Absorption du photosensibilisateur au chlore e6 par un nanosystème hybride polystyrène-diphényloxazole-poly(N-isopropylacrylamide) étudié par transfert d'énergie d'excitation électronique

Contexte

Le principal inconvénient de la thérapie photodynamique du cancer est la faible profondeur de pénétration du faisceau d'excitation dans le tissu [1]. Ainsi, une approche de thérapie radiodynamique pour le traitement du cancer (où le sensibilisateur pourrait être efficacement excité avec les rayons X capables de pénétrer profondément dans le corps) a été proposée [2] et est intensivement étudiée au cours des dernières années [3,4,5]; l'un des domaines de recherche est le développement de sensibilisateurs qui génèrent de l'oxygène singulet lors d'une excitation aux rayons X [5,6,7,8]. Le processus clé dans un tel sensibilisateur aux rayons X est le transfert d'énergie d'excitation électronique (EEET) entre ses composants scintillants et sensibilisateurs [2, 6, 9,10,11]. Un autre composant important du sensibilisateur aux rayons X mentionné est la manière de maintenir les pièces scintillantes et sensibilisantes ensemble à la distance optimale pour l'EEET ; On peut citer la conjugaison chimique [2, 3], l'attraction électrostatique [8, 12], le surfactant [11] ou la coque polymère [4]. Auparavant, dans le cadre de la conception de nanosystèmes (NS) pour la sensibilisation excitée par les rayons X de l'oxygène singulet, nous avons étudié l'EEET dans le polystyrène (PS)-diphényloxazole (PPO)-chlore e₆ NS, où le photosensibilisateur chlore e₆ a été liée à la nanoparticule PS-PPO (qui peut être utilisée comme scintillateur [13, 14]) via l'enveloppe de surfactant (dodécylsulfate de sodium) [15].

Le poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) appartient aux matériaux sensibles aux stimuli qui modifient leurs propriétés en réponse à un stimulus interne ou externe [16]. Le PNIPAM linéaire est connu pour subir une transition conformationnelle lors du chauffage, c'est-à-dire que le polymère rétrécit (en devenant hydrophobe et donc en expulsant les molécules d'eau) aux températures supérieures à la température critique inférieure de la solution (LCST) qui est égale à 32 °C pour le PNIPAM linéaire [17] . Une diminution considérable de la largeur de la coquille PNIPAM lors de la transition de température sur LCST a été montrée pour les nanoparticules PS-PNIPAM dans [17]. Dans le même temps, pour les chaînes PNIPAM conjuguées au dextrane, la température de transition de conformation s'est avérée supérieure de 2 à 4 °C par rapport au PNIPAM linéaire de poids moléculaire et de polydispersité similaires en raison de l'interaction stérique entre les chaînes PNIPAM entravant la conformation transition [18].

Dans ce travail, des nanoparticules PS-PPO recouvertes d'une coque PNIPAM réticulée (Figs. 1 et 2) ont été obtenues, résultant en un hybride PS-PPO-PNIPAM NS. La possibilité d'utiliser du PNIPAM réticulé pour fixer le chlore e₆ sensibilisateur au scintillateur PS-PPO NP a été étudié. Ce polymère a la transition conformationnelle aux températures physiologiques (pour le PNIPAM réticulé, la LCST doit être supérieure à 32 °C). Ainsi, le rétrécissement du réseau PNIPAM réticulé suite à un chauffage sous excitation pourrait entraîner une diminution de la distance entre le donneur PS-PPO et le chlore e₆ accepteur qui augmenterait l'efficacité de l'EEET et donc l'efficacité de la destruction tumorale.

Structures des composants du nanosystème hybride PS-PPO-PNIPAM et chlore e₆

Images MET des nanosystèmes hybrides PS-PPO-PNIPAM obtenus avec un grossissement inférieur (gauche) et supérieur (droite)

Expérimental

Matériaux

Styrène (ST, Ukraine) de p.a. la qualité a été purifiée via une méthode standard directement avant la polymérisation. N-Isopropylacrylamide (NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), N,N′-méthylènebisacrylamide (BIS, Sigma-Aldrich Inc.), persulfate de potassium K₂ S₂ O₈ (KPS, Ukraine), phosphate de sodium monobasique déshydraté NaH₂ Bon de commande₄ × 2H₂ O (Ukraine) et le tensioactif anionique dodécyl sulfate de sodium (SDS, Sigma-Aldrich Inc.) étaient de qualité réactif et utilisés sans autre purification. Chlore e₆ (Frontier Scientific Inc.) a été aimablement fourni par T.Y. Ohulchanskyy (Institut des lasers, de la photonique et de la biophotonique à l'Université d'État de New York à Buffalo). Cinquante millimoles de tampon TRIS-HCl (pH 7.2) ont été utilisées comme solvant.

Synthèse et caractérisation de nanosystèmes

Des nanosystèmes hybrides polystyrène-poly(N-isopropylacrylamide), dopés au PPO (PS-PPO-PNIPAM hybrid NS), ont été synthétisés comme suit. Dans un premier temps, des nanoparticules de noyau PS-co-PNIPAM dopées au PPO ont été préparées par polymérisation en microémulsion [13, 14, 19, 20]. En bref, 0,2 g de NIPAM, 0,2 g de dodécylsulfate de sodium et 0,01 g de NaH₂ Bon de commande₄ × H₂ O ont été dissous dans 90 g de H₂ O. Ensuite, 0,09 g de PPO ont été dissous dans 1,8 g de styrène et le mélange obtenu a également été ajouté goutte à goutte pendant 30 minutes. Le mélange a été agité à 700 tr/min et de l'Ar a été mis à barboter dans le mélange pendant 30 min. Après que la température ait augmenté à 70 °C, 0,01 g de K₂ S₂ O₈ dissous dans 1 ml de H₂ O a été injecté pour amorcer la polymérisation. Deuxièmement, la couche de coque PNIPAM a été fabriquée après 4 h de chauffage à 70 °C. A cet effet, une solution aqueuse de monomère NIPAM (0,69 g) et de réticulant N,N'-méthylènebisacrylamide (BIS) (0,06 g) ont été ajoutés dans le réacteur à l'aide d'une seringue. On a laissé la réaction se poursuivre pendant 3 h à 70 °C et 1 h supplémentaire à 90 °C. Le mélange a été refroidi à température ambiante et dialysé pendant 48 h en utilisant une membrane de cellulose avec MWCO 3500 Da.

Des images de microscopie électronique de transition (MET) des nanosystèmes obtenus sont présentées sur la figure 2. Pour la préparation de l'échantillon, des grilles de Cu de 400 mesh avec un film de carbone ordinaire ont été rendues hydrophiles par un traitement de décharge luminescente (Elmo, Cordouan Technologies Bordeaux France). Une goutte de 5 µl a été déposée et laissée adsorbée pendant 1 min, puis l'excès de solution a été éliminé avec un morceau de papier filtre. Les observations des nanosystèmes PS-PPO-PNIPAM ont été réalisées sur deux MET, Tecnai G2 ou CM12 (FEI, Eindhoven, Pays-Bas), et les images ont été acquises avec une caméra ssCCD Eagle sur le Tecnai et une caméra Megaview SIS sur le CM12. On voit sur la figure 2 que les nanosystèmes hybrides obtenus sont constitués de plusieurs PS-PPO NP sphériques liés ; nous pensons qu'ils sont liés par un filet de polymère PNIPAM réticulé. Ainsi, des nanosystèmes hybrides PS-PPO-PNIPAM ont été obtenus.

Mesures spectrales et préparation d'échantillons

Les spectres d'absorption ont été mesurés en utilisant un spectrophotomètre Specord M40 (Carl Zeiss, Allemagne). Les spectres d'excitation et d'émission de fluorescence ont été enregistrés à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence Cary Eclipse (Varian, Australie). Les mesures d'absorption et de fluorescence ont été effectuées dans une cellule de quartz de 1 × 1 cm à température ambiante. Cinquante millimoles de tampon TRIS-HCl, pH 7,2, ont été utilisées comme solvant. Pour les mesures spectrales, la solution obtenue de PS-PPO-PNIPAM hybride NS a été dissoute 100 fois dans du tampon. Solution mère de chlore e₆ à la concentration, 10 mM ont été préparés dans du DMF et dilués davantage dans du tampon à une concentration de 1 mM. Petite aliquote de cette solution 1 mM de chlore e₆ a ensuite été ajouté à une solution tampon dissoute 100 fois de NS; la concentration finale de chlore e₆ était de 2 μM, et le mélange de DMF était donc de 0,02 %. Spectres d'excitation et d'émission de fluorescence de la solution NS hybride PS-PPO-PNIPAM avec du chlore e₆ a été mesuré en 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 et 100 min après l'ajout de chlore e₆ à la solution de PS-PPO-PNIPAM hybride NS. En près de 80 min, la saturation était atteinte.

Pour les mesures dépendantes de la température, solution d'hybride PS-PPO-PNIPAM NS en présence de chlore e₆ a été placé dans le porte-cuve thermostaté (T = 23 °C). En 88 min après la préparation de l'échantillon, après la prise de chlore e₆ par l'hybride PS-PPO-PNIPAM NS a atteint la saturation, le débit d'eau du bain-marie a été activé en chauffant l'échantillon à 39 °C (cette température doit dépasser la LCST pour le PNIPAM réticulé). Spectres d'excitation de fluorescence du chlore e₆ (émission à 680 nm) ont ensuite été mesurées à différents intervalles de temps après le démarrage du chauffage. Les résultats expérimentaux indiquent que la transition de conformation commence environ 3 min après le début du chauffage. Il convient de mentionner qu'environ 18 min après le début du chauffage, la coagulation de la NS s'est produite donnant des caillots macroscopiques (qui disparaissent cependant après le refroidissement de la solution, donc la coagulation est réversible). L'expérience de température a été réalisée trois fois et des tendances similaires ont été obtenues.

Résultats et discussion

Les spectres d'absorption, d'excitation de fluorescence et d'émission de fluorescence des nanosystèmes hybrides PS-PPO-PNIPAM obtenus dans un tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7.2) sont présentés sur la Fig. 3. Le spectre d'absorption contient les bandes correspondant au styrène (maximum près de 260 nm ) et PPO (maximum près de 307 nm). Dans le même temps, le spectre d'émission de fluorescence lors de l'excitation à 250 nm (la plage d'absorption du styrène) a donné le spectre qui appartient exclusivement à la PPO (avec un maximum à 367 nm), tandis que l'émission de styrène (due à 307 nm [15] ) n'a pas été observée. Ainsi, l'EEET du styrène au PPO incorporé est presque terminé. L'EEET est également soutenu par le spectre d'excitation de l'émission de PPO (380 nm) où la bande du styrène proche de 260 nm est clairement observée (Fig. 3). Il convient d'ajouter qu'une structure vibronique claire a pu être observée dans le spectre d'émission de PPO (ce qui n'est pas observé pour la solution aqueuse de PPO [14]) qui indique en outre l'incorporation de PPO dans la matrice PS.

Spectres d'absorption (ligne noire pleine), d'excitation de fluorescence (émission à 380 nm, normalisée ; ligne noire en pointillés courts) et d'émission (excitation à 250 nm, normalisée; ligne rouge pleine) des nanosystèmes hybrides PS-PPO-PNIPAM obtenus dans Tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7.2)

En outre, à la solution des nanosystèmes hybrides PS-PPO-PNIPAM obtenus dans du tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7.2), le photosensibilisateur chlore e₆ était ajouté. Spectre d'absorption du chlore e₆ montre presque aucun changement dans la présence de nanosystèmes hybrides par rapport à la solution tampon, à l'exception d'une petite diminution de la densité optique dans les maxima (Fig. 4).

Spectres d'absorption du chlore e₆ (2 μM) libre (trait noir) et en présence de nanosystèmes hybrides PS-PPO-PNIPAM (trait rouge) dans du tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7.2

En même temps, effet de l'ajout de chlore e₆ à l'hybride PS-PPO-PNIPAM NS sur les spectres de fluorescence est beaucoup plus perceptible par rapport à ceux d'absorption. Tout d'abord, la présence de chlore e₆ conduit à l'extinction de l'émission fluorescente PPO de l'hybride PS-PPO-PNIPAM NS, et cette extinction s'améliore pendant environ une heure (Fig. 5). Généralement, une telle extinction pourrait être due soit à l'EEET (qui conduirait à l'extinction de l'émission du donneur à toutes les longueurs d'onde d'émission) soit à la réabsorption (qui conduirait à l'extinction de l'émission du donneur aux longueurs d'onde de l'absorption de l'accepteur). Les différences de spectres d'émission de PPO (Fig. 5) montrent qu'immédiatement après le chlore e₆ De plus, la contribution de la réabsorption à l'extinction des émissions de PPO est importante (mais un EEET a également lieu). Dans le même temps, la contribution de la réabsorption diminue encore avec le temps et celle de l'EEET augmente.

Spectres de fluorescence de l'hybride PS-PPO-PNIPAM sans NS (trait noir plein) et après ajout de chlore e₆ mesuré en 0 min (ligne noire en pointillés courts) et en 80 min (ligne noire en pointillés et en pointillés). La longueur d'onde d'excitation est de 250 nm. Cinquante millimoles de tampon Tris-HCl, pH 7,2 sont utilisées comme solvant. Les différences des spectres (lignes rouges pleines, en pointillés courts et en pointillés) indiquent la contribution de la réabsorption et du transfert d'énergie d'excitation électronique (EEET) à l'extinction des émissions

Un autre effet de l'ajout de chlore e₆ à l'hybride PS-PPO-PNIPAM NS est l'apparition de chlore e₆ émission (lors de l'excitation du PS à 250 nm) qui est déplacée vers la région des grandes longueurs d'onde par rapport à celle du chlore libre e₆; l'intensité et le décalage augmentent avec le temps et atteignent la saturation en une heure environ (Fig. 6). Ce décalage indique l'influence de l'environnement PNIPAM sur les molécules liées de chlore e₆ . En parallèle, émission de chlore e₆ lors de l'excitation à sa propre absorption (à 400 nm) n'est que légèrement modifiée en présence de PS-PPO-PNIPAM NS. Avec le petit changement de chlore e₆ absorption (Fig. 4), cela signifie que seule une petite partie du chlore e₆ molécules est lié à PS-PPO-PNIPAM NS.

Spectres de fluorescence du chlore e₆ libre et ajouté à l'hybride PS-PPO-PNIPAM NS (mesuré à 0, 5, 10, 20, 40 et 80 min après l'ajout). Les longueurs d'onde d'excitation sont de 250 et 400 nm ; Un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,2, a été utilisé comme solvant. Les flèches en pointillés courts indiquent les spectres excités à 250 et 400 nm. La flèche pleine indique le temps d'augmentation (t) après l'ajout de chlore e₆ pour les spectres excités à 250 nm

Enfin, la bande PS-PPO apparaît dans le spectre d'excitation du chlore e₆ ajouté à l'hybride PS-PPO-PNIPAM NS (émission à 680 nm, où la contribution du chlore lié au PNIPAM e₆ aux émissions totales de chlore e₆ est proche du maximum). Cette bande est faible au début, mais par la suite, son intensité augmente fortement avec le temps (Fig. 7). En même temps, cette bande PS-PPO est très faible dans le spectre d'excitation du chlore e₆ lors de l'émission à 660 nm (c'est-à-dire au maximum du chlore libre e₆ spectre) même après 100 min après l'ajout de chlore e₆ .

Spectres d'excitation de fluorescence du chlore e₆ libre et ajouté au NS hybride PS-PPO-PNIPAM (mesuré en 0, 10, 80 et 100 min après l'ajout) et au NS hybride PS-PPO-PNIPAM lui-même. Longueurs d'onde d'émission pour le chlore e₆ sont 660 nm (intensité normalisée) et 680 nm. La longueur d'onde d'émission pour PS-PPO-PNIPAM NS est de 380 nm (intensité normalisée). Cinquante millimoles de tampon Tris-HCl, pH 7,2, est utilisé comme solvant

Ainsi, le chlore e₆ se lie à la NS hybride PS-PPO-PNIPAM qui provoque l'EEET de la matrice PS et la PPO encapsulée au chlore e₆ . L'efficacité de l'EEET s'améliore avec le temps (pendant environ une heure après le chlore e₆ addition), indiquant que l'absorption de chlore e₆ par le réseau PNIPAM des NS hybrides PS-PPO-PNIPAM continue pendant cette période. Dans le même temps, une part relativement faible du chlore e₆ présent dans la solution est lié par PNIPAM.

Il convient également de mentionner qu'il a été démontré que les PS-PPO NP émettent la fluorescence de la PPO [14] ou de la porphyrine attachée [13] lorsqu'elles sont excitées par des rayons X. Ainsi, EEET du PS au chlore e₆ observé dans l'hybride PS-PPO-PNIPAM NS sous l'excitation UV du PS signifie que l'énergie des rayons X pourrait également être transférée au chlore e₆ dans la NS étudiée. Dans le même temps, une concentration assez élevée de PS-PPO NP est nécessaire pour l'observation directe de l'émission stimulée par les rayons X de ces NP [13, 14]. L'un des moyens d'augmenter la sensibilité de ces NS aux rayons X pourrait être l'ajout de composants contenant des atomes lourds.

Le PNIPAM est connu pour expérimenter la transition de conformation à LCST égale à 32 °C. Pour le polymère réticulé, la valeur LCST doit être encore plus élevée. Si notre NS hybride PS-PPO-PNIPAM est constituée d'un réseau PNIPAM réticulé entourant les NP PS-PPO, et de chlore e₆ est lié au réseau PNIPAM, on pourrait s'attendre à la diminution de PPO-chlore e₆ distance et donc l'augmentation de l'efficacité EEET lors du chauffage de l'ensemble du NS hybride.

Pour vérifier cette idée, l'effet du chauffage de l'hybride PS-PPO-PNIPAM NS en présence de chlore e₆ sur les spectres d'excitation de fluorescence du chlore e₆ a été étudiée. L'expérience de chauffage a été réalisée trois fois; des tendances similaires ont été démontrées. Les résultats de l'une de ces expériences sont présentés dans les Fig. 8 et 9. Ainsi, la solution d'hybride PS-PPO-PNIPAM NS en présence de chlore e₆ a été porté à la température de 39 °C (cette température doit dépasser la LCST pour le PNIPAM réticulé) ; le chauffage a démarré après l'absorption de chlore e₆ par PS-PPO-PNIPAM hybride NS a atteint la saturation. Pendant le chauffage, le rapport de chlore e₆ intensités de fluorescence (émission à 680 nm) lors d'une excitation à 320 nm (I _ex320; c'est le chlore e₆ émission due au PPO-chlore e₆ EEET) et 404 nm (I _ex404; c'est le chlore e₆ l'émission lors de l'excitation à sa propre bande de Soret) a été étudiée (Figs. 8 et 9); nous pensons que ce rapport reflète l'efficacité du PPO-chlore e₆ EEET. Ainsi, les 3 premières minutes après le début du chauffage, I _ex320 /Je _ex404 diminué de 0,9 à 0,85, peut-être en raison de la diminution du chlore e₆ affinité de liaison -à-PNIPAM lors de l'augmentation de la température. De plus, la valeur de I _ex320 /Je _ex404 Le rapport a augmenté jusqu'à 1,02, ce qui s'est accompagné d'une diffusion accrue de la lumière (Fig. 8 ; la diffusion se manifeste par une augmentation de l'intensité près de 660 nm). Cela pourrait s'expliquer par la transition de conformation dans PNIPAM qui conduit à une réduction du volume du réseau PNIPAM réticulé. Cela provoque la diminution de la distance entre le donneur PS-PPO et le chlore e₆ molécules acceptrices liées au réseau PNIPAM et donc à l'augmentation de l'efficacité de l'EEET.

Spectres d'excitation de fluorescence (normalisés à 404 nm) du chlore e₆ ajouté à l'hybride PS-PPO-PNIPAM NS à 23 °C (ligne noire) et à 39 °C (en 14 min après la mise en marche du chauffage ; ligne rouge). Longueur d'onde d'émission 680 nm ; Un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7.2, a été utilisé comme solvant

La dépendance du temps après le chauffage à 39 °C a été activée du rapport de l'intensité d'émission de chlore e₆ ajouté à l'hybride PS-PPO-PNIPAM NS à 680 nm lors d'une excitation à 320 nm (absorption par PPO avec EEET supplémentaire au chlore e₆ ) à celle lors de l'excitation à 404 nm (excitation directe du chlore e₆ ). Les barres d'erreur tiennent compte du bruit des spectres d'excitation enregistrés

En résumé, les procédés en solution d'hybride PS-PPO-PNIPAM NS en présence de chlore e₆ l'addition pourrait être décrite comme suit. Tout d'abord, l'ajout de chlore e₆ à la solution d'hybride PS-PPO-PNIPAM NS en tampon (Fig. 10, procédé 1) entraîne la pénétration de la petite partie du chlore e₆ dans le réseau PNIPAM de la SN hybride; cela a abouti à l'EEET du PS et du PPO au chlore e₆ . Une telle pénétration se déroule pendant environ une heure accompagnée d'une augmentation de l'efficacité de l'EEET (Fig. 10, processus 2). Un chauffage supplémentaire de l'échantillon à la température dépassant la LCST entraîne la transition de conformation du réseau PNIPAM qui conduit à la diminution de la distance entre le PS-PPO et le chlore e₆ molécules, et donc à une augmentation encore plus élevée de PS-PPO-à-chlore e₆ Efficacité de l'EEET (Fig. 10, processus 3).

Schéma proposé des procédés dans la solution d'hybride PS-PPO-PNIPAM NS en présence de chlore e₆ après ajout de chlore e₆ (processus 1), passage d'environ 1 h (processus 2) et chauffage supplémentaire de 23 à 39 °C (processus 3)

Conclusions

L'étude de fluorescence a révélé l'absorption de chlore e₆ par NS hybride PS-PPO-PNIPAM ainsi que transfert d'énergie d'excitation électronique de la matrice PS via PPO encapsulé au chlore e₆; l'absorption a atteint la saturation en une heure environ.

Chauffage du PS-PPO-PNIPAM-chlore e₆ NS de 21 à 39 °C améliore l'efficacité de l'EEET ; ceci est cohérent avec la transition de conformation PNIPAM qui réduit la distance entre les donneurs PS-PPO et le chlore e₆ accepteurs.

Pendant ce temps, une partie relativement faible du chlore e₆ présent dans la solution est lié au PNIPAM ; ainsi, d'autres études dans ce sens sont nécessaires.

Abréviations

EEET :

Transfert d'énergie d'excitation électronique

LCST :

Abaisser la température critique de la solution

NS :

Nanosystème

PNIPAM :

Poly-N-isopropylacrylamide

OPP :

Diphényloxazole

PS :

Polystyrène

TEM :

Microscopie électronique à transmission