Conjugaison chimique amine-aldéhyde sur une surface ELISA en polystyrène traitée à l'hydroxyde de potassium pour la nanodétection d'un antigène VIH-p24

Contexte

La détection de biomarqueurs de maladies et d'antigènes de surface sur des agents pathogènes intacts est nécessaire dans le domaine du diagnostic médical pour prolonger la durée de vie humaine et favoriser une vie plus saine. Différents systèmes de détection sont disponibles pour diagnostiquer les agents pathogènes et les maladies potentiellement mortelles, y compris les cancers [1,2,3,4]. Il a été démontré que la gamme de sondes et de stratégies de détection permet d'identifier plusieurs maladies [5, 6]. Parmi ces résultats, le test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) est une stratégie bien établie pour détecter et diagnostiquer les principales maladies, y compris le VIH, et ELISA a été considéré comme un test de contrôle de qualité [7,8,9,10]. En tant que dosage immunologique, ELISA détecte l'antigène à l'aide de l'anticorps approprié. Pour remplir ce rôle, l'antigène est immobilisé sur une surface en polystyrène (PS) puis interagit avec l'anticorps partenaire (anticorps primaire), suivi de l'anticorps spécifique à l'hôte (anticorps secondaire) avec l'enzyme conjuguée, qui est autorisé à se lier à l'anticorps primaire. Enfin, ces interactions moléculaires sont suivies par un substrat adapté. Les chercheurs ont utilisé différentes approches basées sur ELISA, y compris la méthode sandwich avec des anticorps poly- et monoclonaux appropriés ou des combinaisons aptamère-anticorps pour améliorer les détections [11,12,13,14].

La sensibilité d'un ELISA dépend de paramètres tels que l'interaction entre l'antigène et l'anticorps, la température, le pH et l'efficacité de la fixation de l'antigène sur la surface du PS. Parmi ces facteurs, l'immobilisation de l'antigène ou de l'anticorps sur la plaque PS joue un rôle crucial dans l'amélioration de la limite de détection. De plus, la limitation posée par l'attachement et la distribution non uniforme de la protéine à la surface du PS affecte fortement la sensibilité du dosage [5]. Une quantité plus élevée avec une immobilisation appropriée des protéines aide à obtenir la bonne orientation sur la surface du PS pour d'éventuelles améliorations de la détection. Différentes stratégies ont été employées pour immobiliser correctement les protéines sur la surface du PS. Une protéine ou un anticorps a la capacité de s'immobiliser sur la plaque PS simplement par adsorption chimique ou physique ou interaction électrostatique. Bora et al. [15] ont immobilisé la protéine sur la surface du PS en utilisant la photochimie, et ils ont trouvé des améliorations jusqu'à 1,5 à 2 fois supérieures à celles de la surface non traitée. Dans une autre étude, l'immobilisation efficace des protéines sur la plaque PS avec un polymère appelé polyvinyl benzyl lactonoylamide (PVLA) a été montrée [16]. Les polymères à base de polyéthylène glycol (PEG) ont également permis l'immobilisation efficace de biomolécules sur des surfaces de détection. Lakshmipriya et al. [17] ont développé une détection améliorée du facteur IX de la protéine de coagulation en immobilisant son oligomère thiolé avec deux polymères (PEG-b-PAAc et N6-PEG) sur une surface recouverte d'or.

Sur la surface de la plaque ELISA, le PS est composé d'une chaîne carbonée aliphatique avec des anneaux benzéniques pendants sur chaque carbone, et il fournit une surface hydrophobe. Le groupe carboxyle sur la surface du PS se lie à l'antigène ou à l'anticorps par une interaction électrostatique avec ses groupes amine exposés. Cependant, cette stratégie de liaison présente des inconvénients, tels que la liaison plus faible des protéines et le positionnement irrégulier des molécules. Les protéines et les peptides de plus petite taille avec un nombre inférieur de compositions d'acides aminés sont particulièrement difficiles à lier sur la surface de PS en raison de la disponibilité de moins d'épitopes. De plus, il a été montré que si les molécules sur le substrat de détection sont entassées, la distance entre les sondes est alors trop perturbée pour engager une véritable interaction. Pour cette raison, l'augmentation de la liaison d'une protéine ou d'un anticorps sur la plaque PS avec la bonne orientation améliore la limite de détection. En général, les protéines sont directement immobilisées sur la surface ELISA, et les chercheurs se concentrent sur l'amélioration de l'immobilisation des protéines sur la surface ELISA pour développer une détection haute performance. En particulier, l'immobilisation de protéine par fonctionnalisation chimique à la surface du PS a été observée par plusieurs chercheurs pour améliorer cette stratégie. La modification chimique à base d'amine est efficace pour immobiliser différents anticorps par l'intermédiaire de l'agent de réticulation approprié. Le 3-(aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) est couramment utilisé pour modifier la surface de détection à utiliser avec des amines. L'anticorps peut s'immobiliser sur la surface APTES modifiée par une amine grâce à son groupe COOH. Cependant, l'immobilisation de la protéine ne peut pas être liée directement à la surface de l'amine comme l'anticorps; en particulier, les protéines de plus petite taille nécessitent un agent de réticulation approprié. Ici, nous avons introduit une immobilisation étape simple pour la protéine en utilisant une modification chimique avec APTES et glutaraldéhyde (GLU). Nous avons immobilisé les protéines de manière covalente sur la surface modifiée par une amine et liées à l'aide de GLU. GLU est un composé organique de formule CH₂ (CH₂ CHO)₂ , et il s'est avéré être l'un des agents de réticulation de protéines les plus efficaces [4, 18, 19, 20]. Il a deux groupes aldéhyde à ses extrémités; une extrémité se lie à la surface ELISA modifiée par une amine et l'autre extrémité est libre de se lier à la protéine ou à l'anticorps. En général, l'immobilisation de protéines ou de peptides de plus petite taille sur la surface ELISA est vraiment difficile en raison de la présence de moins d'amines à sa surface. Avec la stratégie de fonctionnalisation chimique, il est possible d'utiliser des protéines ou des peptides de plus petite taille pour immobiliser fortement le matériau sur la plaque ELISA PS. Pour notre méthode, nous avons utilisé APTES-GLU comme lieur ; en utilisant cette modification, nous pouvons immobiliser tout type d'anticorps, de protéines et de peptides. Les améliorations du signal et de la sensibilité dans le cadre de cette stratégie sont supérieures à celles d'autres stratégies chimiques explorées dans le passé [3, 4].

Pour démontrer l'avantage de ces chimies, nous avons choisi la détection de l'une des principales protéines du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) (p24), qui est exprimée à un stade précoce de l'infection par le VIH. L'antigène p24 est constitué du noyau viral et est présent à un niveau plus élevé au cours de la première semaine d'infection. Par conséquent, il est idéal de générer un système sensible utilisant p24 pour une détection plus précoce du VIH. Ici, la détection de p24 a été générée en utilisant la surface ELISA chimiquement modifiée mentionnée ci-dessus. Cette stratégie de fonctionnalisation chimique a amélioré la détection de p24 sur la surface PS ELISA sur plusieurs plis, et elle peut être recommandée pour détecter d'autres biomarqueurs cliniques importants.

Matériaux et méthodes

Réactifs et biomolécules

Les protéines recombinantes HIV-p24 et Tat et l'anticorps p24 ont été achetés auprès d'Abcam (Malaisie). Le 3-(aminopropyl)triéthoxysilane (APTES), le glutaraldéhyde (GLU) et le sérum humain ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (USA). De la peroxydase de raifort anti-souris-IgG conjuguée (anti-immunoglobuline de souris HRP) a été obtenue auprès de Thermo Scientific (USA). Une plaque ELISA a été achetée auprès de Becton Dickinson (France). Un tampon de revêtement ELISA 5X a été obtenu auprès de Biolegend (UK). L'albumine sérique bovine (BSA) et le substrat HRP [3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB)] ont été obtenus auprès de Promega (USA). Le lecteur analytique ELISA a été obtenu auprès de Fisher Scientific (Malaisie).

Niveaux APTES et GLU optimaux pour la fonctionnalisation sur la surface PS

L'optimisation des niveaux d'APTES et de GLU à utiliser sur la surface PS a été réalisée avec l'antigène p24 du VIH ciblé. Pour décider des concentrations appropriées d'APTES et de GLU, la surface ELISA a d'abord été activée par de l'hydroxyde de potassium à 1% pendant 10 min. Ensuite, trois quantités différentes d'APTES (0,5, 1 et 2 %) ont été autorisées à se lier à la surface ELISA et elles ont été incubées pendant une nuit à température ambiante (RT). Après cela, deux quantités différentes de GLU (1 et 2 %) ont été appliquées sur la surface de PS modifiée par une amine. À ce stade, le VIH-p24 à une concentration de 250 nM a été autorisé à se lier sur la surface modifiée par GLU, et la surface de GLU restante a été bloquée avec 2 % de BSA. L'anticorps p24 a été introduit à une dilution de 1:1000, puis on a laissé l'IgG-HRP anti-souris se lier à l'anticorps p24. Enfin, ces interactions ont été suivies en ajoutant le substrat (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine, TMB) pour HRP. Après avoir ajouté la quantité optimale de substrat (100 mM), l'absorbance a été lue avec un lecteur ELISA à 405 nm. Des expériences de contrôle ont été réalisées en l'absence de VIH-p24 cible.

Optimisation de la liaison aldéhyde au groupe Amine

Pour déterminer le temps d'incubation approprié pour que GLU relie les surfaces modifiées par une amine, deux temps d'incubation différents ont été observés. Après que la surface ELISA PS ait été modifiée avec APTES, la GLU a été immobilisée pendant 3 h et incubée indépendamment pendant une nuit, puis 250 nM d'antigène HIV-p24 a été immobilisé sur les surfaces modifiées par GLU. Les étapes restantes ont été suivies comme indiqué dans l'expérience précédente.

Détections comparatives entre l'antigène VIH-p24 sur la surface modifiée par GLU et les pièces jointes d'antigène prémélangé GLU-VIH-p24

Pour détecter l'antigène VIH-p24 sur la surface ELISA, nous avons comparé deux approches différentes de modification de surface à l'aide de GLU. Dans la première (méthode 1 :amine-GLU-p24), la surface du PS a d'abord été modifiée par une amine utilisant 2% d'APTES, 2% de GLU ont été ajoutés à la surface pour attacher la surface de la plaque avec un groupe aldéhyde, puis 100 L'antigène VIH-p24 nM a été ajouté. Dans la deuxième approche (méthode 2 :amine-GLU prémélangé p24), après que la surface a été modifiée par une amine, GLU-p24 (2% de GLU a été mélangé avec 100 nM d'antigène VIH-p24 et maintenu à TA pendant 30  min) a été ajoutée. Enfin, la détection a été réalisée à l'aide de l'anticorps p24. Les autres étapes ont été effectuées comme expliqué ci-dessus. Les expériences de contrôle ont été réalisées en l'absence de la cible VIH-p24.

Limite de détection :ELISA conventionnel vs chimiquement modifié

Pour vérifier la limite de détection, différentes concentrations de p24 ont été titrées de 0,5 à 500 nM, et elles ont été évaluées selon les méthodes conventionnelles et les méthodes 1 et 2.

Méthode conventionnelle

L'antigène VIH-p24 a été initialement dilué avec 1 % de tampon de revêtement ELISA, ajouté à la surface ELISA et maintenu à 4°C pendant une nuit, puis les zones restantes ont été bloquées avec 2 % de BSA pendant 1 h à température ambiante. Après cela, une dilution 1:1000 d'anticorps p24 a été ajoutée et incubée pendant 1 h, puis une dilution 1:1000 d'anti-IgG-HRP de souris a été ajoutée à la surface ELISA et laissée au repos pendant 1 h. Enfin, le substrat HRP (TMB) a été ajouté et mesuré à une longueur d'onde de 405  nm à l'aide du lecteur ELISA.

Méthode 1

Différentes concentrations d'antigène VIH-p24 ont été ajoutées aux surfaces modifiées par APTES et GLU. Une fois l'antigène immobilisé, les étapes restantes ont été suivies comme indiqué dans l'ELISA conventionnel. Des lavages ont été effectués cinq fois entre chaque étape d'immobilisation. L'absorbance a été enregistrée à une longueur d'onde de 405 nm à l'aide du lecteur ELISA et des photographies ont été prises.

Méthode 2

Sur la plaque ELISA modifiée APTES, différentes concentrations de p24 prémélangées avec GLU ont été immobilisées. Toutes les autres étapes utilisées pour l'ELISA classique ont été suivies. Des lavages ont été effectués cinq fois entre chaque étape d'immobilisation. L'absorbance a été enregistrée à une longueur d'onde de 405  nm en utilisant le lecteur ELISA, et des photographies ont été enregistrées. Des expériences de contrôle ont été réalisées en l'absence de la cible VIH-p24.

Détection spécifique de l'antigène VIH-p24 sur la surface modifiée APTES

Pour vérifier la spécificité du dosage, nous avons effectué deux expériences de contrôle différentes. Au lieu de l'antigène VIH-p24, nous avons utilisé du sérum humain ou une protéine VIH-TAT prémélangée avec 1% de GLU et les avons ajoutés à la surface modifiée par APTES. Toutes les autres étapes ont été suivies comme expliqué ci-dessus. Des expériences de contrôle ont été réalisées en l'absence de VIH-p24 cible.

Résultats et discussion

Le dosage immuno-enzymatique (ELISA) est un dosage immunologique efficace qui aide les chercheurs à identifier différentes biomolécules à l'aide d'anticorps appropriés. Une forte immobilisation des analytes (protéines, peptides, anticorps et aptamères) [21,22,23] et la capacité de capturer des molécules (anticorps monoclonaux, anticorps polyclonaux et régions Fc des anticorps) [24, 25] peuvent considérablement améliorer la limite de détection et contribuent à étayer la spécificité de l'analyse. Dans cette optique, plusieurs types de recherche se concentrent sur la modification chimique de la surface ELISA pour capturer la sonde ou l'analyte correctement orientés en plus grande quantité. En général, un anticorps ou une protéine est immobilisé sur la surface ELISA PS par une interaction électrostatique entre le groupe carboxyle sur le PS et les groupes amine sur la protéine ou l'anticorps. Cependant, cette méthode n'est pas suffisamment efficace pour atteindre une sensibilité et une spécificité plus élevées en raison de sa limitation de liaison. Pour surmonter ce problème fondamental, au cours de la présente enquête, nous avons préparé une surface ELISA fonctionnalisée chimiquement en utilisant du 3-(aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) et du glutaraldéhyde (GLU) pour une immobilisation efficace des protéines. Comme le montre la figure 1a, une surface de PS activée par l'hydroxyde de potassium a été modifiée par une amine à l'aide d'APTES, puis réticulée avec du GLU pour attacher la protéine. En l'absence de traitement à l'hydroxyde de potassium, le niveau optimal d'APTES attaché à la surface du PS est significativement plus faible en raison de l'absence d'un accepteur de liaison hydrogène polaire qui améliore l'adsorption initiale et déclenchera la liaison plus élevée d'APTES. La figure 1b montre la détection proposée de la protéine immobilisée sur la surface ELISA chimiquement modifiée avec son anticorps partenaire.

Représentation schématique d'ELISA chimiquement modifié (a ). La surface ELISA a été modifiée chimiquement en utilisant APTES et GLU après traitement à l'hydroxyde de potassium. L'antigène a été immobilisé sur la surface modifiée par GLU. b L'antigène immobilisé a été détecté par son anticorps partenaire

Pour recueillir des preuves de cette stratégie de détection, nous voulions utiliser une protéine importante du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) appelée p24. L'antigène VIH-p24 est l'une des protéines qui pourraient être exprimées au cours du stade précoce de l'infection par le VIH, et il se multiplie dans le système hôte comme le révèlent d'autres systèmes viraux (Fig. 2). Le VIH intact a des glycoprotéines sur l'enveloppe recouvrant la capside, et l'antigène VIH-p24 réside dans la région de la capside (Fig. 3a). Avant de détecter l'antigène VIH-p24, nous avons initialement optimisé la concentration du lieur chimique pour capturer l'antigène VIH-p24 sur la surface ELISA. Nous avons exploré différentes concentrations et combinaisons d'APTES et de GLU sur la surface ELISA et évalué les résultats en utilisant une concentration constante de 250  nM d'antigène VIH-p24. Comme le montrent les figures 3b et c, l'application d'APTES et de GLU à 1% a montré un niveau saturé de liaison à l'antigène VIH-p24. Si APTES était présent à moins de 1 %, l'absorbance de liaison (DO) était inférieure, au même niveau de temps que celle de 2 % d'APTES, en raison d'une augmentation de la non-spécificité (en référence à l'expérience témoin). Pour GLU, le niveau de 2 % montre une bonne détection de l'antigène VIH-p24 à une absorbance de 0,25, et simultanément, l'expérience témoin (sans VIH-p24) affiche l'absorbance la plus élevée (0,16). L'APTES et le GLU optimaux à 1 % présentent l'absorbance la plus faible dans l'expérience témoin (0,08) et l'absorbance la plus élevée (0,22) lors de la détection spécifique de l'antigène VIH-p24. Ce résultat s'est produit car, avec l'augmentation d'APTES et de GLU, il est possible de capturer l'anticorps sur les surfaces amine libres restantes (provenant de l'APTES) et les surfaces aldéhyde (provenant de la GLU). Ce résultat est le même même lorsque les régions de surface libre ont été bloquées avec de la BSA dans les cas ci-dessus. Pour affiner davantage la méthode, nous avons également tenté d'augmenter la concentration de BSA pour minimiser le signal de fond. Cependant, même à des concentrations plus élevées d'APTES et de GLU, il y avait un encrassement biologique. Sur la base de ces résultats, la condition optimisée est de 1 % d'APTES et de GLU, comme utilisé dans les expériences.

Interaction entre le VIH et la cellule hôte. La stratégie générale de multiplication du VIH est montrée

un Structure VIH intacte. L'antigène p24 est indiqué. b L'optimisation d'APTES et de GLU. APTES (0,5, 1 et 2%) et GLU (1 et 2%) ont été utilisés avec différentes combinaisons pour détecter la concentration constante (250 nM) de l'antigène VIH-p24

Après l'optimisation APTES et GLU, nous avons également ajusté le temps d'incubation pour lier le GLU sur la surface modifiée par APTES. Comme le montre la figure 4a, l'incubation du GLU pendant la nuit conduit à l'absorbance la plus élevée par rapport au temps d'incubation plus court (3  h). Ce résultat est dû au temps d'incubation insuffisant pour que la GLU se lie à la surface modifiée par APTES ; en fin de compte, l'anticorps est capable de se lier aux surfaces APTES restantes. Avec un temps d'incubation accru pour le GLU, ce composé a une chance de couvrir complètement la surface de l'APTES. Cette saturation augmente l'immobilisation des protéines sur la surface GLU et améliore la sensibilité du dosage. À la concentration de 250 nM de VIH-p24, l'absorbance est presque deux fois plus élevée avec l'incubation de nuit de GLU (Fig. 4a).

Optimisation de la période d'incubation du GLU. un Optimisé pour avoir une période d'incubation de 3 h et une incubation d'une nuit en utilisant 1% de GLU sur une surface modifiée à 1% APTES. b Détection de 125 nM p24 par trois approches différentes, conventionnelle, APTES-GLU-p24 (méthode 1) et APTES-GLU-premixed p24 (méthode 2)

En raison du signal authentique plus élevé après l'incubation d'une nuit de GLU avec l'absorbance accrue et la détection spécifique de p24, nous avons utilisé une condition similaire pour d'autres expériences. Dans ce cas, nous avons immobilisé le GLU sur la surface modifiée par APTES, puis avons attaché la protéine (méthode 1). Nous avons également essayé une autre approche; tout d'abord, nous avons mélangé 1% de GLU avec 125 nM d'antigène VIH-p24, puis ajouté ce mélange à la surface PS modifiée par une amine (méthode 2). Étonnamment, il y avait une absorbance accrue avec la même concentration d'antigène VIH-p24 (de DO 0,161 à 0,23) que la concentration utilisée dans la méthode 2. Lorsque nous avons permis à la protéine de se lier à la GLU en tant que prémélange, presque toutes les protéines ont été capable de lier le GLU, puis ce mélange s'adsorbe facilement sur la surface modifiée aux amines. Cependant, lorsque la protéine a été autorisée à se lier à la surface GLU pré-immobilisée, la plupart des groupes aldéhyde de la GLU n'étaient pas disponibles. La figure 4b indique que la méthode de mélange montre la détection d'une concentration similaire (125  nM) d'antigène VIH-p24 avec une absorbance plus élevée. De plus, les méthodes 1 et 2 ont affiché une absorbance plus élevée que la méthode conventionnelle avec la même concentration d'antigène VIH-p24.

Après l'optimisation complète des étapes de détection, pour trouver la limite de détection, nous avons titré l'antigène VIH-p24 des plages picomolaires à nanomolaires (500 pM à 500  nM). Nous avons comparé trois méthodes différentes, à savoir la conventionnelle APTES-GLU-p24 (méthode 1 :p24 immobilisé sur APTES suivi d'une modification GLU), et APTES-GLU-premix HIV-p24 (méthode 2 :le prémélange de p24 et GLU suivi par immobilisation sur APTES) avec la même concentration de p24. Comme le montre la figure 5, la limite de détection de p24 s'est avérée être de 30  nM pour l'ELISA conventionnel. Dans la méthode 1, la limite de détection a été améliorée huit fois (4 nM) par rapport à l'ELISA conventionnel. Ce résultat s'est produit parce que lorsque nous avons utilisé la surface PS chimiquement modifiée, l'immobilisation des protéines était stable sous l'arrangement uniforme et le taux d'immobilisation était également assez élevé par rapport à l'adsorption conventionnelle des protéines sur la surface ELISA. Vashist et al. [12] ont déjà montré que l'immobilisation plus élevée d'un anticorps sur la surface ELISA modifiée par APTES était associée à un niveau de détection considérablement amélioré par rapport à l'ELISA conventionnel [12]. Dans leur travail, l'amine dans APTES peut lier des groupes carboxyle sur l'anticorps, et de cette façon, ils ont immobilisé chimiquement l'anticorps sur la surface ELISA. En utilisant cette méthode, nous ne pouvons immobiliser les anticorps sur la surface ELISA que par ses groupes carboxyle, mais l'immobilisation d'antigènes à base de protéines n'est pas possible sur APTES. Pour cela, nous avons introduit le linker GLU pour immobiliser la protéine sur la surface ELISA PS. Avec ces lieurs chimiques, non seulement une protéine mais également un anticorps ont été chimiquement liés par couplage amine à l'aldéhyde sur le glutaraldéhyde. L'attachement non spécifique de biomolécules sur le substrat ELISA a été surveillé en utilisant les expériences de contrôle. Une expérience témoin a été réalisée sans la molécule cible (HIV-p24). Sans la cible, l'anticorps spécifique pour p24 ne peut pas se lier à la surface, et ainsi, l'anticorps secondaire conjugué à l'enzyme n'est pas non plus immobilisé sur la surface ELISA. Dans ce cas, lorsque nous avons ajouté le substrat (TMB), nous ne sommes pas en mesure de trouver des changements dans l'absorbance.

Limite de détection de l'antigène VIH-p24. Le p24 a été titré de 0,5 à 500  nM. Trois approches différentes ont été suivies, conventionnelles et méthodes 1 et 2

Pour améliorer la limite de détection, nous avons essayé de prémélanger GLU et l'antigène HIV-p24 avant l'étape d'immobilisation sur la surface modifiée APTES. On s'attendait à ce que le prémélange de GLU et de l'antigène VIH-p24 s'améliore avec la plus grande immobilisation des protéines sur la surface ELISA. Lorsque nous prémélangons le GLU avec l'antigène VIH-p24, le rapport de liaison de l'aldéhyde au GLU est élevé. Lorsque nous ajoutons ce mélange à la surface ELISA, cela améliore le taux d'immobilisation. Dixit et al. ont constaté que lorsqu'ils prémélangaient l'anticorps et l'APTES avant l'immobilisation sur la plaque ELISA, leur approche améliorait l'immobilisation de l'anticorps sur la surface ELISA et la limite de détection était augmentée [12]. Dans notre étude, comme prévu, lorsque nous avons prémélangé l'antigène GLU et VIH-p24 avant l'immobilisation, la limite de détection a été améliorée à 1 nM et était 30 fois plus élevée que celle de l'ELISA conventionnel, qui a montré une limite de détection de 30 nM. Notre stratégie avait non seulement une limite de détection améliorée, mais elle a également amélioré l'absorbance pour toutes les concentrations d'antigène VIH-p24. A 250 nM p24, nous avons observé que l'absorbance était de 0,35, ce qui est presque le double de celle de l'ELISA conventionnel avec la même concentration d'antigène VIH-p24. Avec toutes les concentrations d'antigène VIH-p24, une grande différence d'absorbance a été notée par rapport à l'ELISA conventionnel (Fig. 5), comme en témoigne la détection fiable de l'antigène VIH-p24.

Pour évaluer la spécificité du test, nous avons effectué le test avec deux expériences de contrôle différentes. Nous avons choisi du sérum humain et du VIH-TAT et mélangés avec du GLU au lieu de l'antigène VIH-p24 avant utilisation, et nous avons évalué leur spécificité. Comme le montre la figure 6, dans le cas du sérum humain et du VIH-TAT, il n'y a pas d'absorbance significative ; cependant, 250  nM d'antigène HIV-p24 présentaient une nette augmentation de l'absorbance. Ce résultat confirme la détection spécifique de l'antigène VIH-p24 sur la surface ELISA chimiquement modifiée avec une sensibilité plus élevée.

Détection spécifique de l'antigène VIH-p24. Au lieu du VIH-p24, le sérum humain et la protéine VIH-TAT ont été utilisés pour vérifier la spécificité

Conclusions

Une immobilisation plus élevée et appropriée d'une protéine ou d'un anticorps sur la surface ELISA améliore considérablement la limite de détection. Ici, nous avons introduit une méthode de fonctionnalisation chimique intéressante pour immobiliser la quantité de protéine ou d'anticorps qui se lie à la surface ELISA PS, assistée par APTES et GLU. Pour démontrer la détection, nous avons utilisé l'antigène p24 du VIH. La limite de détection a été améliorée de 30 fois par rapport à l'ELISA conventionnel. D'autres développements de la présente enquête pourraient conduire à des améliorations chimiques similaires sur d'autres surfaces de détection et seraient utiles pour détecter différents antigènes à une moindre abondance, ce qui représenterait une avancée dans les diagnostics médicaux.

Abréviations

APTES :

3-(Aminopropyl)triéthoxysilane

BSA :

Sérum albumine bovine

COOH :

Carboxyle

ELISA :

Dosage immuno-enzymatique

Fc :

Fragment cristallisable

GLU :

Glutaraldéhyde

VIH :

Virus de l'immunodéficience humaine

HRP :

Peroxydase de raifort

IgG :

Immunoglobuline

OD :

Une densité optique

PEG :

Polyéthylène glycol

PS :

Polystyrène

PVLA :

Polyvinylbenzyllactonoylamide

TMB :

3,3′,5,5′-Tétraméthylbenzidine