Nec-1 atténue la neurotoxicité induite par les nanomatériaux de dioxyde de titane sur les cellules Sh-Sy5y via RIP1

Introduction

En raison de leurs splendides propriétés physico-chimiques, les nanomatériaux de dioxyde de titane sont synthétisés [1] et largement utilisés à des fins diverses, telles que la cosmétique [2], les domaines industriels [3, 4] et les domaines médicaux [5]. Cependant, cette utilisation généralisée peut constituer une menace importante pour la santé humaine [6]. Une fois exposées, la majorité des nanoparticules de dioxyde de titane (TNP) pénètrent dans le corps humain par inhalation et ingestion [6]. Le système respiratoire [7], le système digestif [8] et le système cardiovasculaire [9] peuvent tous être interrompus par les TNP absorbés. De même, le cerveau, en tant que partie la plus importante du système nerveux central, peut également être perturbé, car les TNP dans la circulation peuvent pénétrer la barrière hémato-encéphalique et les NP inhalées pourraient être transportées dans le cerveau par la voie olfactive [10] . Une fois que les TNP pénètrent dans le cerveau, ils peuvent s'y accumuler et causer des dommages au cerveau, entraînant des dysfonctionnements. Les dommages au cerveau sont généralement irréversibles et graves, et donc toute cause potentielle de dommage doit être étudiée [11].

Bien qu'aucune étude épidémiologique n'ait exploré l'association entre l'exposition aux TNP et les maladies cérébrales, de nombreuses études in vivo et in vitro ont confirmé la neurotoxicité des TNP [12]. De plus, l'accent a été mis sur la recherche pour découvrir les mécanismes sous-jacents. À cette fin, nous avons précédemment examiné les mécanismes moléculaires actuellement connus de la neurotoxicité des TNP et constaté que les processus de mort cellulaire programmée (PCD), tels que l'apoptose et l'autophagie, étaient impliqués dans la neurotoxicité des TNP [13].

La nécroptose, également appelée nécrose régulée, est un autre type de DCP. Contrairement à l'apoptose qui est dépendante de la caspase, la nécroptose est une protéine kinase interagissant avec le récepteur 1/3 (RIP1/RIP3) dépendante. RIP1 activé recrute RIP3 pour former un nécrosome, qui active la protéine de type kinase de lignée mixte (MLKL) pour initier la nécroptose [14]. La nécroptose peut réguler la mort cellulaire et la neuroinflammation [15, 16], qui sont toutes deux impliquées dans la neurotoxicité des TNP. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que la nécroptose est impliquée dans la neurotoxicité causée par les TNP.

Pour tester notre hypothèse, nous avons réalisé une étude in vitro pour explorer le rôle de la nécroptose dans la neurotoxicité des TNP. Dans cette étude, la viabilité cellulaire, la fuite de LDH et les cytokines inflammatoires (TNF-α, IL-1β, IL-6 et IL-8) ont été mesurées après exposition aux TNP. Tout d'abord, les cellules SH-SY5Y ont été cultivées avec diverses concentrations de TNP. Deuxièmement, les cellules ont été exposées à des TNP avec ou sans Nec-1, qui est un puissant inhibiteur de la nécroptose. Troisièmement, l'expression du gène RIP1, qui peut être supprimée par Nec-1, a été réduite au silence à l'aide d'ARNsi, après quoi les cellules mutantes et de type sauvage ont été traitées avec des TNP. Cette étude met en lumière la compréhension globale des mécanismes moléculaires sous-jacents à la neurotoxicité des TNP.

Résultats

Les TNP inhibent la viabilité cellulaire

Pour vérifier la cytotoxicité des TNP sur les cellules SH-SY5Y, nous avons d'abord évalué la viabilité cellulaire à l'aide du test CCK8. Les cellules ont été cultivées avec des concentrations de TNP allant de 5 à 160 g/mL pendant 24, 48 et 72 h. Comme le montre la figure 1, la viabilité cellulaire est restée inchangée dans les cellules traitées avec 5, 10, 20 et 40 g/mL après 24 h d'exposition. Lorsque les cellules ont été traitées pendant 48 et 72 h, la viabilité cellulaire est restée inchangée uniquement dans le groupe 5 g/mL (p =0,4507 à 48 h et p =0,1002 à 72h). De plus, la viabilité cellulaire était considérablement plus faible dans les cellules traitées avec 80 g/mL de TNP après 48 (p =0,0007) et 72 h (p =0,0008). Sur la base de ces résultats, nous avons conclu que les TNP diminuaient la viabilité cellulaire d'une manière dépendante de la dose et du temps (données non présentées), indiquant que l'exposition à long terme était plus toxique.

Différentes concentrations d'exposition au TiO2-NPs sur la viabilité cellulaire des cellules SH-SY5Y à 24, 48 et 72 h et fuite de LDH à 72 h. (Par rapport au groupe témoin, ^* p <0,05, ^** p <0,01, ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Intégrité de la membrane endommagée par les TNP

Nest, nous avons analysé les effets toxiques des TNP sur l'intégrité membranaire après 72 h d'exposition. L'intégrité de la membrane a été évaluée en mesurant la fuite de LDH. Comme le montre la figure 1b, les niveaux de LDH ont été significativement augmentés dans les cellules traitées avec des TNP à des doses supérieures à 5 g/mL. Une augmentation de la production de LDH a été observée dans les cellules traitées avec 40, 80 et 160 g/mL (p <0,0001). Ces résultats suggèrent que les TNP ont augmenté les niveaux de LDH de manière dose-dépendante, ce qui était similaire au test CCK8.

L'exposition aux TNP favorise l'inflammation

La réponse inflammatoire après exposition aux TNP a été analysée par ELISA. Après que les cellules aient été traitées avec diverses concentrations de TNP pendant 72 h, les niveaux de TNF-α, IL-1β, IL-6 et IL-8 ont été mesurés. Comme le montre la figure 2, la sécrétion d'IL-8 était régulée à la hausse dans toutes les cellules traitées par les TNP; les niveaux de TNF-α, IL-1β, IL-6 et IL-8 étaient uniformément élevés dans les cellules traitées avec des doses supérieures à 5 μg/mL (p <0,01). De plus, l'inflammation était significativement plus élevée dans les cellules traitées avec des doses supérieures à 10 g/mL du groupe (p <0,0001). Dans l'ensemble, les TNP ont amélioré l'inflammation d'une manière dose-dépendante.

Exposition à différentes concentrations de TiO2-NPs (μg/mL) sur l'inflammation des cellules SH-SY5Y à 72 h. (Par rapport au groupe témoin, ^**** p <0,0001)

Nos résultats ont indiqué que les TNP induisaient des lésions inflammatoires de manière dose-dépendante. Nous avons adopté une concentration de TNP de 80 μg/mL et une période d'exposition de 72 h dans les expériences suivantes pour explorer le rôle de la nécroptose dans la neurotoxicité des TNP.

Le co-traitement Nec-1 inhibe la neurotoxicité des TNP

Pour analyser le rôle de la nécroptose dans les lésions inflammatoires, nous avons co-traité des cellules avec Nec-1 (un inhibiteur de la nécroptose) et des TNP. Comme le montre la figure 3a, les cellules SH-SY5Y ont été exposées à des TNP ou à des TNP + Nec-1 (1, 5, 10, 15 ou 20 M), et nous avons constaté que Nec-1 améliorait considérablement la réduction induite par les TNP viabilité cellulaire (10, 15, 20 M) (p <0,0001). Comme la viabilité cellulaire dans les groupes traités avec 15 M et 20 M n'était pas supérieure à celle des groupes traités avec 10 M (p =0,6643 et p =0,6292), nous avons co-traité les cellules avec 10 M de Nec-1 pour analyser l'effet sur l'intégrité de la membrane.

Les effets de Nec-1 sur la viabilité cellulaire et la LDH après exposition aux TNP. ( ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Après avoir cultivé des cellules avec des TNP ou des TNP + Nec-1, nous avons constaté que les niveaux de LDH dans le groupe TNP + Nec-1 étaient bien inférieurs à ceux du groupe TNP seuls (p =0,0005). En outre, le traitement avec Nec-1 seul n'a pas augmenté la fuite de LDH (p =0,9878).

En conclusion, 10 M de Nec-1 pourraient inhiber efficacement la cytotoxicité des TNP et n'étaient pas toxique pour les cellules.

Pour analyser la capacité anti-inflammatoire de Nec-1, des cellules ont été cultivées avec des TNP ou des TNP + Nec-1. Comme le montre la figure 4, la production de TNF-α (p =0,003), IL-1β (p =0,0013), IL-6 (p <0,0001), et IL-8 (p =0,0004) était significativement plus faible dans le groupe TNP + Nec-1 que dans le groupe TNP.

Les effets de Nec-1 sur l'inflammation après exposition aux TNP. ( ^** p <0,01, ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Ces résultats impliquent que Nec-1 peut atténuer les réponses inflammatoires induites par l'exposition aux TNP.

Le silence RIP1 atténue les blessures inflammatoires induites par les TNP

Pour déterminer si Nec-1 a abrogé les lésions inflammatoires induites par les TNP via RIP1, nous avons efficacement réduit au silence l'expression de RIP1 des cellules à l'aide d'ARNsi (Fig. 5, p <0,0001). Ensuite, la lésion inflammatoire après exposition aux TNP sur des cellules mutantes et de type sauvage a été mesurée. La figure 6a démontre que la viabilité cellulaire dans le groupe TNP + si-RIP1 était remarquablement supérieure à celle du groupe TNP + si-NC (p =0,0002). Production de LDH (Fig. 6b, p <0,0001) et les niveaux de TNF-α (p <0,0001), IL-1β (p =0,0001), IL-6 (p <0,0001), et IL-8 (p =0,0001) (Fig. 7) dans le groupe TNP + si-RIP1 étaient considérablement plus bas que dans le groupe TNP + si-NC. Ces résultats ont indiqué que les TNP favorisaient les lésions inflammatoires via RIP1.

L'expression de l'ARNm après les cellules SH-SY5Y transfectées avec si-RIP1. ( ^**** p <0,0001)

Viabilité cellulaire et fuite de LDH après que des cellules mutantes et de type sauvage aient été exposées à des TNP. ( ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Inflammation après que les cellules mutantes et de type sauvage ont été exposées aux TNP. ( ^*** p <0,001, ^**** p <0,0001)

Discussion

Dans cette étude, nous avons constaté que l'exposition aux TNP induisait une cytotoxicité sur les cellules SH-SY5Y de manière dose-dépendante et que la nécroptose était impliquée dans la neurotoxicité des TNP. Pour explorer le rôle de la nécroptose, nous avons exposé des cellules à des TNP avec ou sans Nec-1 (un puissant inhibiteur de la nécroptose) [17, 18] et mesuré la viabilité cellulaire, la fuite de LDH et les niveaux de cytokines inflammatoires. Nos données suggèrent que le co-traitement Nec-1 peut atténuer les lésions inflammatoires induites par les TNP. Étant donné que des études ont montré que Nec-1 exerce ses effets en supprimant l'activité de RIP1, nous avons transfecté des cellules avec si-RIP1 pour déterminer si RIP1 était impliqué dans les effets protecteurs de Nec-1. Les cellules mutantes et de type sauvage ont été traitées avec des TNP et la lésion inflammatoire a été évaluée. Cela a indiqué que la viabilité cellulaire dans le groupe si-RIP1 était plus élevée que dans le groupe si-NC, et les niveaux de fuite de LDH et de cytokines inflammatoires étaient plus faibles dans le groupe si-RIP1 que dans le groupe si-NC après exposition aux TNP. . En conclusion, la présente étude a révélé pour la première fois que la nécroptose est impliquée dans les lésions inflammatoires induites par les TNP sur les cellules.

Nous avons reconfirmé la neurotoxicité des TNP dans notre étude in vitro. Après que les cellules SH-SY5Y aient été exposées à diverses concentrations de TNP pendant diverses durées d'incubation, la viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide du test CCK8. Comme le montre la figure 1a, l'exposition aux TNP a réduit la viabilité cellulaire d'une manière dose-dépendante ; après 48 h et 72 h d'exposition, la viabilité cellulaire dans les groupes 80 et 160 TNP a été considérablement diminuée par rapport au groupe témoin (p <0,001). Pour confirmer davantage la cytotoxicité, nous avons également mesuré la fuite de LDH. Les données de la figure 1b ont révélé que la production de LDH augmentait de manière dose-dépendante après 72 h d'exposition, et les niveaux de LDH dans les groupes 40, 80 et 160 étaient remarquablement plus élevés que ceux du groupe témoin (p <0,0001). Étant donné que des études antérieures ont montré que la neuroinflammation peut être favorisée par l'exposition aux TNP [19], les niveaux de TNF-α, IL-1β, IL-6 et IL-8 ont également été mesurés. La figure 2 montre que les niveaux de ces quatre cytokines inflammatoires étaient significativement régulés à la hausse par rapport au groupe témoin et étaient considérablement plus élevés dans les groupes traités avec 20 à 160 g/mL (p <0,0001). Pris ensemble, nos résultats ont indiqué que les TNP pourraient induire une neurotoxicité d'une manière dose-dépendante, ce qui est cohérent avec les études précédentes. Les TNP peuvent être absorbés par les cellules neuronales et inhiber la prolifération [20,21,22]. De plus, l'exposition aux TNP peut diminuer la viabilité cellulaire et favoriser la fuite de LDH d'une manière dose-dépendante [23,24,25,26,27].

Nous avons co-traité des cellules avec Nec-1 pour déterminer si la nécroptose était impliquée dans la neurotoxicité causée par les TNP. Après que les cellules aient été traitées avec des concentrations indiquées de TNP avec ou sans Nec-1, la viabilité cellulaire, la fuite de LDH et l'inflammation ont été évaluées. La figure 3a montre que la réduction de la viabilité cellulaire après exposition aux TNP a été significativement inhibée par le co-traitement avec 10 M de Nec-1. Pendant ce temps, la figure 3b a révélé que le traitement avec 10 M de Nec-1 n'augmentait pas les niveaux de LDH et que les niveaux de LDH dans les cellules traitées avec le groupe TNP + Nec-1 étaient considérablement inférieurs à ceux du groupe TNP seuls. Ensuite, nous avons mesuré les effets du co-traitement avec Nec-1 sur l'inflammation induite par les TNP. La figure 4 illustre que les niveaux de TNF-α, IL-1β, IL-6 et IL-8 étaient remarquablement inférieurs dans les cellules traitées avec les TNP + Nec-1. Ces résultats ont confirmé que Nec-1 pouvait protéger les cellules de la mort et des processus inflammatoires [28, 29].

Enfin, puisque RIP1 est la cible de Nec-1, nous avons évalué si RIP1 pouvait réguler la neurotoxicité des TNP. Nous avons construit des cellules mutantes en inhibant l'expression de RIP1 (Fig. 5). Les données de la figure 6 et de la figure 7 ont révélé qu'après exposition aux TNP, la viabilité cellulaire était plus élevée et que les niveaux de LDH, TNF-α, IL-1β, IL-6 et IL-8 étaient inférieurs dans le groupe si-RIP1 que celui dans le si-NC, ce qui suggère que les TNP favorisent la cytotoxicité via RIP1. De même, plusieurs études ont découvert que RIP1 peut à la fois réguler la mort cellulaire et les processus inflammatoires [30, 31].

Bien que nous rapportions pour la première fois que Nec-1 peut atténuer la neurotoxicité des TNP en supprimant la voie de signalisation de la nécroptose, notre étude présente quelques limites. Premièrement, la cytotoxicité des matériaux nanométriques diffère de leurs matériaux en vrac et pourrait être largement influencée par les propriétés de surface [32], ce qui peut expliquer le résultat contraire d'une viabilité cellulaire accrue trouvé par Sebastián et al. [33]. Par conséquent, il est essentiel d'évaluer de manière exhaustive la nanotoxicité sur des sujets sous plusieurs aspects, tels que la prolifération cellulaire, l'intégrité de la membrane, le stress oxydatif, l'inflammation, la fonction mitochondriale, le cycle cellulaire, le cytosquelette et l'épigénétique. Deuxièmement, RIP1 peut recruter RIP3 pour former un nécrosome fonctionnel, un activateur vital de MLKL, pour initier la nécroptose [34]. Nous émettons l'hypothèse que RIP3/MLKL pourrait être impliqué dans la neurotoxicité des TNP, ce qui devrait être exploré dans de futurs travaux. En outre, les associations de RIP3/MLKL avec la neurotoxicité des TNP devraient également être évaluées. Troisièmement, les espèces réactives de l'oxygène (ROS), en tant que principaux mécanismes sous-jacents à la neurotoxicité des TNP [35, 36], seraient le signal en amont de RIP1 [37]. Par conséquent, la question de savoir si les ROS sont en amont de RIP1 dans la neurotoxicité des TNP doit être discutée plus en détail. Quatrièmement, les cellules doivent être exposées à des concentrations non toxiques (TNP <5 g/mL) pendant une longue période (plus de 72 h) pour évaluer la cytotoxicité chronique. Cinquièmement, nous devrions évaluer le rôle de la nécroptose dans la neurotoxicité des TNP dans davantage de lignées cellulaires neuronales et de cellules neuronales primaires humaines et animales.

Conclusions

Notre étude a révélé que la nécroptose est un autre mécanisme de mort cellulaire programmée impliqué dans la neurotoxicité causée par les TNP. Dans cette étude, nous avons découvert que les TNP pouvaient induire des lésions inflammatoires dans les cellules SH-SY5Y de manière dose-dépendante et que le co-traitement Nec-1 (un puissant inhibiteur de la nécroptose) pouvait améliorer ces effets nocifs. RIP1, la cible de Nec-1, a été réduite au silence par le si-ARN, qui a efficacement atténué les lésions inflammatoires induites par l'exposition aux TNP. En conclusion, Nec-1 a inhibé la lésion inflammatoire des cellules SH-SY5Y induite par l'exposition aux TNP en ciblant la voie RIP1. Les voies de signalisation en amont et en aval de RIP1 impliquées dans la neurotoxicité des TNP devraient être évaluées plus en détail.

Matériaux et méthodes

Préparation des TNP et culture cellulaire

Nous avons précédemment caractérisé les TNP et les avons préparés selon notre procédure précédemment publiée [38]. En bref, les TNP ont été dissous dans du RPMI 1640 à diverses concentrations de 5, 10, 20, 40, 80 et 160 g/mL. La solution de TNP a été stérilisée et soniquée (300 W, 10 min) à température ambiante pour empêcher les particules de s'agréger avant le traitement. Les cellules dans le milieu de culture non exposées aux TNP ont servi de groupe témoin. Des cellules SH-SY5Y, achetées à la Cell Bank of the Shanghai Institute of Life Sciences, Chinese Academy of Sciences, ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT, USA) additionné de 10 % de sérum bovin foetal (Gibco, un produit de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ .

Test de viabilité cellulaire et de fuite LDH

La viabilité cellulaire a été mesurée en utilisant un kit de comptage cellulaire-8 (CCK8. Dojindo, cat n°CK04). Bref, 1 × 10 ⁴ Les cellules SH-SY5Y ont été placées dans une plaque 96 puits et cultivées dans un incubateur à 37°C (5% CO₂ ) pendant 24 h avant l'exposition aux TNP. Les cellules ont ensuite été incubées avec des TNP à diverses concentrations (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 et 80 g/mL) pendant encore 24 h. Après traitement, les cellules ont été incubées avec CCK-8 pendant encore 2 h. Ensuite, la densité optique (DO) a été mesurée à 450 nm en plaçant la plaque à 96 puits dans un lecteur de microplaques (BioTek, Winooski, VT, USA). La viabilité cellulaire de chaque groupe, exprimée en pourcentage, a été calculée comme (ODtraité-ODblank)/(ODcontrol - ODblank) × 100 %.

L'intégrité membranaire a été mesurée par un kit commercial (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Chine). Après que les cellules SH-SY5Y aient été exposées à diverses concentrations de TNP pendant 72 h, la sécrétion de LDH a été analysée conformément aux instructions du fabricant.

Réponse inflammatoire

ELISA a été appliqué pour mesurer les niveaux de TNF-α, IL-1β, IL-6 et IL-8 produits par les cellules SH-SY5Y. En bref, les cellules SH-SY5Y ont été exposées aux TNP pendant 72 h, et le surnageant a été collecté pour analyse selon les instructions du fabricant (Elabscience Biotechnology Co., Ltd.).

transfection d'ARNsi

Suivant le protocole du fabricant, une concentration de 100 nM de si-RIP1 ou de siARN de contrôle négatif (si-NC) a été transfectée dans des cellules à l'aide de Lipofectamine 2000. L'efficacité du silençage génique par siRNA a été estimée par PCR en temps réel.

PCR en temps réel

L'ARN des cellules exposées à diverses concentrations de TNP a été isolé à l'aide du kit RNAqueous (Ambion Inc., Austin, TX, USA) sur la base des instructions du fabricant. L'expression relative de RIP1 a été mesurée par PCR en temps réel. Les niveaux relatifs d'ARNm de RIP1 ont été normalisés par rapport aux expressions de la -actine.

Analyse statistique

Le logiciel SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) a été utilisé pour analyser les données. Une analyse de variance à un facteur a été utilisée pour comparer les moyennes des groupes. p <0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Disponibilité des données et des matériaux

Disponible à partir du manuscrit.

Abréviations

TNP :

Nanoparticules de dioxyde de titane

Nec-1 :

Nécrostatine-1

RIP :

Protéine kinase interagissant avec les récepteurs

MLKL :

Protéine de type domaine kinase de lignée mixte

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène