L'axe de signal ARN non codant long MALAT1/microRNA-143/VEGFA module l'anévrisme intracrânien induit par une lésion endothéliale vasculaire

Introduction

L'anévrisme intracrânien (IA), également appelé anévrisme cérébral, est causé par l'augmentation de la pression intracrânienne induite par l'élargissement anormal local de la cavité artérielle cérébrale ou de la paroi artérielle [1]. L'AI est une maladie grave avec une mortalité et une morbidité élevées, et le taux de prévalence est d'environ 1 à 3 % dans la population générale [2]. Les principales caractéristiques cliniques de l'IA sont un vasospasme cérébral, une hémorragie cérébrale spontanée et une paralysie du nerf oculomoteur [3]. Jusqu'à présent, les facteurs de risque communs conduisant à l'apparition et au développement de l'AI comprennent les troubles hémodynamiques, les gènes, le vieillissement, les infections et les facteurs congénitaux [4]. Les principaux traitements cliniques, principalement le clipping chirurgical et/ou le coiling endovasculaire, sont mis en œuvre pour prévenir la rupture d'anévrisme [5]. Cependant, le mécanisme détaillé sous-jacent à l'IA reste encore à élucider, reflétant le besoin urgent de méthodes plus efficaces dans la gestion de l'IA.

Les ARN longs non codants (lncRNAs) sont plus longs que 200 nucléotides qui appartiennent à une espèce d'ARN non codants [6]. Il est rapporté que l'expression de l'ARNnc lncRNA associé à l'arrêt de la croissance 1 dans l'IA est régulée à la baisse. MALAT1 a été documenté pour moduler la dysfonction des muscles lisses dans l'anévrisme de l'aorte thoracique [8]. En outre, une étude a présenté l'expression anormale des lncRNAs et des ARN messagers (ARNm) dans l'IA, et les réseaux de co-expression lncRNA-mRNA fournissent des indices pour trouver la pathogenèse de l'IA [9]. MALAT1 a été suggéré pour faire progresser l'expression de l'osterix et moduler la différenciation ostéogénique en ciblant l'expression du miARN-143 (miR-143) dans les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse humaine [10]. Une étude a également présenté le rôle du cluster miR-143/145 dans l'inversion de la régulation du facteur 5 de type krüppel dans les cellules musculaires lisses et sa contractilité et sa prolifération dans l'IA [11]. Selon Feng et al., la régulation à la baisse du niveau de miR-143/145 et plus élevé de la métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9) au cours de la circulation peut être liée à la formation et à la rupture de l'IA [12]. Une analyse a révélé que les miARN les plus incontrôlés (miR-143 et miR-145) sont communs aux gènes cibles qui sont des voies de signalisation, tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et d'autres gènes qui régulent le mouvement ou l'adhésion cellulaire [13] . Une étude a révélé l'importance prédictive des variations du facteur de croissance endothélial vasculaire-A (VEGFA) dans l'IA [14]. Par conséquent, nous avons cherché à évaluer le mécanisme de l'axe du signal MALAT1/miR-143/VEGFA dans l'IA induite par une lésion endothéliale vasculaire.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

L'étude a été approuvée par l'Institutional Review Board du premier hôpital affilié de l'USTC, Division des sciences de la vie et de la médecine, Université des sciences et technologies de Chine et a suivi les principes de la Déclaration d'Helsinki. Les participants ont fourni un consentement éclairé écrit dans cette étude. Toutes les expérimentations animales étaient conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été autorisé par le Comité sur l'éthique des expérimentations animales du premier hôpital affilié de l'USTC, Division des sciences de la vie et de la médecine, Université des sciences et technologies de Chine.

Sujets à étudier

Vingt patients IA (groupe IA) qui avaient été diagnostiqués par examen d'imagerie et avaient subi une tonte neurochirurgicale au premier hôpital affilié de l'USTC, Division des sciences de la vie et de la médecine, Université des sciences et technologies de Chine ont été sélectionnés pour nos expériences. Il y avait 11 hommes et 9 femmes âgés de 43,27 ± 6,25 ans. Les tissus IA ont été échantillonnés. Pendant ce temps, les tissus vasculaires artériels corticaux temporaux du pôle temporal ont été réséqués chez 20 patients (groupe témoin) atteints d'épilepsie du lobe temporal causée par l'amygdale et la sclérose de l'hippocampe. Les tissus réséqués ont été examinés comme des tissus artériels normaux par histopathologie après l'opération, et il y avait 13 hommes et 7 femmes âgés de 44,18 ± 5,91 ans. Aucune différence significative n'a été reconnue dans le sexe et l'âge entre le groupe IA et le groupe témoin (les deux P> 0,05). Des échantillons de sang veineux (2 tubes) ont été prélevés sur tous les sujets à jeun à la même heure le matin avant l'opération.

Établissement de modèles de rat d'IA

Soixante rats mâles Sprague-Dawley de qualité propre (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, Chine), pesant entre 200 et 250 g, ont été élevés pendant 7 jours (25 ± 2 °C, humidité relative de 65-70 %, 12 h de cycle lumière et obscurité, eau libre et apport alimentaire). Des rats ont été déposés avec l'élastase pancréatique porcine sur l'artère carotide externe et autour de la paroi de l'artère de bifurcation. L'artère carotide externe a été ligaturée avec deux lignes chirurgicales au niveau de la branche de l'artère carotide externe d'environ 1,5 mm. L'artère carotide externe a été sectionnée entre les deux lignes pour former un anévrisme de la carotide interne dans le segment aveugle de l'artère carotide externe. Les rats ont été nourris avec une solution saline à 1 % pendant 1 semaine après l'opération. Une angiographie cérébrale a été réalisée après 1 mois et la formation d'un anévrisme a été observée.

Après l'établissement des modèles de rats IA, 50 rats ont été répartis au hasard dans un groupe vierge (n =10, les rats modélisés ont été traités avec une injection stéréotaxique de 100 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) une fois par jour), un groupe de contrôle négatif (NC) d'ARN en épingle à cheveux court (n =10, les rats modélisés ont été traités avec une injection stéréotaxique de 100 μL de sh-MALAT1 NC une fois par jour), groupe sh-MALAT1 (n =10, les rats modélisés ont été traités avec une injection stéréotaxique de 100 μL de plasmide sh-MALAT1 une fois par jour), groupe de surexpression (Oe)-NC (n =10, les rats modélisés ont été traités avec une injection stéréotaxique de plasmide 100 μL Oe-MALAT1 NC une fois par jour), et le groupe Oe-MALAT1 (n =10, les rats modélisés ont été traités avec une injection stéréotaxique de 100 L de plasmide Oe-MALAT1 une fois par jour) [15]. Les plasmides ci-dessus ont été composés par Shanghai Genechem Co., Ltd. (Shanghai, Chine).

Test de pression artérielle sur rats

La pression artérielle de l'artère caudale des rats a été mesurée à la 1ère, 4e et 12e semaine après l'opération. Avant de mesurer la pression artérielle, les rats ont été placés dans un dispositif de chauffage à température constante pendant un moment pour empêcher la perturbation de la température extérieure. Deuxièmement, les rats ont été maintenus silencieux pendant plusieurs minutes dans une cage à rats spéciale pour empêcher l'interférence de l'activité. Si la pression artérielle variait dans une large mesure, elle était déterminée deux ou trois fois à des moments différents pour obtenir la valeur moyenne.

Acquisition de tissus d'anévrisme

Après 3 mois, les rats ont été anesthésiés avec du pentobarbital sodique à 1 % (40 mg/kg) par injection intrapéritonéale pour obtenir des échantillons de sang des veines. Les rats ont été euthanasiés et la poitrine a été ouverte, le ventricule gauche a été intubé dans l'aorte et la cavité a été coupée pour libérer le sang. Pendant ce temps, 30 mL de solution saline normale contenant de l'héparine sodique ont été utilisés pour une perfusion cardiaque rapide pour rincer le sang, puis 10 mL de polyformaldéhyde à 10 %/0,1 M de PBS (pH 7,4) ont été injectés dans le cerveau. Après perfusion et fixation, le cerveau du rat a été ouvert. La circulation artérielle dans la base du crâne a été soigneusement observée, le tissu de l'anévrisme a été séparé et les modifications de l'anévrisme ont été observées au microscope.

Essai immuno-enzymatique (ELISA)

Les indices sériques ont été testés par kit ELISA. Les échantillons de sang collectés ont été placés dans un thermostat à 37°C pendant 1 h et centrifugés à 3000 r/min pendant 10 min. La détection de l'expression de l'endothéline-1 (ET-1) et du facteur von Willebrand (vWF) a été effectuée conformément aux instructions du kit (tous les kits ont été achetés auprès du NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Jiangsu, Chine).

Coloration à l'hématoxyline-éosine (HE)

Les échantillons ont été fixés au formol à 10 % pendant plus de 24 h et conservés dans des blocs de paraffine. Les blocs de paraffine ont été déparaffinés au xylène pendant 20 min, déshydratés avec des séries d'alcools descendants en gradient (100 %, 95 %, 80 %, 75 %) pendant 1 min et teints à l'hématoxyline pendant 10 min. Ensuite, les tissus ont été rincés à l'eau distillée, différenciés avec de l'éthanol à l'acide chlorhydrique pendant 30 s, et trempés dans de l'eau tiède à 50°C pendant 5 min. Teints avec une solution d'éosine, les tissus ont été rincés à l'eau distillée, déshydratés avec de l'alcool à 70 % et 90 %, clarifiés au xylène et scellés avec de la gomme neutre. La morphologie des tissus a été observée au microscope à haute puissance.

Observation au microscope électronique à transmission

Les tissus de rechange ont été fixés avec 2,5 % de dialdéhyde glutarique et 1 % d'acide osmitique, déshydratés puis enrobés de résine Epon812. Les sections semi-fines ont été teintes au bleu de toluène, coupées et transformées en sections ultra-fines. Les coupes ont été teintes avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb et observées au microscope électronique à transmission JME-2000EX (Hitachi High-Technologies Co., Ltd., Shanghai, Chine).

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated Deoxyuridine Triphosphate-Biotin Nick End-Labeling (TUNEL) Coloration

La coloration TUNEL était impliquée pour observer l'apoptose des cellules endothéliales chez les rats IA sur la base du kit TUNEL (Roche, Bâle, Suisse). Les coupes d'anévrisme de rat préparées ont été lavées deux fois avec du xylène (5 min/temps) et déshydratées avec des séries décroissantes d'alcool (100 %, 95 %, 80 %, 75 %) pendant 3 fois (5 min/temps). Les tissus ont été traités avec 20 μg/mL de solution de protéase K sans DNase pendant 15 à 30 min, déposés avec 50 μL de solution réactionnelle TUNEL pendant 60 min et développés avec 50 μL de diaminobenzidine (DAB) à 25 °C pendant 10 min. Ensuite, les sections ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline, déshydratées avec de l'alcool à gradient, clarifiées avec du xylène et scellées avec de la gomme neutre. Les coupes ont été observées au microscope optique et l'indice d'apoptose a été calculé.

Isolement et identification des cellules endothéliales vasculaires d'anévrisme

L'isolement des cellules endothéliales a été réalisé selon la méthode menée par Boscolo et al. [16]. Les tissus IA ont été sectionnés en 3 mm ² fragments. Les tissus ont été incubés avec 0,1 % de collagénase B/0,1 % de dispase (Roche) pendant 25 min à 37 °C. Ensuite, les tissus pré-détachés ont été triturés pendant 2 min par une pipette de 2 mL et filtrés avec une passoire de 100 μm (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA). Par la suite, la suspension cellulaire a été centrifugée puis remise en suspension dans du milieu MV2 (comprenant des facteurs de croissance et 20 % de sérum bovin fœtal) (PromoCell, Heidelberg, Allemagne). Les cellules ont été ensemencées à 1 × 10 ⁴ cellules/mL dans un flacon de culture recouvert de 1 μg/cm ² fibronectine. Suivant la méthode décrite par Jackson et al. [17], les cellules de 80 à 100 % de confluence ont été séparées avec les billes (Dynabeads M-450 Tosylactived, Oxoid, Hampshire, UK) recouvertes d'Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, UK) . Les cellules endothéliales adhérant aux billes recouvertes de lectine ont été rassemblées avec un concentrateur de particules magnétiques et les cellules non conjuguées ont été lavées avec un milieu basal. Les cellules positives à l'UEA ont été remises en suspension dans le milieu de culture et ensemencées dans le flacon de culture recouvert de fibronectine pour améliorer l'adhérence et le taux de croissance des cellules.

Les cellules ont été cultivées dans MV2 sur des lames de chambre recouvertes de fibronectine. Lorsque la confluence cellulaire a atteint 80-100%, les cellules ont été fixées dans de l'acétone à 4°C et traitées avec 1% de Triton X-100 pendant 5 min puis 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) pendant 15 min. Les cellules ont été égouttées avec un anticorps primaire contre le vWF (1:300, Abcam, Cambridge, MA, USA) et incubées pendant 2h (NC a été réalisée en l'absence d'anticorps primaire), égouttées avec de l'immunoglobuline G conjecturée à la peroxydase de raifort (1 :150, Abcam) et incubé pendant 30 min. Ensuite, les cellules ont été développées avec 50 μL de DAB à 25 °C pendant 5 min, contre-colorées avec de l'hématoxyline, différenciées avec de l'acide chlorhydrique à 0,1%, déshydratées avec de l'alcool, suivies d'une clairance au xylène et d'un scellement de gomme neutre. Après séchage, les cellules ont été photographiées au microscope inversé.

Regroupement cellulaire et transfection

Les cellules endothéliales vasculaires d'anévrisme en phase logarithmique ont été réparties en 5 groupes :groupe blanc (cellules endothéliales vasculaires d'anévrisme sans aucun traitement), groupe sh-NC (cellules endothéliales vasculaires d'anévrisme transfectées avec le plasmide sh-MALAT1 NC), groupe sh-MALAT1 ( cellules endothéliales vasculaires d'anévrisme transfectées avec le plasmide sh-MALAT1), groupe Oe-NC (cellules endothéliales vasculaires d'anévrisme transfectées avec le plasmide Oe-MALAT1 NC) et groupe Oe-MALAT1 (cellules endothéliales vasculaires d'anévrisme transfectées avec le plasmide Oe-MALAT1). Les plasmides ci-dessus ont été synthétisés par Genechem. La transfection cellulaire a été réalisée selon les instructions de la lipofectamine ^TM 2000 réactif (11668-027, Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA).

Dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-Yl)-2, 5-diphényltétrazolium (MTT)

Les cellules endothéliales vasculaires de chaque groupe ont été ensemencées sur une plaque 96 puits à une densité de 3 × 10 ⁴ cellules/mL et cultivé à 37 °C, 5% CO₂ pendant 48h. Chaque groupe a été placé avec 5 puits parallèles, et chaque puits a été ajouté avec 20 μL de solution MTT fraîche (5 mg/mL, Sigma, St. Louis, MO, USA). Après 4 h de réaction, les cellules ont été mélangées avec 200 µL de diméthylsulfoxyde. Après dissolution complète, la valeur de la densité optique des cellules de chaque groupe a été mesurée par un lecteur de microplaques (BioRad, Hercules, Californie, États-Unis) à 490 nm.

Cytométrie en flux

La distribution du cycle cellulaire a été testée par coloration à l'iodure de propidium (PI). Les cellules endothéliales vasculaires ont été détachées, centrifugées, remises en suspension avec de l'éthanol à 75 % pré-refroidi et fixées pendant une nuit à -20°C. Les cellules ont été centrifugées pour éliminer le surnageant. Les cellules ont été ajoutées dans 450 μL de PBS, additionnées de 100 μL de Rnase A et colorées par 400 μL de PI à 4 °C pendant 30 min en évitant la lumière. Un cytomètre en flux (FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, NJ, États-Unis) a été utilisé pour tester la distribution du cycle cellulaire.

L'apoptose cellulaire a été testée par double coloration à l'Annexine V/PI. Les cellules endothéliales détachées ont été recueillies et lavées avec du PBS 3 fois. Les cellules ont été remises en suspension avec 100 L de tampon de liaison 1 x pré-refroidi et mélangées avec 5 L d'annexine et 5 L de PI, respectivement. L'apoptose cellulaire a été testée par un cytomètre en flux. Avec AnnexinV comme axe transversal et PI comme axe longitudinal, le quadrant supérieur gauche représentait les cellules blessées mécaniques (AnnexinV ⁻ /PI ⁺ ), le quadrant supérieur droit pour les cellules apoptotiques tardives ou les cellules nécrotiques (AnnexinV ⁺ /PI ⁺ ), le quadrant inférieur gauche pour les cellules normales négatives (AnnexinV ⁻ /PI ⁻ ), et le quadrant inférieur droit pour les cellules apoptotiques précoces (AnnexinV ⁺ /PI ⁻ ). Les cellules apoptotiques totales (AnnexinV ⁺ /PI ⁻ et AnnexinV ⁺ /PI ⁺ ) ont été calculés et exprimés en pourcentage.

Réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR)

Les ARN totaux dans les tissus et les cellules ont été extraits par Trizol (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, Chine), et la concentration et la pureté de l'ARN ont été déterminées. Le processus de transcription inverse de l'ARN en ADN complémentaire a été conduit conformément aux instructions du kit de transcription inverse (K1621, Fermentas, Maryland, NY, USA). Les séquences d'amorces MALAT1, miR-143 et VEGFA (tableau 1) ont été conçues et composées par Genechem. Pour évaluer l'expression d'ARNlnc, de miARN ou d'ARNm, la RT-qPCR a été réalisée à l'aide de SYBR GreenPCR Master Mix (Takara, Tokyo, Japon) avec le système Roche Real-Time PCR (Roche). U6 a été défini comme paramètre interne de miR-143, tandis que MALAT1 et VEGFA, avec la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) comme paramètres internes. Les niveaux transcriptionnels relatifs des gènes cibles ont été calculés par 2 ^−△△Ct méthode.

Analyse Western Blot

Les protéines totales des tissus et des cellules ont été extraites. La concentration en protéines a été déterminée par les instructions du kit d'acide bicinchoninique (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, Chine). La protéine a été séparée par électrophorèse avec un gel de polyacrylamide à 10 % (Boster Biological Technology). La membrane a été transférée sur une membrane en fluorure de polyvinylidène puis scellée avec 5% de BSA pendant 1hh. La membrane a été incubée avec un anticorps primaire contre Ki-67 (1:1000), VEGFA (1:1000), vWF (1:1000) et la métalloprotéinase matricielle (MMP)-9 (1:1000, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) , Cyclin D1 (1:1000), Bax (1:1000) et Bcl-2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, États-Unis) et GAPDH (1:2000, Jackson Immuno Research, Grove, Pennsylvanie, USA) et avec l'anticorps secondaire (1:500, Jackson Immuno Research) marqué au peroxyde de raifort. La membrane a été obtenue par le système d'imagerie à balayage par fluorescence infrarouge bicolore Odyssey, et les valeurs de gris des bandes ont été mesurées par le logiciel d'analyse d'image Quantity One.

Dosage du gène rapporteur double luciférase

Les sites de liaison de MALAT1 et miR-143 ont été prévus et exposés par le site Web de bioinformatique (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). La relation de liaison entre MALAT1 et miR-143 a été en outre vérifiée par dosage du gène rapporteur de la luciférase. Le fragment de gène synthétique MALAT1 3'région non traduite (3'UTR) a été introduit dans des vecteurs rapporteurs de luciférase pmiR-Report (Thermo Fisher Scientific) pour générer MALAT1 de type sauvage (MALAT1-WT) par le site d'endonucléase Bamh1 et Ecor1. Le site de mutation de la séquence complémentaire de la séquence a été conçu sur MALAT1-WT, et le fragment cible a été inséré dans les vecteurs rapporteurs de luciférase pmiR-Report pour produire le type mutant MALAT1 (MALAT1-MUT) par T4 DNA ligase après digestion par endonucléase de restriction. Les MALAT1-WT et MALAT1-MUT correctement séquencés ont été co-transfectés avec mimic NC et miR-143 mimic dans des cellules endothéliales vasculaires. Les cellules ont été récoltées et lysées 48h après transfection, et l'activité luciférase a été testée par un kit de détection de luciférase (BioVision, San Francisco, CA, USA) avec un luminomètre (Glomax20/20, Promega, Madison, Wisconsin, USA).

La relation cible de miR-143 et VEGFA et le site de liaison de miR-143 et VEGFA 3′UTR ont été prévues via le site Web de bioinformatique (http://www.targetscan.org/vert_72/). La séquence de la région du promoteur VEGFA 3'UTR contenant le site de liaison miR-143 a été composée et clonée dans des vecteurs rapporteurs de luciférase pmiR-Report pour générer VEGFA-WT. Sur la base de ce journaliste, le site de liaison de VEGFA-WT et miR-143 a été muté pour former VEGFA-MUT. Le rapporteur VEGFA-WT ou VEGFA-MUT a été mélangé avec mimic NC ou miR-143 mimic puis co-transfecté dans des cellules endothéliales vasculaires pendant 48h. Après cela, les cellules ont été lysées et l'activité luciférase a été testée par un kit de détection de luciférase.

Test d'ARN-traction

Pour vérifier la relation de liaison entre miR-143 et MALAT1, un essai d'extraction d'ARN a été mis en œuvre. Trois séquences de miARN marquées à la biotine Bio-miR-143-WT, Bio-miR-143-MUT et Bio-miR-NC ont été conçues et confiées à GenePharma Company (Shanghai, Chine). Ces oligonucléotides biotinylés ont été transfectés dans des cellules pendant 48h. Ensuite, les cellules ont été récoltées et incubées avec un lysat cellulaire spécifique (Ambion, Austin, Texas, USA) pendant 10 min. Après cela, le lysat a été éclos avec des billes de streptavidine M-280 pré-enrobées d'ARNt sans RNase et de levure (tous de Sigma) à 4 °C pendant 3 h, puis nettoyé deux fois avec une solution de lyse froide, trois fois avec un faible tampon salé, et une fois avec une solution tampon à haute teneur en sel. Une sonde miR-143 antagoniste a été établie en tant que NC. L'ARN total a été extrait avec du Trizol, puis le niveau d'enrichissement en MALAT1 a été testé par RT-qPCR.

Analyse statistique

Toutes les données ont été présentées par le logiciel SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Les données de mesure étaient représentées par la moyenne ± écart type. Les comparaisons entre deux groupes ont été réalisées par échantillon indépendant t test, tandis que les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA), et la comparaison par paires a été mise en œuvre par le test de comparaisons multiples de Tukey. La relation entre l'expression de MALAT1 et les caractéristiques clinicopathologiques de l'IA a été déterminée par le test du chi carré. P une valeur inférieure à 0,05 était indicative d'une différence statistiquement significative.

Résultats

MALAT1 et VEGFA sont surexprimés et miR-143 est régulé à la baisse dans les tissus IA

L'expression de l'ET-1 et du vWF dans le sérum dans le groupe IA et le groupe témoin a été détectée par ELISA, et les résultats ont montré que l'expression de l'ET-1 et du vWF a augmenté dans le groupe IA par rapport au groupe témoin (à la fois P <0,05) (Fig. 1a, b).

MALAT1 et VEGFA sont surexprimés et miR-143 est régulé à la baisse dans les tissus IA. un Expression d'ET-1 dans le sérum de patients atteints d'IA et de patients épileptiques du lobe temporal par ELISA. b Expression du vWF dans le sérum de patients IA et de patients épileptiques du lobe temporal par ELISA. c Observation pathologique des tissus IA et des tissus artériels normaux par coloration HE. d Observation morphologique des tissus IA et des tissus artériels normaux par un microscope électronique à transmission. e Expression de l'ARNm de MALAT1, miR-143 et VEGFA dans les tissus IA et les tissus artériels normaux par RT-qPCR. f Expression des protéines VEGFA, MMP-9 et vWF dans les tissus IA et les tissus artériels normaux par analyse western blot. Cellules endothéliales (CE), lame élastique interne (IEL), cellules musculaires lisses (SMC). Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne ± écart type ; les comparaisons entre les groupes ont été effectuées par un échantillon indépendant t tester

Les changements pathologiques des tissus IA ont été observés par coloration HE. Aucun dommage évident dans l'endoderme, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses n'a été observé dans les tissus artériels normaux, et les cellules étaient bien arrangées et avaient une structure complète. Les tissus IA présentaient des cellules endothéliales endommagées, des cellules musculaires lisses dégénérées, une paroi artérielle atténuée, des fibres élastiques rompues et des cellules inflammatoires infiltrées (Fig. 1c).

Les changements d'ultrastructure de l'IA et des tissus artériels normaux ont été observés au microscope électronique à transmission. Il a été constaté que les cellules endothéliales étaient complètes et que la structure de l'adventice était intacte; aucune rupture de membrane élastique interne ou de cellules musculaires lisses apoptotiques n'a été observée dans les tissus artériels normaux. Dans les tissus IA, il s'agissait d'une dégénérescence sévère de la paroi des vaisseaux sanguins, se manifestant principalement par la disparition de la plupart des cellules endothéliales, une couche élastique interne gravement rompue, des cellules musculaires lisses gravement endommagées et dégradées et un trouble de la membrane externe du vaisseau sanguin. (Fig. 1d).

La RT-qPCR a été menée pour déterminer l'expression de l'ARNm de MALAT1, miR-143 et VEGFA, tandis que l'analyse par transfert western pour l'expression des protéines VEGFA, MMP-9 et vWF dans les tissus IA et les tissus artériels normaux. Il a été démontré que contrairement aux tissus artériels normaux, les niveaux d'expression de MALAT1, VEGFA, MMP-9 et vWF étaient accrus et que l'expression de miR-143 était dégradée dans les tissus IA (tous les P <0,05) (Fig. 1e, f).

Le grade de Hunt-Hess, le degré de lésion endothéliale et les antécédents de tabagisme sont corrélés à l'expression de MALAT1 dans les tissus IA

Au vu de l'expression médiane de MALAT1, les patients ont été répartis en deux groupes :groupe à faible expression et groupe à forte expression. La relation entre l'expression de MALAT1 et les caractéristiques clinicopathologiques des patients atteints d'IA a été analysée. Les résultats suggèrent que le grade de Hunt-Hess, le degré de lésion endothéliale et les antécédents de tabagisme étaient associés à l'expression de MALAT1 (tous P <0,05), tandis que l'âge, le sexe et le mode opératoire n'étaient pas liés à l'expression de MALAT1 (tous les P> 0,05) (Tableau 2).

MALAT1 régulé à la baisse réprime la pression artérielle, l'expression de l'ET-1, du vWF et de la MMP-9, ainsi que l'indice apoptotique des cellules endothéliales vasculaires de rats avec IA

Comme le montre le tableau 3, la précipitation de MALAT1 s'est dégradée, tandis que la restauration de MALAT1 a augmenté la pression artérielle à la 4e et à la 12e semaine.

L'ELISA a révélé que la régulation négative de MALAT1 réduisait, tandis que la régulation positive de MALAT1 augmentait l'expression de l'ET-1 et du vWF dans le sérum de rats atteints d'IA (Fig. 2a, b).

MALAT1 régulé à la baisse réprime la pression artérielle, l'expression de l'ET-1, du vWF et de la MMP-9, ainsi que l'indice d'apoptose des cellules endothéliales vasculaires des rats atteints d'IA. un Expression d'ET-1 dans le sérum de rats par ELISA. b Expression du vWF dans le sérum de rats par ELISA. c Modifications pathologiques des tissus IA chez le rat observées par coloration HE. d L'ultrastructure des tissus IA chez le rat observée au microscope électronique à transmission. e Apoptose des cellules endothéliales vasculaires par coloration TUNEL. f Indice d'apoptose des cellules endothéliales vasculaires du rat. g Expression de l'ARNm de MALAT1, miR-143 et VEGFA dans les tissus IA de rats par RT-qPCR. h Expression des protéines VEGFA, MMP-9 et vWF dans les tissus IA de rats par analyse western blot. * P <0,05 vs le groupe sh-NC, # P <0,05 vs le groupe Oe-NC. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne ± écart type, et les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par une analyse de variance à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Tukey

Les changements pathologiques des tissus IA dans chaque groupe ont été étudiés avec une coloration HE. Le groupe blanc, le groupe sh-NC et le groupe Oe-NC se sont manifestés avec une membrane interne endommagée, des cellules endothéliales exfoliées, des cellules musculaires lisses dégénérées, des cellules et des couches réduites et une paroi artérielle amincie. Dans le groupe sh-MALAT1, l'endoderme, les cellules endothéliales, la couche de cellules musculaires lisses et la couche de membrane externe de l'artère intracrânienne étaient légèrement endommagés mais bien disposés. Le groupe Oe-MALAT1 présentait une disparition de la couche intimale, des cellules endothéliales exfoliées, des fibres élastiques brisées et des cellules inflammatoires infiltrées (Fig. 2c).

Les tissus IA des rats de chaque groupe ont été observés au microscope électronique à transmission. Il a été montré que des cellules endothéliales dénaturées, une couche sous-endothéliale désintégrée, une couche élastique interne disparue et une diminution des cellules musculaires lisses étaient présentées dans le groupe blanc, le groupe sh-NC et le groupe Oe-NC. Le groupe sh-MALAT1 présentait des cellules endothéliales plates, un noyau ovale et une augmentation des fibres de collagène mais sans couche élastique. Le groupe Oe-MALAT1 était caractérisé par des cellules endothéliales disparues et une couche élastique séparée de la couche musculaire, qui s'est désintégrée dans la lumière (Fig. 2d).

L'indice d'apoptose des cellules endothéliales vasculaires chez le rat IA a été testé par coloration TUNEL. Silencing MALAT1 a réduit l'indice d'apoptose des cellules endothéliales vasculaires, tandis que MALAT1 surexprimé a présenté l'effet inverse (Fig. 2e, f).

La détection par RT-qPCR de l'expression de l'ARNm de MALAT1, miR-143 et VEGFA et l'analyse par transfert western de l'expression des protéines VEGFA, MMP-9 et vWF dans les tissus IA ont montré que l'élimination de MALAT1 déprimait l'expression de MALAT1, VEGFA, MMP-9 et vWF , et une expression accrue de miR-143. Au contraire, l'élévation de MALAT1 a imposé les influences opposées sur ces expressions géniques (Fig. 2g, h).

La faible expression de MALAT1 améliore la viabilité et limite l'apoptose des cellules endothéliales vasculaires dans l'IA

La coloration immunohistochimique a été utilisée pour détecter l'expression du marqueur spécifique endothélial vWF. Il s'est manifesté que le cytoplasme des cellules endothéliales vasculaires IA était recouvert de fines particules brunes, ce qui était positif, tandis que le cytoplasme de son groupe NC n'avait pas de particules brunes. Les résultats ont confirmé que les cellules cultivées étaient des cellules endothéliales (Fig. 3a, b).

Low expression of MALAT1 advances viability and restrains apoptosis of vascular endothelial cells in IA. un vWF immunohistochemical staining in IA vascular endothelial cells:IA vascular endothelial cells were covered with fine yellow particles. b vWF immunohistochemical staining in IA vascular endothelial cells:IA vascular endothelial cells showed no brown particles in the NC group. c Vascular endothelial cell viability in each group by MTT assay. d Protein expression of CyclinD1 and Ki-67 in each group by western blot analysis. e Cell cycle changes in each group by PI staining. f Cell apoptosis rate in each group by Annexin V/PI double staining. g Bax and Bcl-2 protein expression in each group by western blot analysis. * P <0.05 vs. the sh-NC group, # P <0.05 vs. the Oe-NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way analysis of variance followed with Tukey’s multiple comparisons test

MTT assay, flow cytometry, together with western blot analysis were utilized to test vascular endothelial cell viability and apoptosis. It was displayed that MALAT1 diminution promoted vascular endothelial cell viability (heightened Cyclin D1 and Ki-67 expression) and depressed apoptosis (decreased G0/G1 phase cells and increased S and G2/M phase cells, reduced Bax and elevated Bcl-2 expression). However, MALAT1 upregulation functioned in an opposite way to that of MALAT1 diminution on cell viability and apoptosis (Fig. 3c–g).

MiR-143 Is Bound to MALAT1 and VEGFA Is a Target Gene of miR-143

MALA1, miR-143, and VEGFA expression in vascular endothelial cells of each group were verified through RT-qPCR and western blot analysis. The results presented that MALA1 knockdown depressed MALA1 and VEGFA expression and enhanced miR-143 expression. On the contrary, MALA1 upregulation led to the increment in MALAT1 and VEGFA expression and the reduction in miR-143 expression (Fig. 4a, b).

MiR-143 is bound to MALAT1 and VEGFA is a target gene of miR-143. un MALAT1, miR-143, and VEGFA mRNA expression in vascular endothelial cells of aneurysm in each group. b VEGFA protein expression in vascular endothelial cells of aneurysm in each group. c The binding sites of MALAT1 and miR-143 predicted by the bioinformatics website. d The regulatory relation of MALLA1 and miR-143 validated by dual luciferase reporter gene assay. e The binding relationship between MALAT1 and miR-143 verified by RNA-pull down assay. f The binding sites of miR-143 and VEGFA predicted by the bioinformatics website. g The regulatory relation of miR-143 and VEGFA validated by dual luciferase reporter gene assay. * P <0.05 vs. the sh-NC group, # P <0.05 vs. the Oe-NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, comparisons between two groups were assessed by independent sample t test, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way analysis of variance followed with Tukey’s multiple comparisons test

The specific binding region between MALAT1 and miR-143 was divined by online analysis software (Fig. 4c). The results of dual luciferase reporter gene assay revealed that the luciferase activity was impaired in the MALAT1-WT + miR-143 mimic group versus the MALAT1-WT + mimic-NC group (P <0,05). However, there was no distinct difference in luciferase activity in the MALAT1-MUT + miR-143 mimic group relative to that in the MALAT1-MUT + mimic-NC group (P> 0.05), indicating that miR-143 was specifically bound to MALAT1 (Fig. 4d). The results of RNA-pull down assay reported that the enrichment level of MALAT1 in the Bio-miR-143-WT group was heightened compared to the Bio-miR-NC group (P <0.05), but there was no distinct difference in MALAT1 enrichment level in the Bio-miR-143-MUT group (P> 0.05) (Fig. 4e).

Bioinformatics software divined a targeted relationship between miR-143 and VEGFA (Fig. 4f). The results of luciferase activity showed that the relative luciferase activity repressed after VEGFA-WT and miR-143 mimic co-transfected into vascular endothelial cells (P <0,05). However, the relative luciferase activity of vascular endothelial cells was not affected by co-transfection of VEGFA-MUT and miR-143-mimic (P> 0.05) (Fig. 4g). It was indicated that VEGFA was a direct target gene of miR-143.

Discussion

IA is a serious intracranial disease, which mainly leads to subarachnoid hemorrhage [18]. A previous study has demonstrated the involvements of lncRNA-related competitive endogenous RNA networks in IA [19]. Also, a recent study has provided a proof that functional polymorphism in miR-143/145 gene promoter region is connected with the risk of IA [20]. In a study conducted by Xu et al. , it is shown that overexpression of angiogenic factors, such as VEGFA, may be related to IA formation and rupture [21]. In order to explain the molecular mechanism of MALAT1 in IA, a series of assays have been conducted and the results revealed that IA induced by vascular endothelial injury was regulated by MALAT1/miR-143/VEGFA signal axis.

Firstly, our study has provided substantial evidence that MALAT1 and VEGFA are upregulated and miR-143 is downregulated in IA tissues. A recent study has presented that MALAT1 is one of the most upregulated lncRNAs in the process of cerebral ischemia [22]. Another study has presented that MALAT1 is upregulated in ovarian cancer cells and intends to participate in the processes of ovarian cancer cell apoptosis, migration, and proliferation [23]. A study concerning to the expression profile of unruptured and ruptured IA has demonstrated that the expression of angiogenic factors such as VEGFA is upregulated in ruptured aneurysm [21]. Moreover, a clinical study has presented that the miR-143/145 cluster of IA patients is downregulated compared to healthy subjects [11]. In addition, it is previously discussed that miR-143/145 takes part in various biological processes associated with aneurysm formation and is downregulated in patients with IA [20]. All these findings are more or less echoed with the previous exploration outcomes.

Except for the abovementioned findings, this study has also explored the functional role of MALAT1 in IA through gain-off-function and loss-of-function assays. It could be summarized that downregulation of MALAT1 reduced blood pressure, serum levels of ET-1, and vWF and MMP-9 expression in IA tissues. It has been suggested previously that downregulation of MALAT1 restrains the upregulation of the glucose-induced ET-1 transcription product [24]. Also, it is reported that ectopic MALAT1 expression is the inducer of vWF generation [25]. Another study has verified that the depletion of MALAT1 in bone marrow-derived macrophages inhibits the expression of MMP-9 [26].

Also, cell experiments have been conducted for further confirmation of the functions of MALAT1 in IA. The results have suggested that MALAT1 knockdown promoted vascular endothelial cell viability and depressed apoptosis in IA. Similarly, it has been documented that disturbance of MALAT1 improves aortic mural architecture and retards aneurysm growth [8]. Supplementary to our study finding, there is research highlighting that poor expression of MALAT1 induces apoptosis and restrains proliferation of acute myeloid leukemia cells [27]. Another study has also demonstrated the inhibitory effects of MALAT1 knockdown on proliferation of human osteoarthritis cartilage cells [28]. Besides that, a prior research generally confirms that downregulation of MALAT1 can induce apoptosis and attenuate the proliferation of glioma cells [29]. Moreover, low expression of MALAT1 induced by RNA interference promotes apoptosis and suppresses proliferation of multiple myeloma cells [30]. Collectively, these studies have explained the molecular mechanism of MALAT1 in IA to some extent.

In addition, this study has evidenced that miR-143 is bound to MALAT1 and VEGFA is a target gene of miR-143. Similarly, a paper contends that MALAT1 binds directly to miR-143 and suppresses its expression [10]. Zhu et al. have found that MALAT1 exerts its roles via interacting with miR-143 in cervical carcinoma cells [31]. It is further confirmed that MALAT1 indirectly modulate VEGFA via miR-200b-3p [32]. Moreover, another study has suggested that miR-143-3p mediates ZFPM2 effect on a number of protein targets in blood, including VEGFA [33]. Nevertheless, the interactions among MALAT1, miR-143, and VEGFA in IA have not been discussed and need further study.

Conclusion

From these results, it is clear that MALAT1 knockdown depresses apoptosis and promotes viability of vascular endothelial cells in IA by modulating miR-143/VEGFA axis. The co-expression network suggests the connection between MALAT1 and miR-143 with the involvement of VEGFA. The findings in this study partially disclose the pathogenesis of IA initiation and progression, and the studied targets may be a notably potential entry point to reveal pathology of IA from another perspective. Limitedly, further large-scale studies are required to comprehensively illustrate the mechanisms of MALAT1/miR-143/VEGFA axis in IA.