Fabrication de nanostructures hybrides basées sur des nanoclusters Fe3O4 en tant qu'agents théranostiques pour l'imagerie par résonance magnétique et l'administration de médicaments

Introduction

Ces dernières années, divers systèmes d'administration de médicaments multifonctionnels ont été développés pour un diagnostic et une thérapie futurs dans des applications biomédicales [1,2,3,4]. Les nanostructures hybrides multifonctionnelles qui intègrent des propriétés favorables posséderont des applications importantes telles que l'imagerie multimodale et le diagnostic et la thérapie simultanés [5,6,7,8,9,10,11]. En outre, ces nanostructures sont des systèmes d'administration de médicaments sensibles aux stimuli pour une accumulation de médicaments améliorée, une efficacité thérapeutique améliorée et/ou des effets secondaires réduits. En particulier, ces systèmes d'administration de médicaments sensibles au pH ont suscité un intérêt considérable pour la recherche. En effet, la plupart des tumeurs humaines ont un pH plus acide, ce qui permet de concevoir la libération contrôlée de molécules médicamenteuses [12,13,14,15,16].

Au cours des dernières décennies, diverses nanostructures hybrides en combinant des nanomatériaux inorganiques avec un polymère organique [17,18,19,20] ont été développées, notamment des particules magnétiques [21,22,23], des nanoparticules de conversion ascendante (NPs) [17, 24] , et des particules de silice mésoporeuses [25]. Parmi celles-ci, les nanostructures hybrides magnétiques à base d'oxydes de fer avec une aimantation relativement importante à température ambiante ont été largement utilisées dans les domaines biomédicaux [26,27,28,29]. La fonctionnalisation de nanomatériaux inorganiques recouverts de couches de polyélectrolyte peut réaliser une encapsulation sensible au pH et une libération de molécules médicamenteuses [12, 17, 30]. Plus récemment, les couches polyélectrolytiques composées de sodium poly (styrène sulfonate) (PSS) et du polycation poly(allylamine hydrochloride) (PAH) ont été largement étudiées [31,32,33,34,35,36]. Des couches de polyélectrolyte combinées avec des NP magnétiques et luminescentes ou des molécules médicamenteuses pour des systèmes d'administration de médicaments multifonctionnels ont également été récemment rapportées [37,38,39]. Oxyde de fer (Fe₃ O₄ ) Les NP reçoivent de plus en plus d'attention dans le domaine de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et de l'administration de médicaments en raison de leurs propriétés superparamagnétiques uniques, de leur biocompatibilité, de leur faible cytotoxicité et de leur flexibilité [9, 11, 28, 29, 40, 41, 42 ]. En général, il existe deux méthodes pour améliorer la réactivité magnétique de Fe₃ O₄ NPs. La première consiste à synthétiser les particules de magnétite de taille micrométrique. En raison de leur grande taille, cependant, ils ont tendance à s'agréger en solution aqueuse, ce qui n'est pas bénéfique pour les applications biomédicales. L'autre approche consiste à assembler Fe₃ O₄ NPs en nanoclusters (NCs). Ces Fe₃ O₄ Les NC ont considérablement amélioré la réactivité magnétique par rapport à Fe₃ individuel O₄ NP [22, 43]. Par conséquent, si le Fe₃ auto-assemblé O₄ Les NC sont adoptés comme noyau pour fabriquer des nanostructures hybrides multifonctionnelles, les performances de l'IRM seront améliorées par l'effet collectif de Fe₃ O₄ NP [43,44,45]. A notre connaissance, le Fe₃ auto-assemblé O₄ Des NC fonctionnalisées avec des multicouches PAH/PSS pour une libération de médicament sensible au pH ont rarement été rapportées.

Dans ce travail, une nanoplateforme théranostique polyvalente basée sur Fe₃ O₄ NPs a été construit pour l'IRM et l'administration de médicaments. Dans notre approche, Fe₃ O₄ Des nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été obtenues en combinant une méthode de microémulsion huile-dans-eau et une méthode d'adsorption électrostatique couche par couche (LBL). Il est prévu que le Fe₃ emballé O₄ Le système NC peut conduire à un T amélioré ₂ relaxivité et contraste d'imagerie, et la grande surface spécifique de Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS permettent une forte charge de médicaments anticancéreux. De plus, l'expérience in vitro montre que le contraste de l'IRM cellulaire des cellules du cancer du poumon humain (A549) incubées avec Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX a été considérablement amélioré.

Matériaux et méthodes

Matériaux

FeCl₃ ·6H₂ O (99,99 %), FeCl₂ ·4H₂ O (99,99 %), l'acide oléique (OA, 90 %) et le 1-octadécène (ODE, 90 %) ont été achetés auprès d'Alfa Aeasar. Oléate de sodium (NaOA), éthanol, hexane, cyclohexane, isopropanol, dodécyl benzène sulfonate de sodium (SDBS), fluorure d'ammonium (NH₄ F), l'hydroxyde de sodium (NaOH), le diméthylsulfoxyde (DMSO) et l'ammoniac ont été achetés auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd (Chine). Le poly(chlorhydrate d'allylamine) (PAH), le poly(styrène sulfonate) (PSS) et le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich. Le médicament anticancéreux chlorhydrate de doxorubicine (DOX,> 98 %) a été acheté auprès de Shanghai Sangon Biotech Company (Shanghai, Chine). Le milieu de croissance APMI 1640 et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été achetés auprès de Hyclone. Tous les réactifs ont été utilisés tels qu'ils ont été reçus sans autre purification.

Préparation de l'oléate ferrique

La synthèse des NP magnétiques est partie de la synthèse de l'oléate ferrique. FeCl₃ ·6H₂ O (2,59 g), NaOA (14,6 g), C₂ H₅ OH (32 mL), H₂ O (24 mL) et l'hexane (56 mL) ont été mélangés ensemble dans un ballon à trois cols de 150 ml et chauffés à 70 °C pour reflux pendant 4 h pour former une solution transparente de complexes d'oléate ferrique. Après cela, le liquide a été séparé par un entonnoir de séparation et la couche d'huile supérieure a été préservée. L'hexane dans le liquide s'est évaporé à 70°C par évaporation rotative et séché pendant 48 h sous vide. Les échantillons préparés ont été stockés dans une boîte à gants sous vide pour une utilisation ultérieure.

Synthèse de Fe₃ O₄ NP

Nous avons synthétisé Fe₃ O₄ NPs suivant les procédures précédemment rapportées avec une légère modification [46]. L'oléate ferrique (7,2 g), l'OA (1,28 mL) et l'ODE (50 mL) ont été mélangés ensemble dans un ballon à trois cols de 100 mL et chauffés à 300 °C pendant 40 min sous protection d'argon ; après cela, le mélange a été refroidi à température ambiante et oxydé à l'air pendant plus de 12 h. Les nanocristaux résultants ont été précipités par l'ajout d'isopropanol, centrifugés et lavés deux fois avec un mélange éthanol-eau (1:1 v /v ). Le Fe₃ coiffé par l'acide oléique O₄ Les NP ont finalement été dispersées dans 200  mL de cyclohexane, et le surnageant a été scellé et stocké pour les expériences ultérieures.

Préparation de Fe₃ O₄ CN

Fe₃ O₄ Les NC ont été préparées par une technique d'auto-assemblage de microémulsion simple et directe comme décrit précédemment avec modification [47]. En bref, une solution à 200 μL de Fe₃ O₄ les nanocristaux dans le cyclohexane ont été versés dans 4 mL de solution aqueuse contenant 14 mg de SDBS. La solution mélangée a subi un traitement aux ultrasons pendant 5 min à 4 reprises. L'émulsion solide-dans-huile-dans-eau (S/O/W) formée a été agitée à température ambiante pendant 6 h pour évaporer le solvant organique suivi de l'auto-assemblage de Fe₃ O₄ NPs pour former des NCs 3D. Les produits finaux ont été lavés avec de l'eau déminéralisée 3 fois pour éliminer l'excès de SDBS, les nanocristaux non incorporés et certains contaminants plus gros.

Préparation de Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX

Le Fe₃ O₄ Des nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été préparées par des interactions attractives électrostatiques. Le Fe₃ tel que préparé O₄ Les NC sont chargées négativement du fait de l'encapsulation des tensioactifs anioniques. Ils ont d'abord été transformés pour être chargés positivement par adsorption d'une couche de polyélectrolyte chargé positivement, le poly(chlorhydrate d'allylamine) (PAH, PM 15 000). Plus précisément, un Fe₃ de 300 μL O₄ L'échantillon NC a d'abord été dilué 10 fois à 3 mL en utilisant de l'eau déminéralisée. Le Fe₃ O₄ Le mélange NC a ensuite été ajouté goutte à goutte à une solution aqueuse de PAH (1 µmL, 10 µg/L, 4 µmM de NaCl) sous agitation vigoureuse. Après que la solution ait été agitée pendant 24  h, l'excès de HAP a été éliminé par centrifugation et le Fe₃ enrobé de HAP résultant O₄ CN (Fe₃ O₄ NC/PAH) ont été redispersés dans l'eau (3 mL).

Le Fe₃ O₄ Les NC/PAH ont ensuite été transformés pour être chargés négativement par adsorption d'une couche de polyélectrolyte chargé négativement, le poly-(sodium 4-styrènesulfonate) (PSS, PM 70 000). Plus précisément, un Fe₃ de 3 mL O₄ La solution d'échantillon de NC/PAH a été ajoutée goutte à goutte à une solution aqueuse de PSS (1 mL, 10 g/L, 4 mM de NaCl) sous agitation vigoureuse. Après que la solution ait été agitée pendant 24  h, l'excès de PSS a été éliminé par centrifugation et le Fe₃ revêtu de PSS résultant O₄ NC/HAP (Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS) ont été redispersés dans l'eau (3 mL).

La solution mère aqueuse DOX a d'abord été préparée [17]. La concentration était de 5,0 µmg/mL. La solution de nanostructure hybride a été obtenue en mélangeant le Fe₃ O₄ Solution NC/PAH/PSS (3 mL, 32 mg/mL) et la solution stock DOX (60 μL) dans un petit tube en plastique sous agitation pendant 24 h en chambre noire. Après centrifugation, le Fe₃ O₄ Des nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont finalement été obtenues.

Mesures IRM

Les mesures IRM ont été réalisées dans un système de micro-imagerie 11,7 T micro 2,5 (Bruker, Allemagne). Le montant différent du Fe₃ O₄ Des nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été dispersées dans une solution aqueuse d'agarose de 1,2 mL puis chargées dans les microtubes pour les mesures IRM. La concentration finale en ions Fe était de 0 mM, 0,013 mM, 0,026 mM, 0,032 mM, 0,041 mM, 0,052 mM et 0,065 mM, respectivement. Les paramètres de mesure sont les suivants :temps de répétition (TR) =300 ms, temps d'écho (TE) =4,5 ms, matrice d'imagerie =128 × 128, épaisseur de coupe =1,2 mm, champ de vision (FOV) =2,0 × 2,0 cm, et nombre de moyennes (NA) =2.

Captation cellulaire et imagerie par résonance magnétique

Pour démontrer une absorption cellulaire efficace, les cellules A549 ont été ensemencées sur la lamelle dans la boîte confocale et incubées dans un CO₂ humidifié à 5 % atmosphère pendant 4 h à 37 °C. Ensuite, le Fe₃ O₄ Des nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été ajoutées dans le milieu d'incubation à différentes concentrations et incubées pendant 2h. Les concentrations finales en ions Fe ont été obtenues respectivement à 0, 2,2, 4,5, 9,0 et 13,5  μM. Une fois le milieu retiré, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS (pH =7,4, 20 mM) et directement utilisées pour l'imagerie par résonance magnétique.

Courbe standard de DOX

Une quantité appropriée de DOX a été dissoute dans l'eau par oscillation. Ensuite, une série de différentes concentrations de solution aqueuse de DOX ont été préparées (0–0,03 mg/mL). L'intensité de fluorescence de différentes concentrations de solution DOX a été mesurée (λ _ex =490 nm). Enfin, la courbe standard de DOX a été déterminée par l'ajustement de courbe de l'intensité de fluorescence vs la concentration de DOX.

La courbe standard d'aire :Y =447,4423 + 69745,08457X.

Taux de précision de la courbe standard :R ² =0,9992.

Chargement et libération DOX

Pour mesurer les capacités de chargement du Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX, la solution surnageante a été collectée après centrifugation des nanostructures hybrides telles que préparées. Le spectre de fluorescence des molécules de DOX dans la solution de surnageant a été examiné et la concentration de DOX dans le surnageant a été calculée en comparant la courbe standard de DOX. Les pourcentages de DOX restant dans le Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été calculées selon l'équation suivante :

où W ₀ et W _s représentent respectivement la masse de DOX initiale et la masse de DOX dans les surnageants.

Pour les études de libération cumulative de DOX dans des solutions tampons PBS (pH 5,0 et 7,4) avec la même concentration en NaCl de 0,15 M, le Fe₃ O₄ Des nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été dispersées dans 1,0 mL de solution tampon puis transférées dans une poche de dialyse. Ensuite, il a été conservé dans une solution tampon et agité doucement à 37°C dans la chambre noire. À des intervalles de temps sélectionnés, 100 μL de solution ont été prélevés et analysés par spectre de fluorescence, puis remis à la solution d'origine.

Cytotoxicité in vitro de Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX

Cytotoxicité in vitro du Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été évaluées par rapport aux cellules A549 sur la base du dosage standard du méthyl thiazolyltétrazolium (MTT). Les cellules A549 ont été cultivées dans du milieu de croissance APMI 1640 complémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), de la streptomycine à 100 g/mL et de la pénicilline à 100 g/mL. Les cellules ont été maintenues à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO₂ dans les airs. Le dosage a été réalisé en triple de la même manière. Brièvement, les cellules A549 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 8 × 10 ³ cellules par puits dans 100 μL de milieu. Après une nuit de croissance, les cellules ont ensuite été incubées à différentes concentrations de DOX libre, Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS et Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX (0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 μM) pendant 24 h. Après avoir été incubés pendant 24 h, les 10 L de solution de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (5 mg/mL) ont ensuite été ajoutés dans chaque puits et les cellules ont été encore incubées pendant 4 h à 37°C. Après avoir éliminé la solution de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, 150 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été ajoutés à chaque puits et la plaque a été doucement secouée pendant 10 min pour se dissoudre les cristaux violets précipités. La densité optique (DO) a été mesurée à 490 nm en utilisant un lecteur de microplaques (Perkin Elmer, Victor X4). La viabilité cellulaire a été évaluée en pourcentage par rapport aux cellules témoins.

Caractérisation

Les tailles et morphologies de Fe₃ O₄ NPs et Fe₃ O₄ Des nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été examinées par un microscope électronique à transmission (MET) FEI Tecnai G2-F20 à une tension d'accélération de 200 kV. Des mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) ont été effectuées sur un analyseur de taille de particules et de potentiel zêta de Malvern (Zetasizer Nano ZS90). Les spectres d'absorption UV-vis ont été acquis par un spectromètre UV-vis Perkin Elmer Lambda-25. Les spectres de fluorescence ont été enregistrés à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence Hitachi F-4600. La spectroscopie d'émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP-AES) (Agilent 5100) a été utilisée pour analyser les concentrations de l'élément Fe dans le Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX.

Résultats et discussion

Le Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX sont préparées par auto-assemblage d'oxyde de fer primaire (Fe₃ O₄ ) NPs résultant en des agrégats sphériques densément emballés grâce à une technique d'auto-assemblage de microémulsion comme décrit précédemment avec modification [17, 47], suivie d'une méthode d'adsorption électrostatique LBL. La figure 1 illustre l'illustration schématique de la synthèse de Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX. Magnétite Fe₃ enrobée d'acide oléique hydrophobe O₄ Les NP ont été initialement produites par le processus de décomposition thermique dans un solvant organique [46]. Fe₃ O₄ Les NP sont sphériques et de taille uniforme avec une taille de particule moyenne d'environ 15 nm (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). Pour l'assemblage de CN magnétiques, le Fe₃ revêtu OA O₄ Les NP ont été dispersées dans du cyclohexane puis ajoutées goutte à goutte à une solution aqueuse contenant du SDBS. La solution complexe a été traitée par ultrasons pour former une émulsion huile-dans-eau stable. Après évaporation du solvant organique dans l'émulsion, Fe₃ O₄ Les NP ont été auto-assemblées pour former des nanoclusters sphériques via une interaction hydrophobe. Ensuite, le Fe₃ O₄ Des nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été préparées via une méthode LBL par le biais d'interactions électrostatiques attractives, ce qui est schématiquement illustré sur la figure 1.

Illustration schématique de la synthèse de Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX en tant qu'agents théranostiques pour l'IRM et l'administration de médicaments

Les morphologies et tailles des Fe₃ O₄ Les CN et le Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS ont été examinées avec TEM et DLS, respectivement. Comme le montrent les Fig. 2a et b, le Fe₃ O₄ Les NC démontrent les amas quasi-sphériques. La taille moyenne des particules mesurée par DLS est d'environ 57 nm (Fig. 2e). Dans les rapports précédents, les HAP avec charge positive ou PSS avec charge négative sont alternativement déposés sur la surface du modèle en raison de leurs excellentes propriétés électrostatiques [48,49,50,51]. Etudier la formation de chaque couche de polyélectrolyte déposée sur le Fe₃ O₄ NCs, les expériences de potentiel zêta ont été réalisées. La variation du potentiel zêta avec la couche de polyélectrolyte pour les revêtements PSS/PAH et DOX est illustrée dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S2. Le Fe₃ immaculé O₄ Les NC ont un potentiel zêta négatif de − 19,7 mV en raison de l'existence de SDBS. L'absorption d'une couche unique de PAH chargée positivement sur Fe₃ O₄ NCs inverse le potentiel de surface de − 19,7 à + 32 mV. Par la suite, le dépôt de la couche de PSS chargée négativement provoque une autre réversion du potentiel de surface de + 32 à - 34 mV. Cela indique une croissance de couche par étapes lors de la fabrication des nanostructures hybrides magnétiques NC. Ces résultats montrent que les couches de PAH et PSS ont été enduites avec succès sur le Fe₃ O₄ NC. Enfin, la DOX a été adsorbée avec succès à la surface du Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX, ce qui a été confirmé par le potentiel zêta positif (+ 1.91 mV) (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). Les images MET avec un grossissement différent du Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS sont représentées sur les figures 2c et d. Aucune différence structurelle et morphologique significative n'est observée après les revêtements de polyélectrolyte. Par rapport à la Fig. 2a et b, le contraste brillant peut être observé et la taille du Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS sont légèrement augmentées du fait du revêtement des couches de PAH et PSS. Les nanostructures hybrides magnétiques synthétisées montrent une forme quasi-sphérique presque mono-dispersée avec une taille moyenne d'environ 84 nm selon les résultats de la mesure DLS (Fig. 2f).

Images MET de Fe₃ O₄ CN (a , b ) et Fe₃ O₄ NC/HAP/PSS (c , d ) à un grossissement inférieur et supérieur, respectivement. Distribution de la taille de Fe₃ O₄ CN (e ) et Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS (f )

Évaluer l'application potentielle de Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS en IRM, les taux de relaxation transverse du proton (1/T ₂ ) en fonction de la concentration en ions Fe ont été déterminés à l'aide du spectromètre Bruker AVANCE 500WB à 11,7   T. Une relation linéaire entre les taux de relaxation et la concentration en ions Fe a été observée, comme le montre la figure 3b. De plus, les taux de relaxation transversale (1/T ₂ ) augmente avec l'augmentation de la concentration de Fe₃ O₄ NC en raison du degré élevé d'agrégation du Fe₃ O₄ noyau de NP magnétiques, démontrant que les nanostructures hybrides magnétiques pourraient être un T efficace ₂ -produit de contraste IRM pondéré (Fig. 3a). Sur la base de la pente du graphique de la figure 3b, la valeur de relaxivité transversale (r ₂ ) a été déterminé à 651,38  mM ⁻¹ S ⁻¹ , ce qui est supérieur à celui des travaux rapportés [22]. Par rapport aux T commerciaux ₂ les milieux de contraste, les nanoclusters peuvent améliorer considérablement la capacité de contraste de Fe après l'auto-assemblage des NP magnétiques sur la base de l'effet collectif, améliorant ainsi considérablement l'effet angiographique. Dans les travaux précédents, les nanocristaux de magnétite assemblés présentaient un niveau d'aimantation à saturation plus élevé que les nanocristaux individuels en raison de l'effet collectif des nanocristaux magnétiques [43, 52].

un T ₂ -images IRM pondérées du Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS à différentes concentrations dans l'eau. b Graphique du taux de relaxation r ₂ contre Concentration de Fe dans Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS. La valeur de relaxivité r ₂ a été obtenu à partir de la pente de l'ajustement linéaire des données expérimentales

Évaluer la capacité de charge médicamenteuse de Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX en tant que vecteurs d'administration de médicaments, un médicament anticancéreux soluble dans l'eau (DOX) a été choisi comme médicament modèle. Le stockage de la DOX dans les nanostructures hybrides à haute efficacité a d'abord été révélé par le changement de couleur de la solution. La couleur de la solution de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS et la solution pure de DOX étaient respectivement jaunâtre et rouge (Fig. 4a et b). Après formation du Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX, la couleur de la solution est devenue orange (Fig. 4c). En raison de la présence de Fe₃ O₄ NPs, les nanostructures chargées en DOX dans la suspension pourraient être séparées par un aimant externe, suggérant que le grand potentiel des nanostructures hybrides obtenues pour l'administration de médicaments ciblés magnétiquement (Fig. 4d). La spectroscopie d'absorption UV-vis a été utilisée pour déterminer la capacité effective de stockage de la DOX. La figure 4e montre les spectres d'absorption UV-vis de la solution aqueuse de DOX avant et après l'interaction avec Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS. Par rapport à la DOX libre, des caractéristiques de pic d'absorption similaires ont été observées dans le Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX, qui est le pic d'absorption par recombinaison de Fe₃ O₄ NC et DOX. L'échantillon sans DOX ne montre que le pic d'absorption de Fe₃ O₄ NC. Ces données indiquent que la DOX en tant que médicament peut être absorbée avec succès sur la surface des nanostructures hybrides. On constate également qu'il existe une limite supérieure de concentration d'adsorption de DOX chargé à la surface des nanostructures hybrides. La figure 4f montre le spectre PL du Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX après centrifugation lorsque différentes concentrations de DOX ont été ajoutées dans le Fe₃ O₄ Solution NC/HAP/PSS. L'intensité de luminescence de la DOX augmente au fur et à mesure de l'augmentation de la DOX ajoutée jusqu'à atteindre un plafond (8 mg/mL) avec la concentration de Fe₃ O₄ NC/HAP/PSS (1,30 × 10 ⁻² mg/mL) inchangé. Par la suite, la quantité de piégeage diminue en raison de l'excès de DOX, qui ne peut pas être adsorbé à la surface de Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX. L'intensité de fluorescence la plus forte de la DOX correspond à la concentration à 8  mg/mL, et l'échantillon correspondant serait utilisé pour une étude plus approfondie afin d'effectuer une expérience biomédicale. L'efficacité de chargement de médicament assurée des nanostructures hybrides est cruciale pour l'application clinique. L'efficacité de chargement a été calculée par l'intégrale de l'aire de l'intensité de fluorescence DOX en utilisant la méthode de la courbe standard de DOX [53, 54]. L'efficacité de chargement a été calculée jusqu'à 24,39% pour le Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX. Par conséquent, une plate-forme théranostique a été construite sur la base du Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX grâce à l'absorption efficace du médicament antitumoral DOX.

Photographies (a –d ) des différents étages absorbés de DOX sur le Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS. Les spectres d'absorption UV-vis (e ) de DOX, Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS et Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX. Les spectres de luminescence (f ) de Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX lorsque la concentration différente de DOX a été ajoutée dans le Fe₃ O₄ Solution de nanostructure hybride NC/PAH/PSS

Les profils de libération de médicaments in vitro de Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX sous diverses valeurs de pH environnementales sont illustrées sur la figure 5. Le Fe₃ O₄ Des nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été dialysées à travers une membrane de dialyse dans des tampons phosphates à 37°C. La DOX libérée par les nanostructures hybrides a été collectée, puis la quantité de DOX libérée a été calculée par l'intensité de fluorescence du surnageant. A pH physiologique   7,4, la libération de médicament observée est un processus de libération lente. Environ 20 % en poids de DOX ont été libérés au cours des 5 h initiales, puis sont entrés dans la phase stable de libération lente. À pH 5,0, environ 80 % en poids de DOX ont été libérés des nanostructures hybrides au cours des 15 premières heures avant qu'un plateau de libération ne soit atteint. Les pourcentages de plateau de libération de DOX observés sur une période de 30 h étaient de 80 ± 3 % en poids et de 20 ± 3 % en poids à pH 5,0 et 7,4, respectivement. On peut voir que le Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont révélé un profil de libération prolongée et un taux de libération de DOX plus élevé à pH 5,0 qu'à pH 7,4. Le faible pH de l'environnement accélère la libération de DOX du Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX. Cela est dû à la protonation du -NH₂ groupe de DOX dans des conditions acides, ce qui réduit l'interaction électrostatique entre les polymères DOX et PSS à des valeurs de pH faibles [55]. Les études de libération de médicament indiquent la bonne stabilité des molécules de médicament liées électrostatiquement au pH physiologique et la libération déclenchée dans des conditions acides, similaire aux travaux rapportés [56,57,58]. Par conséquent, le Fe₃ obtenu O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX sont des systèmes sensibles au pH pour l'administration de médicaments DOX et adaptées au traitement spécifique des tumeurs solides [59].

Tracé de la libération de DOX du Fe₃ O₄ Nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX dans un tampon PBS à pH   7,4 et 5,0, respectivement

L'absorption cellulaire et la cytotoxicité sont des facteurs clés pour évaluer le potentiel d'un nouveau système d'administration de médicaments. L'absorption cellulaire et la cytotoxicité de Fe₃ O₄ Des nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX sur des lignées cellulaires A549 ont été étudiées. L'absorption intercellulaire de Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX ont été étudiées en utilisant la microscopie optique et à fluorescence, qui a été principalement réalisée en surveillant la fluorescence de la DOX. Le Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX se sont avérées efficaces pour administrer la DOX aux cellules cancéreuses. Comme le montre la figure 6, une forte fluorescence rouge de la DOX a été observée dans les cellules cancéreuses après incubation pendant 24 h. Les nanostructures hybrides ont été internalisées principalement par endocytose [60]. Après absorption cellulaire, les nanostructures hybrides libèrent de la DOX dans l'environnement acide autour des endosomes/lysosomes, dans lequel un pH suffisamment bas (4,3) pourrait déclencher une libération efficace de DOX (pH 5,0, Fig. 5). Le Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX présentaient une absorption dépendante du temps dans les cellules cancéreuses A549, comme le montre la figure 6. À 0,5 h après l'incubation, une fluorescence rouge était visible autour des cellules. Les résultats montrent que les nanostructures hybrides contenant de la DOX sont restées principalement autour des cellules A549. Cependant, lorsque le temps d'incubation a augmenté à 24 h, le signal de fluorescence intercellulaire a augmenté à partir des cellules A549. De toute évidence, de nombreuses nanostructures hybrides peuvent pénétrer dans les cellules cancéreuses au fil du temps. Ces résultats confirment que le Fe₃ O₄ Les nanostructures hybrides NC/PAH/PSS/DOX peuvent transférer efficacement la DOX dans les cellules A549. La DOX libérée par les nanostructures hybrides dans le cytoplasme traverse la membrane nucléaire et finit par s'accumuler dans le noyau, tuant les cellules en provoquant des changements dans la conformation de l'ADN [61].

Images microscopiques à fluorescence confocale de cellules A549 incubées avec le Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at 37 °C for a 0.5 h and b 24 h. Scale bar, 20 μm

In order to evaluate the pharmacological activity of the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, the cytotoxicity to A549 cells in vitro was determined by MTT method. Figure 7 shows the cell activity of free DOX, Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS, and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures with different concentrations after incubation with A549 cells for 24 h. The material amounts were calculated according to the concentration of DOX. The free DOX concentration was the same as the DOX concentration in Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, and the concentration of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructure was the same as the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS concentration in the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. Each sample was cultured with A549 cells for 24 h. The concentration of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS ranged from 0.1 to 2.0 μΜ, and the cell survival rate exceeded 85%. This indicated that Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures had no obvious cytotoxicity to cancer cells and had good biocompatibility. After incubating with cancer cells for 24 h, however, the free DOX and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures showed obvious cytotoxicity. The cellular viability progressively decreased with increasing effective DOX concentration. As shown in Fig. 7, when the effective DOX concentration was increased from 0.1 up to 2.0 μM, the relative cell viability decreased from about 92% to about 50% for free DOX, and from about 89% to about 40 % for Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, respectively.

Relative viability of A549 cells incubated with free DOX, Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS, and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at different concentrations for 24 h. Error bars were based on triplicate samples

These results indicate that both free DOX and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures have dose-dependent cytotoxicity to cancer cells. The cytotoxicity originates from the loaded DOX rather than Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures. Cell uptake of free DOX is faster than that of DOX-loaded hybrid nanostructures. This reason is that small DOX molecules can quickly spread into cells, while Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures must be endocytosis in order to enter cancer cells. Because of the hypoxia-induced coordinated upregulation of glycolysis, the acidic extracellular environment of solid tumors is stronger than that of normal tissues [62]. At the cellular level, the internalization of most of the hybrid nanostructures will take place through endocytosis. With the increase of DOX concentration, more and more hybrid nanostructures loaded with DOX are endocytosed into cancer cells. After cellular endocytosis, the DOX-loaded hybrid nanostructures usually enter the early endosomes, then enter the late endosomes/lysosomes, and finally fused with lysosomes. Furthermore, both endosomes (pH 5.0–6.0) and lysosomes (pH 4.5–5.0) have an acidic microenvironment. In our study, the pH-responsive Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were more likely to decompose and release drugs in acidic environments, thus effectively reducing side effects, prolonging half-life of drugs, and providing more effective and lasting treatment. Due to the main target of DOX being cell nucleus, DOX can bind to double-stranded DNA to form DNA adducts, inhibit the activity of topoisomerase and induce cell death (apoptosis) [63]. As a result, the released DOX molecules were located in the cell nucleus. Therefore, the obtained Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures may have good potential for cancer chemotherapy.

As discussed above, the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures exhibit high relaxivity in aqueous solution and can be uptaken efficiently by A549 cells. The intracellular MRI of the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were then investigated by incubation of A549 cells with the hybrid nanostructures with different Fe₃ O₄ concentrations. Figure 8 presents the T ₂ -weighted MRI of A549 cells. With the increase of Fe₃ O₄ concentration in Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, the cellular MRI signal increased gradually (Fig. 8). Currently, cell labeling is mainly accomplished by the endocytosis of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as T ₂ -negative contrast agents. These results demonstrate that the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can be internalized into cells and exhibit good T ₂ -weighted MRI contrast for cellular imaging. Our current research is limited to the cellular level. Future in vivo studies would be necessary for the practical application of the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. To specially target a specific site in animal studies, small ligands such as lactic acid and folic acid (both containing carboxyl groups) would require to be used to conjugate amino-terminated Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures.

T ₂ -weighted cellular MR images of A549 cells incubated with the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at a Fe concentration of 2.2, 4.5, 9.0, and 13.5 μM, respectively

Conclusion

The multifunctional Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were developed as the pH-triggered drug delivery system for effective cancer chemotherapy and MRI. The quasi-spherical Fe₃ O₄ NCs can significantly improve the contrast ability of MRI compared with Fe₃ O₄ NPs. The Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can act as contrast agents to enhance MRI and as a fluorescence probe for cell imaging. The DOX can be released from the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at acidic environment and exhibit an excellent cellular cytotoxic effect on A549 cells. The Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as multifunctional theranostic platform have great potential for biomedical application, including MRI, fluorescence imaging, and stimuli-responsive drug delivery nanocarriers.

Availability of Data and Materials

Data sharing is not applicable to this article as no datasets were generated or analyzed during the current study. Please contact the author for data requests.

Abréviations

1/T ₂ :

The proton transverse relaxation rates

A549:

Human lung cancer

DLS:

Dynamic light scattering

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

DOX:

Doxorubicin hydrochloride

FBS:

Fetal bovine serum

Fe₃ O₄ :

Iron oxide

FOV:

Field of view

LBL:

Layer-by-layer

MRI:

Magnetic resonance imaging

MTT:

Methyl thiazolyltetrazolium

NA:

Number of averages

NaOA:

Sodium oleate

NaOH:

Sodium hydroxide

NC:

Nanocluster

NCs:

Nanoclusters

NH₄ F:

Ammonium fluoride

NPs:

Nanoparticles

OA:

Oleic acid

OD:

Optical density

ODE:

1-Octadecene

PAH:

Poly(allylamine hydrochloride)

PSS:

Poly(sodium 4-styrenesulfonate)

S/O/W:

Solid-in-oil-in-water

SDBS:

Sodium dodecyl benzene sulfonate

TE:

Echo time

TEM :

Microscope électronique à transmission

TR:

Repetition time