'intensité de chaque bande de longueur d'onde de lumière.

Avant l'avènement de la microspectroscopie, la seule façon d'analyser de nombreux types d'échantillons microscopiques était d'utiliser des tests micro-chimiques et puis une sorte d'examen visuel. Malheureusement, ces méthodes tendent à être destructives, nécessitent beaucoup d'échantillons, et souffrent des inexactitudes du système visuel humain. Le microscope-spectrophotomètre évite ces problèmes et peut « voir » au-delà de la gamme de l'œil humain et détecter des variations qui ne seraient pas autrement apparentes.

Conception du microscope-spectrophotomètre

Le microscope-spectrophotomètre intègre un microscope optique ou à lumière avec un spectrophotomètre UV-visible-NIR (Figure 1). Le microscope est un dispositif conçu pour agrandir une image de petits objets pour leur permettre d'être étudiés. Le spectrophotomètre est un instrument qui mesure l'intensité de chaque longueur d'onde de lumière de l'ultraviolet à travers le visible et le proche infrarouge. Avec un microscope-spectrophotomètre correctement configuré, on est capable d'acquérir des spectres d'absorbance, de réflectance et d'émission avec des zones d'échantillonnage à l'échelle submicronique.

Afin de couvrir une si large gamme spectrale avec une bonne qualité d'image et spectrale, un microscope conçu sur mesure est construit et intégré avec le spectrophotomètre. Les microscopes optiques standards ont une gamme spectrale limitée couvrant seulement une portion de la région visible en raison des matériaux utilisés pour l'optique ainsi que des sources de lumière elles-mêmes. Le microscope-spectrophotomètre moderne utilise un microscope construit sur mesure avec une conception optique et des sources de lumière optimisées pour l'UV profond jusqu'au proche IR.

Le spectrophotomètre lui-même doit également être conçu pour la microspectroscopie afin d'obtenir de bons résultats spectraux. Cela signifie que le spectrophotomètre doit être hautement sensible tout en maintenant une résolution spectrale acceptable. La stabilité est aussi un problème puisque le microscope-spectrophotomètre est un instrument à faisceau unique et les spectres de référence doivent être obtenus avant de mesurer l'échantillon. L'instrument doit également avoir une grande plage dynamique car on passe fréquemment de la microspectroscopie en transmission ou réflectance à la spectroscopie de fluorescence lors de la mesure du même échantillon. Cela permet d'obtenir différents types d'informations spectrales exactement au même emplacement sur l'échantillon microscopique.

L'intégration du spectrophotomètre avec le microscope est critique. Bien que le microscope et le spectrophotomètre doivent tous deux être optimisés pour la microspectroscopie, la clé du fonctionnement d'un microscope-spectrophotomètre est le matériel qui leur permet de travailler ensemble. Cette interface a plusieurs exigences de base. Le plus important, elle doit canaliser l'énergie électromagnétique collectée par le microscope de l'échantillon vers le spectrophotomètre. Cependant, l'utilisateur doit être capable de visualiser la zone de mesure de l'échantillon, mais aussi de voir l'échantillon environnant. Cela est fait en ayant l'ouverture d'entrée du spectrophotomètre au même plan focal que l'image de l'échantillon. L'échantillon peut alors être déplacé avec la platine du microscope, comme on le ferait normalement avec un microscope, jusqu'à ce que l'image de l'ouverture d'entrée soit sur la zone à mesurer. Dans la Figure 2, le carré noir au centre de l'image est l'ouverture d'entrée du spectrophotomètre. Tout cela est fait en temps réel pour que la spectroscopie d'échantillons de microscope soit rapide et facile.

Comme montré dans la Figure 3, l'optique du microscope focalise la lumière sur l'échantillon. L'énergie électromagnétique est ensuite collectée de l'échantillon par l'objectif du microscope. La lumière de l'objectif est focalisée sur l'ouverture d'entrée miroir du spectrophotomètre. La majorité de la lumière est reflétée de la surface de l'ouverture d'entrée sur la caméra. L'ouverture du spectrophotomètre est également imagée par la caméra de sorte qu'elle apparaisse comme un carré noir sur l'échantillon (Figure 2). Cela permet un alignement facile et rapide du microscope-spectrophotomètre. La lumière qui passe à travers l'ouverture d'entrée passe ensuite dans le spectrophotomètre où un spectre est mesuré.

Le microscope peut être configuré avec différents schémas d'illumination selon le type d'expérience à effectuer. L'illumination incidente avec lumière blanche permet la microspectroscopie de réflectance de l'UV profond au proche IR. L'illumination incidente peut également être utilisée pour la microspectroscopie de fluorescence ou photoluminescence. De plus, la microspectroscopie en transmission est possible avec la lumière blanche focalisée sur l'échantillon à travers le condenseur du microscope.

Applications de la microspectroscopie

Les premiers microscope-spectrophotomètres ont été développés dans les années 1940 et depuis lors, une multitude d'applications différentes ont été développées. Avec la capacité d'acquérir des spectres de zones d'échantillon microscopiques, les microscope-spectrophotomètres sont utilisés partout, des laboratoires universitaires aux lignes de production pour le contrôle qualité et l'analyse de défaillance.

Science médico-légale. L'analyse de preuves médico-légales a été l'une des applications les plus importantes pour les microscope-spectrophotomètres depuis le début des années 1980. Le plus grand effort était dans l'analyse de traces, spécifiquement les fibres textiles et les éclats de peinture. Comme leurs noms l'indiquent, ces types d'échantillons sont généralement microscopiques et, étant des preuves, ne devraient pas être endommagés ou détruits par les tests. Avec les fibres, les microscope-spectrophotomètres sont utilisés pour mesurer les spectres d'absorbance et de fluorescence UV-visible-NIR de fibres individuelles. Les éclats de peinture sont généralement mis en coupe transversale et puis le spectre d'absorbance de chaque couche est mesuré pour que des échantillons connus et questionnés puissent être comparés avec un haut degré de discrimination.

Écrans plats. Les écrans plats modernes consistent en millions de pixels multicolores. Au fur et à mesure que la technologie a progressé, les pixels deviennent de plus en plus petits et plus densément emballés sur des surfaces toujours plus grandes. Les écrans les plus modernes utilisent différentes technologies, telles que les points quantiques et les diodes électroluminescentes organiques, pour créer des pixels de différentes couleurs à l'échelle microscopique. Le microscope-spectrophotomètre est utilisé pour aider à développer ces matériaux en sources de lumière viables et ultimement en écrans. Le microscope-spectrophotomètre est également utilisé dans le processus de production pour s'assurer que la couleur et l'intensité des pixels sont cohérentes à travers tout l'écran, assurant ainsi des images lumineuses et uniformément éclairées à travers l'écran.

Énergie. Le charbon et la roche source pétrolière contiennent de la vitrinite et d'autres macéraux. Les microscope-spectrophotomètres sont utilisés pour classer la maturité thermique, et donc la teneur en énergie, du charbon, coke et roche source pétrolière. Cela est fait en mesurant la réflectivité absolue de la vitrinite sur un échantillon poli. Selon la réflectivité, la maturité thermique de l'échantillon peut être déterminée.

Nanotechnologie. Le microscope-spectrophotomètre fait également progresser la nanotechnologie et la science des matériaux basés sur leur capacité à mesurer les spectres de transmission, réflectance et émission de zones d'échantillon microscopiques. Un domaine d'applications en croissance rapide est dans le développement et l'utilisation de la résonance de plasmon de surface (SPR).

Les plasmons de surface sont excités en illuminant une surface métallique plane ou des particules métalliques nanoscopiques avec de la lumière (Figure 4). Les changements dans les caractéristiques optiques de ces matériaux se produisent quand ces nanoparticules ou surfaces interagissent avec d'autres matériaux. En tant que tel, beaucoup de travail est fait pour développer de nouveaux matériaux qui exhibent une forme de résonance de plasmon, mais aussi pour construire des dispositifs qui présentent ces phénomènes. Ce dernier inclut les biosenseurs et les capteurs de dispositifs microfluidiques de divers types. Le microscope-spectrophotomètre mesure comment les spectres des matériaux SPR changent sous différentes conditions donnant au chercheur la capacité de caractériser un nouveau matériau, puis de « régler » ce matériau pour des effets optiques spécifiques.

Conclusion

Le microscope-spectrophotomètre est une technique hyphénée qui combine le microscope optique avec un spectrophotomètre pour qu'on puisse acquérir des spectres de zones d'échantillon microscopiques. De tels instruments sont capables de spectres d'absorbance et de réflectance de l'UV profond à travers le visible et dans le proche infrarouge. Le microscope-spectrophotomètre peut également mesurer la fluorescence et d'autres types de spectres d'émission. Ces dispositifs ont trouvé des utilisations dans de nombreux domaines incluant la science médico-légale, la mesure d'épaisseur de films semi-conducteurs et optiques, la biotechnologie, et le dernier cri en science des matériaux.

Références

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Cet article a été écrit par le Dr Paul Martin, Président, CRAIC Technologies (San Dimas, CA). Pour plus d'informations, contactez le Dr Martin à cette adresse email protégée, ou visitez ici.