Croissance de nanostructures d'or pour une absorption cellulaire sélective de forme

Contexte

Les nanostructures d'or (NS) ont été utilisées dans diverses applications biomédicales en raison de leurs propriétés optiques et électroniques dépendantes de la forme et de la taille [1]. Au NSs affichent une résonance plasmonique de surface localisée (LSPR) modifiable et sensible à l'environnement [2]. Au LSPR dans le domaine visible en fait des candidats appropriés pour les biocapteurs et de bons agents de contraste pour la tomodensitométrie (TDM) [3, 4] ainsi que l'imagerie photo-acoustique [5]. Les NS avec des rapports d'aspect encore plus élevés (AR, définis comme le rapport des dimensions longitudinales aux dimensions transversales) diffusent la lumière plus efficacement à la longueur d'onde longitudinale du plasmon et peuvent donc mieux fonctionner dans les applications d'imagerie optique que les NP sphériques. Les NS plus petits ont une efficacité d'absorption améliorée, ce qui améliore l'efficacité de la thérapie photothermique [6,7,8,9]. De plus, des structures anisotropes ont récemment été utilisées pour former des structures auto-assemblées avec des propriétés plasmoniques supérieures qui découlent d'une trempe efficace, d'absorptions molaires extrêmement élevées au développement de champs électromagnétiques très localisés et intenses [10,11,12,13]. Pouvant ajuster le rapport hauteur/largeur et la taille des NS Au, différentes structures peuvent être synthétisées pour répondre à diverses applications, notamment le chauffage localisé, la détection, l'encapsulation et la libération de molécules cibles [14,15,16].

Au NSs sont généralement synthétisés en utilisant l'électrotempérature [17], la technique de réduction photochimique [18], ou la croissance ensemencée––avec ou sans Ag [19, 20]. Ces dernières années, la synthèse de la croissance ensemencée a fait l'objet de modifications supplémentaires, en utilisant des additifs organiques ou des mélanges de tensioactifs binaires pour permettre le contrôle de la croissance de NS [21,22,23,24,25]. Les conditions de synthèse employées permettent d'adapter les propriétés des NS Au en ajustant leur taille et leur forme, modifiant ainsi les sections efficaces de diffusion et d'absorption des NS. Lorsque les NS sont introduites dans un environnement biologique, les propriétés physicochimiques de ces Au NS (taille, forme et chimie de surface) jouent un rôle essentiel dans l'absorption cellulaire, c'est-à-dire l'interaction nanoparticule-cellule. La compréhension d'une telle interaction est essentielle pour explorer de nouvelles applications biomédicales exploitant différentes formes d'Au NS [26,27,28,29,30]. Par exemple, les nanotiges d'Au peuvent être utilisées pour induire une hyperthermie cellulaire dans les cellules cancéreuses avec la possibilité d'interférer avec les fonctions cellulaires et, dans certains cas, de les modifier via la modification de la surface des tiges [30,31,32,33,34]. Chen et al. ont rapporté que les nanocages d'Au peuvent être utilisées pour la destruction photothermique ciblée des cellules cancéreuses du sein [35]. De plus, des rapports récents ont démontré que la forme des nanoparticules peut être tout aussi ou plus déterminante pour l'absorption cellulaire que la taille [36, 37]. Cela nécessite le criblage de plusieurs formes (c. À notre connaissance, il n'existe aucune étude approfondie sur l'interaction des NS Au de différentes formes autres que des sphères et des nanotiges avec la cellule [38, 39].

Ici, nous étudions les interactions de cinq NS Au de forme différente avec des cellules de glioblastome-astrocytome et leur absorption cellulaire. Le glioblastome multiforme (GBM) est classé parmi les tumeurs cérébrales malignes humaines les plus agressives. Les patients atteints de GBM ont un pronostic sombre, avec une durée de survie moyenne de moins de 15 mois avec la chimiothérapie et la prise en charge standard [40, 41]. Le glioblastome-astrocytome est particulièrement intéressant pour les études d'absorption non seulement d'un point de vue médical mais aussi en raison de leur croissance rapide. Les cultures cellulaires de glioblastome-astrocytome ont un temps de doublement de la population de 32 h et ont un besoin continu de nutriments extracellulaires. Pour cette raison, ils sont très susceptibles d'engloutir rapidement des objets étrangers tels que les Au NS, qui s'ouvrent, par exemple, pour l'ablation hyperthermique des tumeurs [42], le marquage cellulaire ou l'administration de médicaments.

Dans le présent travail, cinq formes différentes de NS Au ont été synthétisées :quatre NS anisotropes (nanorods––NRs, nanomakura–– NM, tétrahexaèdres––THH, bipyramides––BP) par une approche de croissance médiée par des graines utilisant des mélanges binaires de surfactants et des particules sphériques (SP) en utilisant une méthode de Turkevich modifiée [43]. La forme des NS peut être adaptée en faisant varier le rapport de deux tensioactifs différents. Lorsqu'un protocole de croissance à médiation par les semences en deux étapes a été suivi, Au nanomakura (Makura est le japonais pour oreiller ) a été synthétisé. Une modification de surface en deux étapes a été effectuée pour remplacer le ligand de passivation par de l'acide 11-mercaptoundécanoïque (MUA) avant que les Au NS ne soient co-incubées avec des cellules de glioblastome-astrocytome. Les effets de la forme et de la concentration sur la cytotoxicité et l'absorption des NS dans les cellules de glioblastome-astrocytome ont été évalués.

Expérimental

Matériaux

L'acide oléique (OA, 90 %) a été acheté auprès d'Alfa Aesar. Nitrate d'argent (AgNO₃ ), bromure de didécyldiméthylammonium (DDAB, 98%), acide chloroaurique (HAuCl₄ .3H₂ O, 99,999%), acide D-(−)-isoascorbique (AsA, 98%), borohydrure de sodium (NaBH_4, ≥ 96%), l'acide 11-mercaptoundécanoïque (MUA, 98%), et l'O-[2-(3-mercaptopropionylamino)éthyl]-O-éthylpolyéthylène glycol (PEG-SH) de poids moléculaire 5000 Da ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich . Le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB, 99 %+) a été acheté chez Acros Organics et le citrate de sodium dihydraté (citrate de Na, qualité ACS) chez Merck. Tous les produits chimiques ont été utilisés tels que reçus sans autre purification. Toutes les solutions ont été préparées à l'aide d'eau distillée désionisée (résistivité ~ 18,2 μΩ-cm) purifiée par le système de purification d'eau Simplicity® Millipore.

Synthèse d'Au anisotrope

Des Au NS anisotropes ont été synthétisés à l'aide d'une méthode de croissance ensemencée assistée par Ag en utilisant des tensioactifs binaires (tableau 1). La figure 1a montre un schéma de la méthode de synthèse utilisée pour la croissance des NR, THH et BP.

Schémas de synthèse des Au NSs. un Schéma montrant le mécanisme de croissance ensemencé assisté par Ag utilisé pour la synthèse de différentes formes de NS Au. b Schéma montrant un mécanisme de croissance à deux graines pour le nanomakura

En bref, 5 mL de 0,5 mM HAuCl₄ .3H₂ 0 a d'abord été mélangé avec 5 mL de solution de CTAB 0,2 M et laissé sous agitation. Après cela, 1,6 mL de 3,75 mM NaBH₄ a été ajouté au mélange et laissé réagir pendant 2 min sous agitation afin de permettre l'échappement du gaz formé au cours de la réaction. La solution de graines a été utilisée pour une croissance ultérieure, après avoir attendu 30 min.

Dans une réaction de croissance typique, 15 mL d'un mélange aqueux de CTAB et de co-tensioactif dans divers rapports ont été préparés à 80 °C, comme indiqué dans le tableau 1. Après avoir refroidi la solution de tensioactif à température ambiante, 750 μL de solution 4 mM d'AgNO ₃ a été ajouté et laissé sous agitation pendant 15 min à 35 °C. Ceci a été suivi par l'ajout de 15 mL de 1 mM HAuCl₄ .3H₂ O solution et laisser mélanger sous agitation pendant encore 15 min. Après cela, 135 μL de 0,063 M d'AsA et 96 μL de graines d'Au ont été ajoutés et la réaction a été effectuée pendant 24 h à 35 °C. Les produits ont été séparés par centrifugation. Il est important de noter que dans le cas de l'arthrose, la couleur jaune initiale de la solution de croissance se décharge dans les 15 min (avant l'ajout des graines) indiquant la réduction de Au ³⁺ à Au ⁺ . La figure 1b montre le schéma de la synthèse du NM, qui est basé sur une approche de croissance à deux graines. Le protocole suivi est similaire à celui indiqué ci-dessus, à l'exception de l'ajout d'une solution de croissance intermédiaire (300 μL) (obtenue presque immédiatement après l'ajout de graines Au à la première solution de croissance), au lieu des graines régulières, à une solution de croissance fraîche et permettant la réaction continuer pendant 24 h à 35 °C.

Synthèse de NS Au sphériques

Les NS Au sphériques ont été synthétisées en utilisant une méthode de Turkevich modifiée [44]. Dans une synthèse typique, 10 mL de solution de citrate de sodium 10 mM ont été ajoutés à un ballon de réaction de 25 mL, maintenu à 70 °C. Dix millilitres d'acide chloroaurique 1,5 mM (HAuCl₄ . 3H₂ O) a été ajouté goutte à goutte et laissé réagir pendant 20 min sous agitation vigoureuse à 70 °C. La solution vire au rouge violacé environ 8 min après la réaction. Après cela, la solution a été refroidie à température ambiante et des Au NS sphériques ont été séparés de la solution n'ayant pas réagi, en utilisant une centrifugation à 14 500 tr/min pendant 10 min.

Fonctionnalisation de surface des NS Au

Pour échanger les ligands à la surface des Au NS, une procédure en deux étapes adaptée et modifiée de Thierry et al. [45] a été suivi. Les concentrations des NS telles que synthétisées ont été ajustées à 1 mg mL ⁻¹ avant le début des étapes de fonctionnalisation. La première étape dépend de l'introduction d'une couche de PEG-SH pour remplacer partiellement la bicouche CTAB liée puisque le thiol a une plus grande affinité pour la surface Au [46]. De plus, une couche de PEG-SH fournit une stabilisation stérique au NS. Dans la deuxième étape, le CTAB résiduel est remplacé et la couche de PEG-SH est en outre échangée avec un alcanethiol, MUA. Le MUA permet une élimination complète du CTAB de la surface Au revêtue de PEG-SH à encombrement stérique.

Dans une procédure de fonctionnalisation typique, 1 mL de 1 mg mL ⁻¹ solution d'Au NS a été mélangée avec 1 mL de 1 mg mL ⁻¹ solution de la solution PEG-SH. La solution mélangée a été maintenue sous agitation vigoureuse permettant le remplacement partiel du CTAB par du PEG-SH pendant 2 h. Après cela, les NS pégylées ont été éliminées par centrifugation à 14 500 tr/min pendant 20 minutes et redispersées dans 1 ml d'eau MQ. Pour fonctionnaliser les NS Au avec des groupes acide carboxylique, 500 μL de la solution de NS PEGylée ont été mélangés avec 250 μL d'une solution 10 mM de MUA préparée dans de l'éthanol/eau et laissés réagir dans un bain sonique maintenu à 55 °C pendant 1 h . Après cela, les NS Au recouverts de MUA ont été séparés du MUA libre par centrifugation à 14 500 tr/min pendant 20 min. Les Au NS recouverts de MUA se sont facilement redispersés dans l'eau MQ.

Études in vitro

Culture de cellules de glioblastome-astrocytome

Des cellules humaines de glioblastome-astrocytome (U-87 MG, ECACC, Sigma-Aldrich, Salisbury, Royaume-Uni) ont été cultivées dans Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) avec 1,25 % de gentamicine (Sigma) et 10 % de sérum bovin fœtal (Autogen Bioclear, Wiltshire, ROYAUME-UNI). Les cultures ont été complétées avec 2 mM de L-glutamine, 1 % d'acides aminés non essentiels (NEAA, Sigma) et 1 mM de pyruvate de sodium (NaP, Sigma).

Test LIVE/DEAD®

Un test de viabilité des cellules LIVE/DEAD (Invitrogen, Life Technologies) évalue l'intégrité membranaire des cellules et se compose de deux colorants différents :la calcéine AM (excitation/émission 494/517 nm) et l'éthidium homodimère-1 (excitation/émission 517/617 nm). Dans les cellules vivantes, les estérases intracellulaires réagissent avec la calcéine AM et produisent une fluorescence verte cytoplasmique. L'éthidium homodimère-1 (EthD-1) diffuse sur les membranes cellulaires endommagées des cellules mortes, où il se lie aux acides nucléiques et émet une fluorescence rouge. Après marquage avec des NS, la viabilité des cellules LIVE/DEAD® a été réalisée sur des cellules de glioblastome-astrocytome comme décrit par le fabricant. En bref, une solution LIVE/DEAD® a été préparée dans 4,5 mL de PBS avec 2,7 μL de calcéine (Invitrogen) et 12 μL d'homodimère d'éthidium (Invitrogen) ont été ajoutés à 1:1 (v /v ) et laissé réagir pendant 30 min à 37 °C avant la microscopie. Un colorant nucléaire (Hoechst 33258, excitation/émission 356/465 nm, Sigma) a été ajouté (200 μg mL ⁻¹ ) afin de visualiser le noyau et élucider toute absorption nucléaire de Au NS. L'imagerie a été réalisée sur un microscope à fluorescence Axiovert 200 M (Zeiss, Allemagne), à ​​des grossissements × 40 ou × 10, en utilisant AxioVision Rel. 4.3 logiciel. Les images ont ensuite été traitées avec ImageJ 1.46.

Évaluer la toxicité cellulaire en fonction de la concentration

Les cellules à 70 % de confluence ont été marquées avec Au NS à des concentrations de NS/volume de support de 100 μg mL ⁻¹ , 200 μg mL ⁻¹ , 500 μg mL ⁻¹ , et 2 mg mL ⁻¹ et incubé à 37 °C pendant 24 h dans des plaques 9 puits (Corning®). Trois parallèles (puits) ont été préparés pour chaque concentration. Des cultures de glioblastome-astrocytome non marqués, au même stade de confluence, ont été utilisées comme témoins. Les pourcentages de cellules mortes ont été calculés par comptage manuel. La morphologie très désordonnée des cellules de glioblastome-astrocytome rend le comptage automatisé moins fiable. Trois images superposées de cellules vivantes et mortes ont été prises dans chaque puits, et les cellules vivantes et mortes moyennes ont été calculées pour chaque forme. La même chose a été faite pour l'échantillon à blanc, et la viabilité a été évaluée en soustrayant la moyenne des morts/vivants du blanc.

Évaluer l'absorption cellulaire en fonction du temps pour le nanomakura Au NS

Les cellules à 70 % de confluence ont été marquées avec du nanomakura Au NS à des concentrations de NS/volume de support de 2 mg mL ⁻¹ et incubé à 37 °C pendant 2, 6, 12 et 24 h avant le test LIVE/DEAD® avec coloration nucléaire. Des cultures de glioblastome-astrocytome non marqués, au même stade de confluence, ont été utilisées comme témoins. Les culots cellulaires ont été préparés pour la MET via trypsination et centrifugation avant fixation primaire dans du paraformaldéhyde (2% v /v ) et le glutaraldéhyde (2,5% v /v ) dans du PBS (0,1 M, pH =  7,4) pendant une nuit. Pour la fixation secondaire, deux fixateurs différents ont été préparés pour une coloration optimale des membranes intracellulaires. Les deux ont été préparés dans du tampon cacodylate 0,1 M, l'un contenant 1 % de tétroxyde d'osmium (v /v ) et l'autre contenant 1% de tétroxyde d'osmium (v /v ) et 1,5% de ferrocyanure de potassium (v /v ). Une heure après la fixation secondaire à température ambiante, une déshydratation progressive à l'alcool a été réalisée, avant déshydratation à l'oxyde de propylène, infiltration et sectionnement ultramicrotome de tranches de 70 nm.

Techniques de caractérisation

Les images STEM en champ clair (BF) ont été acquises à l'aide d'un microscope électronique Hitachi S-5500 fonctionnant à une tension d'accélération de 30 kV. Des images de microscopie électronique à transmission (HRTEM) à haute résolution ont été acquises à l'aide de JEOL 2100 fonctionnant à 200 kV. Les distributions de tailles et les potentiels zêta des NS ont été mesurés à l'aide d'un instrument Malvern Zetasizer Nano-ZS et du logiciel du fabricant. Les mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) sont basées sur l'hypothèse de particules sphériques et ne sont pas appropriées pour mesurer les tailles hydrodynamiques des NS anisotropes sans une configuration multi-angle et un ajustement rigoureux des données résultantes. Cependant, DLS a été utilisé dans cette étude comme un moyen de suivre qualitativement les changements de taille émanant de la procédure de fonctionnalisation. L'eau MQ a été utilisée comme solvant dans tous les cas. Les spectres ultraviolet-visible (UV-Vis) ont été acquis avec un spectrophotomètre UV-2401PC (Shimadzu). Les spectres ont été collectés sur la gamme spectrale de 200 à 800 nm. Les analyses par spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) ont été effectuées à l'aide d'un spectromètre Kratos Axis Ultra DLD (Kratos Analytical, UK), équipé d'une source de rayons X en aluminium monochromatisé (Al, hν = 1486.6 eV) fonctionnant à 10 mA et 15 kV ( 150 W). Les spectres d'enquête ont été collectés sur la plage d'énergie de liaison de 0 à 1 100 eV avec une énergie de passage de l'analyseur de 160 eV. Un mode de lentille hybride (électrostatique et magnétique) a été utilisé avec une zone d'analyse d'environ 300 μm × 700 μm.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des Au NSs anisotropes

Au NSs anisotropes ont été synthétisés via une approche de croissance médiée par les semences employant des mélanges de tensioactifs binaires. Lorsque des graines d'Au coiffées par CTAB (~ 5 nm) ont été ajoutées à la solution de croissance de mélanges de tensioactifs binaires (rapport molaire de OA CTAB ~ 20 :1), des NR d'Au à faible rapport d'aspect se sont formés (Fig. 2a et tableau 2). L'image HRTEM a révélé la morphologie monocristalline et en os de chien des NR (encadré sur la figure 2a). L'OA, un acide gras qui agit également comme un agent réducteur faible facilite la réduction d'Au ³⁺ à Au ⁺ . Le changement de couleur de la solution de croissance du jaune au transparent (~ 15 min) a confirmé notre observation. L'ajout supplémentaire d'acide ascorbique à la solution de croissance augmente le taux de réduction de Au ⁺ . En conséquence, les atomes d'Au diffusent rapidement sur les facettes d'extrémité {111} [16] des NR parce que le tassement des structures micellaires mixtes est moins dense par rapport au côté {110} et à l'extrémité {100} des NR [25]. Par conséquent, la surcroissance de NR aux extrémités {111} des facettes plutôt qu'aux facettes {110} et {100} conduit à la formation de NR de morphologie d'os de chien. Nos résultats suggèrent également qu'il est peu probable que les facettes {110} soient recouvertes d'Au en raison de la forte interaction de ces facettes avec les molécules de tensioactif par rapport aux autres facettes. Nous avons également confirmé le rôle de l'OA et de l'acide ascorbique dans la formation des Au NR de la morphologie de l'os de chien. Lorsque la concentration d'OA ou d'acide ascorbique a diminué dans la solution de croissance, seuls les NR d'Au ont été obtenus. Ces résultats indiquent la diminution du taux de réduction et du taux de diffusion des atomes d'or, conduisant à la formation d'Au NR (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1, ESI†).

Images STEM et spectres UV-Vis d'Au NS de différentes formes. un L'image BF-STEM des NR Au de la morphologie de l'os de chien et l'image HRTEM en médaillon montrent la nature monocristalline des NR. b Image BF-STEM de NS Au tétrahexaédriques allongés (l'encart est l'image SEM). c Image SEM des BP Au (l'encart est l'image SEM d'un seul BP). d Image MET de particules sphériques d'Au (l'image HRTEM en médaillon montre la nature polycristalline des particules d'Au). e Image BF-STEM des nanomètres Au. f Spectres UV-vis de Au NSs de différentes formes

Lorsque la concentration d'OA par rapport à CTAB a été augmentée dans la solution de croissance (tableau 1), des NS Au de forme allongée de THH ont été obtenues (Fig. 2b et tableau 2). Le changement de forme des NS Au peut s'expliquer sur la base de la modification des structures micellaires mixtes par l'OA. Les structures micellaires mixtes en forme de bâtonnets sont formées à une faible concentration d'OA. La quantité accrue d'OA dans les structures micellaires mixtes modifie sa structure en convexe et facilite la formation de THH Au NS allongés. Notre étude précédente a également révélé qu'une augmentation de la concentration de co-tensioactif rend les structures micellaires mixtes plus convexes [25]. La forme des NS Au peut également être modifiée en remplaçant OA par DDAB. Nous avons obtenu des NS Au de forme bipyramide (BP) en utilisant CTAB et DDAB (Fig. 2c et Tableau 2) comme indiqué dans nos travaux précédents [25]. De plus, des particules d'Au sphériques ont été synthétisées par une méthode de Turkevich modifiée (Fig. 2d).

Nous avons également étudié l'influence de la solution de graine sur la forme des NS Au. La solution d'ensemencement a été extraite de la solution de croissance de CTAB et d'OA (OA:CTAB ~ 20:1) après 1 min de réaction et ajoutée à la solution de croissance fraîche contenant OA:CTAB ~ 20:1. Au NSs de nanomakura La morphologie (NM) a été obtenue après la fin de la réaction de croissance (Fig. 2e). La morphologie du NM semble similaire à celle de l'os de chien. Cependant, étant donné que les NS se développent dans toutes les directions, comme le montrent les images MET prises à différents angles (Fig. 3a et Tableau 2), nous appelons donc ces NS NM. Pour illustrer le mécanisme de croissance des nanoparticules Au, un petit volume a été prélevé dans la solution de croissance à différents intervalles de temps et la réaction intermédiaire a été analysée à l'aide de l'imagerie STEM (Fig. 3b). Lorsque des particules de graines recouvertes de CTAB ont été ajoutées à la première solution de croissance, la couleur de la solution de croissance s'est rapidement transformée en violet foncé indiquant la formation de Au NS anisotropes. 300 μL de solution de la première solution de croissance ont été ajoutés à la deuxième solution de croissance, puis quelques gouttes de la solution ont été immédiatement ajoutées à la grille TEM.

Morphologie et croissance de Au NM (nanomakura ). un Images MET de NM prises sous différents angles. b Les images BF-STEM montrent les étapes de croissance dans la formation des NS Au de type NM. La solution extraite de la solution de croissance à différents moments a été ajoutée directement à la grille TEM sans purification

Des images STEM représentatives ont montré une croissance relativement plus rapide de l'Au NM dans le sens longitudinal que dans le sens transversal (0 s). Après 30 s, des NS ressemblant à des nœuds papillon ont été observés. Des NM ayant des tailles finales ont déjà été observés environ 3 min de la réaction. Nous n'avons observé aucun autre changement dans la forme et la taille des NS après 30 min et 8 h. Sur la base de notre analyse, on peut supposer que la croissance globale des nanomatériaux d'Au suit un mécanisme de croissance autocatalytique stochastique de type « pop-corn », dans lequel les graines individuelles dorment pendant un certain temps avant de se développer soudainement et rapidement dans les formes finales, comme cela a été le cas. été observé pour les NR par Cortie et al. [47]. Les NM ont une structure tridimensionnelle, illustrée par des images HRTEM des NM obtenues à différents angles de rotation (Fig. 3a) contrairement aux NS en forme d'os de chien précédemment rapportés [48, 49].

Les propriétés optiques des NS Au de différentes formes ont été mesurées et les résultats sont présentés sur la figure 2f. Au NSs affichent des caractéristiques LSPR accordables sur la gamme UV-Vis––visible––proche infrarouge (IR). Les bandes de plasmons se divisent en multiplets pour les structures anisotropes – les bandes longitudinales et transversales, en raison d'oscillations de résonance selon des axes différents. Les NR montrent au moins trois bandes distinctes - 516 nm, 679 nm et 796 nm, la plus forte étant celle du milieu. L'émergence d'une troisième bande peut être associée à la polydispersité des NR due à l'effet de gravure de l'acide oléique. Cela conduit à la formation de nanotiges avec des bords rugueux. Des pics de résonance transversaux et longitudinaux (557 et 760 nm, respectivement) sont observés pour NM, qui a une surface plus irrégulière que les nanotiges. Cependant, pour les structures plus grandes (THH et BP), des pics LSPR simples et larges sont observés à 568 nm et 593 nm, respectivement. Alors que les spectres UV-vis du THH présentent une ressemblance similaire avec les études précédentes [50], les deux modes des BP semblent fusionnés en un large pic contrairement à ce qui est observé autrement [51]. Cela peut être attribué à un faible rendement de la forme BP ou à une centrifugation non sélective de forme appliquée à l'Au NS ou à un revêtement inégal conduisant à une anisotropie de forme en solution.

Fonctionnalisation de surface des NS Au

Au NS de différentes formes ont été fonctionnalisés à l'aide d'une méthode en deux étapes - en remplaçant le CTAB bicouche par du O-[2-(3-mercaptopropionylamino) éthyl]-O-méthylpolyéthylène glycol (PEG-SH) et par la suite par du MUA. La figure 4a montre les diamètres hydrodynamiques des NS à chaque étape de la fonctionnalisation. Une augmentation séquentielle des tailles est obtenue par rapport aux NS recouvertes de CTAB, pour chaque NS (sauf pour les BP) indiquant une fonctionnalisation réussie. Comme les mesures DLS sont basées sur l'hypothèse de particules sphériques, l'analyse de détermination de la taille des NS anisotropes doit être approchée des NS sphériques ayant les mêmes coefficients de diffusion que ceux des NS anisotropes.

Tailles et potentiels zêta des NS Au. un Variation des tailles DLS des Au NSs après chaque étape de fonctionnalisation. b Variation des potentiels zêta des Au NS à chaque étape de fonctionnalisation. X -l'axe représente la nanostructure Au de différentes formes (nanotiges NR, tétrahexaèdres THH, nanomakura NM , BP bipyramide, SP sphérique)

Cela clarifie une légère diminution de la taille des BP recouverts de PEG-SH et prend également en charge les données UV-vis ci-dessus. À la suite de la fonctionnalisation, les charges de surface des NS diminuent massivement, comme le montre la figure 4b. Le tensioactif cationique est facilement déplacé par le PEG-SH, qui est ensuite remplacé par le MUA en raison d'une affinité plus élevée envers la surface Au. En raison de la petite taille de MUA, il a une plus grande flexibilité pour déplacer CTAB qui reste sur les NS, même après PEGylation. Les valeurs finales du potentiel zêta des NS recouvertes de MUA reflètent des surfaces chargées négativement pour toutes les NS à l'exception des NR. Cet écart peut être lié au revêtement irrégulier des petits NR ou à leur polydispersité, et au principe de mesure appliqué. Pour les NS sphériques, la charge de surface négative initiale est due au revêtement de citrate. Cependant, des amplitudes élevées des potentiels zêta pour tous les NS assurent la stabilité des NS dans les solutions aqueuses. Les mesures XPS réalisées sur les NS Au après chaque étape de fonctionnalisation, c'est-à-dire avec du PEG-SH suivi de MUA montrent une très faible teneur en brome en surface, confirmant l'élimination du CTAB lié en grande quantité à la surface des NS. (Tableau 1, ESI).

De plus, un revêtement des NS avec du PEG-SH et du MUA ne modifie pas considérablement leurs caractéristiques optiques. Cependant, un élargissement séquentiel des pics est obtenu après fonctionnalisation pour les NS anisotropes (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3, ESI†). Cela peut être dû à des axes de rotation différents des NS en raison de l'anisotropie, d'un revêtement non uniforme, d'un agrandissement de la taille (données DLS), d'une polydispersité des échantillons ou d'une combinaison de ce qui précède. Comme les propriétés optiques des Au NS dépendent de la forme, de la surface, de la taille et de l'état d'agrégation, il en va de même pour leurs interactions avec les cellules. Les études d'interaction cellulaire peuvent révéler dans quelle mesure les Au NS sont absorbées, leurs effets cytotoxiques et peuvent indiquer de futures applications thérapeutiques et diagnostiques.

Interaction cellulaire de Au NS de différentes formes

Généralement, les Au NS pénètrent dans la cellule par endocytose, qui peut être médiée par un récepteur ou indépendante du récepteur, par phagocytose dépendante de l'actine ou par d'autres voies endocytaires actuellement inconnues [52]. La description de la route empruntée par la NS est d'une importance cruciale, car elle détermine en fin de compte le destin intracellulaire de la NS [53]. Des études ont montré que le mécanisme d'absorption intracellulaire dépend des propriétés physico-chimiques, AR, et des caractéristiques de surface de la NS, ainsi que du type cellulaire [54,55,56,57,58]. La charge des molécules stabilisatrices de surface sera effectivement la charge de la NS [59]. Les NS chargées positivement ont une forte adsorption des protéines dans les milieux biologiques et peuvent endommager gravement les membranes des cellules. De ce fait, une charge neutre ou négative est préférable pour éviter une forte adsorption sur les membranes cellulaires et/ou une adsorption protéique [26, 60]. De plus, la forme des NS déterminera dans quelle mesure la couverture de surface des molécules stabilisantes est uniforme ou non [61].

Ici, tous les NS Au, à l'exception des NS sphériques, ont été synthétisés avec l'agent tensioactif CTAB. Au NSs ont été fonctionnalisés avec MUA pour gagner une surface chargée négativement avant les études d'interaction cellulaire. Des Au NS stables recouvertes de MUA ont ensuite été co-incubées avec des cellules humaines de glioblastome-astrocytome pendant 24 h, et l'effet de la forme et de la concentration sur la cytotoxicité a été évalué avec un test LIVE/DEAD®, complété par une coloration nucléaire pour mettre en évidence l'Au NS intracellulaire .

La mort cellulaire la plus élevée a été observée avec le NM à forte concentration (Fig. 5a), avec une mort cellulaire proche de 20 % après correction du blanc. Les autres NS n'ont pas montré la même tendance de cytotoxicité, ce qui pourrait indiquer que les NM sont absorbés à un taux/volume plus élevé que les autres formes [62]. Le comptage des cellules pour ces formes a montré une cytotoxicité inférieure à 5 % après correction du blanc (pour les images de toutes les formes, voir le fichier supplémentaire 1 :Figure S4, ESI†).

Effet de Au NS sur les cellules de glioblastome-astrocytome. un Percentage cell death of glioblastoma-astrocytoma cells as a function of concentration of AuNSs. Incubation time was 24 h. Images b –m are acquired after incubation of makura -shaped AuNSs in glioblastoma-astrocytoma cells taken at several time points up to 24 h. b TEM shows an invagination of the cellular membrane (m membrane, scale bar = 1 μm), and c halogen and d fluorescence images show association of makura-shaped AuNSs at the cellular membrane. e Uptake of makura-shaped AuNSs were observed after 6 h (scale bar = 500 nm), f with uptake in intracellular vesicles (v vesicle, scale bar = 2 μm). g Staining of the nucleus (n ) suggests that makura-shaped Au NSs were excluded from the nucleus. h TEM images taken after 12 h suggest uptake via macropinocytosis (scale bar = 500 nm), with i intravesicular location of makura-shaped AuNSs (vm vesicular membrane, scale bar = 500 nm). j Intracellular compartmentalization was also visible from the microscopy. Uptake of makura-shaped AuNSs continued at 24 h as seen in TEM images k (scale bar = 2 μm) and l (scale bar = 5 μm). m Detachment of glioblastoma-astrocytoma cells from the surface was observed, which most likely is an indication of cell death

The data presented here suggest that size plays a minor role in cytotoxicity in glioblastoma-astrocytoma cells. For instance, the small spherical NSs (15 nm) showed the same uptake/cytotoxicity as the large BPs (650/270 nm). Based on previous studies, we expected the NRs to give the highest cytotoxicity, due to their AR and surface charge. Positively charged NSs are considered to be particularly toxic as they can induce apoptosis [63] and cause the production of reactive oxygen species [64]. However, in the data presented here, the positively charged NRs did not show increased cell death compared to any other shape (Fig. 5a). This might be explained as follows:the surface charge of NS was determined with zeta potential measurements, an approach based on spherical particle assumption (Table 2). Thus, the reported charge of the NRs most likely misrepresents their actual charge. Although the AR of the rods synthesized here is large (2.8), their overall size falls in a size range that shows good uptake in cells (20–50 nm). [30, 65] A previous study has suggested that the size of NS does not only seem to govern endocytosis but also exocytosis. For instance, the removal half-life of 14 nm AuNS was much faster than removal half-life of 74 nm AuNS [26]. Here, the smaller Au rods and spheres, may, therefore, have been removed via exocytosis, which may explain their low cytotoxicity.

The main feature of the NM is not their size, but their irregular structure, and it appears from the image in Fig. 5a that shape has been the determining factor for the high uptake. However, an irregular morphology may have undermined the surface coverage of MUA and as such decreased the solution stability of the NM. Also, we cannot exclude that as two-dimensional cell studies are affected by gravity, a low stability in the cell medium increases the likelihood of sedimentation which can propel the endocytosis.

To get further insight into the uptake mechanism and interactions, we followed uptake of NM at high concentration (2 mg mL ⁻¹ ) with light microscopy and TEM for 24 h. The images show that after 2 h of co-incubation, the NM associate with the cellular membrane (Fig. 5c, d) and are engulfed by the cells (Fig. 5b, e). The mechanism of endocytosis seems to be initially receptor-mediated (Fig. 5b) and at later stages through macropinocytosis (Fig. 5h). The latter is believed to occur when large objects enter a cell, and the aggregation of NSs may have induced macropinocytosis. This might mean that the initial solution stability of the Au NM is sufficient, but that with time they aggregate and are taken up as larger species, most likely due to protein adsorption. Uptake of any extracellular NS in an intracellular vesicle involves wrapping of the cell membrane. If many such wrapping events occur, this alters the global elasticity of the cell membrane, which in turn affects the membrane integrity. If many macropinocytosis events occur, the membrane integrity may be severely impaired. This is believed to be one of the effects for the cytotoxicity observed for the NM.

Once inside the cell, it appears that the Au NM align at the periphery of the vesicles, adhering to the vesicular membrane (Fig. 5i). The endosome seems to be trafficked towards the nucleus (Fig. 5f, g, and l), which is consistent with previous studies that show that Au NSs taken up via receptor-mediated endocytosis may eventually end up in the Golgi apparatus [53, 66]. The uptake appears to continue upto 24 h (Fig. 5k), owing to the high concentration gradient of Au NS in the cell culture media [59].

At 24 h with co-incubation, the morphology of the cells changes (Fig. 5m), going from star-shaped to a more rounded shape with less visible filopodia [67], followed by detachment from the surface. Although this study does not go further in the molecular events following uptake of NS, a detachment of filopodia may suggest that NM can interact with the cytoskeleton and cause detachment and apoptosis.

We extended the cytotoxicity assay beyond 24 h and investigated the result of co-incubation at 48 and 72 h, the reason being that few cell studies are performed at these time points [68, 69], and the main argument being that cellular uptake reaches a plateau at 24 h [70]. Our results show (Additional file 1:Figure S5, ESI†) that beyond 24 h, the cells continued to detach from the flask surface, i.e., cell death and uptake continue beyond 24 h. As we cannot exclude that starvation of the cells would have increased the cytotoxicity and detachment, a cytotoxic response is a dynamic process likely to evolve over time differentially.

Conclusions

In summary, we have synthesized five different shapes of Au NSs using a seed-mediated growth approach (nanorods, nanomakura , tetrahexahedral, bipyramidal) and the Turkevich method (spherical). These NSs have different sizes:the smallest being the NRs and the largest being the BPs, ranging from 22 to 156 nm. Their optical properties measured using UV-vis spectroscopy show LSPR span from UV, visible, to near IR. High values of zeta potential render good stability in aqueous solution. With an aim to exchange the cationic surfactant on the surface, a two-step functionalization protocol was employed to replace the CTAB with PEG thiol and MUA.

After coating, the NSs showed a decrease in surface charge, coupled with an increase in size, proving successful functionalization. In vitro studies were performed for all the synthesized NSs involving co-incubation with glioblastoma-astrocytoma cells for 24 h. The greatest cytotoxic response (~ 20%) was observed with NM at high concentration, which is consistent with higher uptake. An in––depth study with TEM revealed a time-dependent internalization in cancer cells via endocytosis and macropinocytosis. This successful internalization of the Au NM in cancer cells, coupled with their unique physicochemical properties, render them suitable for hyperthermia and drug delivery to cancer cells while being simultaneously imaged.

Abréviations

AgNO₃ :

Silver nitrate

Au:

Gold

BF:

Bright filed

BPs:

Bipyramids

CTAB :

Cetyltrimethylammonium bromide

DDAB:

Didecyldimethylammonium bromide

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

EMEM:

Eagle’s Minimal Essential Medium

EthD-1:

Ethidium homodimer-1

GBM:

Glioblastoma multiforme

HAuCl4:

Cholorauric aicd

HRTEM :

Microscopie électronique à transmission haute résolution

IR :

Infrarouge

LSPR :

Résonance plasmonique de surface localisée

MUA:

11-Mercaptoundecanoic acid

Na-citrate:

Sodium citrate dihydrate

NM:

Nanomakura

NRs:

Nanorods

Ns:

Nanostructure

OA :

Oleic acid

PEG-SH:

O-[2-(3-Mercaptopropionylamino) ethyl]-O-ethylpolyethylene glycol

STEM:

Scanning transmission electron microscopy

TEM :

Microscopie électronique à transmission

THH:

Tetrahexahedra

UV-Vis:

Ultraviolet-visible

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X