Agents théranostiques de nouvelle génération basés sur des microcapsules polyélectrolytiques codées avec des nanocristaux semi-conducteurs :développement et caractérisation fonctionnelle

Contexte

L'utilisation de microcapsules polyélectrolytiques comme véhicules pour l'administration ciblée et la libération contrôlée de médicaments et d'agents de contraste et comme sondes fluorescentes pour l'imagerie in vitro et in vivo est une voie de recherche prometteuse en médecine translationnelle et une approche personnalisée du diagnostic et du traitement de diverses maladies humaines. 1,2,3,4].

Le développement d'agents théranostiques combinant les fonctions de médicaments et d'outils d'imagerie de biomarqueurs permettant un diagnostic précoce de diverses maladies est une tâche importante dans le domaine de la conception de systèmes d'administration de médicaments [5, 6]. Les systèmes basés sur des microcapsules polyélectrolytiques sont des candidats prometteurs pour combiner les deux fonctions. Les conditions de leur fabrication permettent l'incorporation de substances biologiquement actives, de nanoparticules métalliques, de marqueurs fluorescents, etc. dans les microcapsules [7,8,9]. Fichier supplémentaire 1 :La figure S1 montre schématiquement un agent théranostique typique à base de microcapsules de polyélectrolyte.

Une des méthodes efficaces pour obtenir des microcapsules de polyélectrolyte consiste à appliquer successivement des couches de polymères de charges opposées sur un substrat de forme sphérique ou autre, qui est ensuite retiré [10, 11]. L'interaction du polycation de charge opposée et du polyanion à un pH, une force ionique et une température de la solution et la polarité du solvant spécifiés donnent un complexe interpolymère sous la forme d'une membrane ou d'une coque recouvrant le substrat [12,13,14].

Les facteurs énumérés ci-dessus affectent également la morphologie des microcapsules résultantes, y compris leur porosité et leur forme et l'intégrité de la paroi. Par exemple, une augmentation de la force ionique ou du pH de l'environnement des microcapsules de polyélectrolyte facilite les changements de conformation ou la protonation/déprotonation des polyélectrolytes formant la paroi de la capsule. Ceci, à son tour, conduit à sa déformation et à l'augmentation de la porosité jusqu'au degré de perte d'intégrité structurelle et de transition vers l'état « ouvert » suivi de la libération du contenu interne des capsules et des composants incrustés dans leurs parois dans le microenvironnement [15, 16]. Ces propriétés font des microcapsules de polyélectrolytes de bons candidats pour le rôle de systèmes d'administration sensibles aux stimuli et une base prometteuse pour la conception d'agents théranostiques [2, 17, 18].

Les points quantiques (QD) sont des nanocristaux semi-conducteurs fluorescents de 2 à 10 nm de diamètre caractérisés par un large spectre d'absorption et un spectre de fluorescence étroit et symétrique. Cela permet d'exciter des QD avec différents maxima de fluorescence à partir d'une seule source de rayonnement, offrant la possibilité de leur large utilisation en tant que fluorophores, en particulier pour l'imagerie multiplexée [19, 20]. Une photostabilité élevée et une fluorescence brillante des QD déterminent leur avantage par rapport aux fluorophores organiques standard dans les applications de détection [21,22,23,24].

Des études publiées antérieurement consacrées au développement de microcapsules polyélectrolytiques polymères fluorescentes démontrent une approche typique des colorants fluorescents organiques classiques ou de la formation in situ de points de carbone sous carbonisation hydrothermale et de la conversion du dextrane en nanoparticules de carbone luminescentes en piégeage de la coque polyélectrolyte dans la structure polymère des microcapsules polyélectrolytes préparées primaires . L'approche de piégeage de colorant organique est basée sur la diffusion des colorants isothiocyanate de fluorescéine ou rhodamine B, tétraméthylrhodamine conjugués avec du dextrane de bas poids moléculaire ou de l'albumine de sérum bovin (BSA) dans la structure poreuse de la membrane formée par des polyélectrolytes qui entraîne une charge de colorant fluorescent de toute la structure de la microcapsule polyélectrolyte comme dans le creux intérieur et comme dans la membrane polymérique. La nécessité d'un traitement thermique élevé dans le cas de microcapsules codées par des points de carbone modifie la flexibilité de la structure des microcapsules et la rend plus rigide, ce qui n'est pas indésirable en cas de développement de systèmes théranostiques sensibles aux stimuli du pH et de la force ionique [25,26,27, 28,29,30].

Dans cette étude, nous décrivons tous les aspects technologiques de la fabrication de microcapsules polymères codées avec les QD hydrosolubles hautement fluorescents, possédant une stabilité colloïdale significative, décrivons leurs propriétés physico-chimiques et fonctionnelles et démontrons leur application à l'imagerie des cellules vivantes et à la visualisation des microcapsules. transport et livraison au sein des cellules vivantes. Les données peuvent ouvrir la voie à la prochaine étape du développement de la prochaine génération d'agents théranostiques basés sur les microcapsules multifonctionnelles fonctionnalisées.

Expérimental

Solubilisation et caractérisation des points quantiques

CdSe/ZnS core/shell QDs avec un maximum de fluorescence λ_max égal à 590 nm ont été aimablement fournis par le Dr Pavel Samokhvalov (Laboratoire de nano-bio-ingénierie, Université nationale de recherche nucléaire MEPhI (Institut de génie physique de Moscou), Moscou, Russie).

Les QD fraîchement synthétisés étaient recouverts d'oxyde de trioctylphosphine (TOPO) et étaient insolubles dans l'eau. Leur transfert dans la phase aqueuse a été effectué en substituant la d,l-cystéine à TOPO et en remplaçant ensuite la d,l-cystéine par 12- unitaire dérivé de PEG contenant des groupes terminaux thiol et carboxyle HS−(PEG)₁₂ −COOH (Thermo Fisher Scientific, USA) comme décrit précédemment [22, 31, 32]. À cette fin, un échantillon de QDs a été dissous dans 800 μl de chloroforme, après quoi 1200 μl de méthanol ont été ajoutés, et le mélange a été centrifugé pendant 5 min. La procédure a été répétée trois fois. Ensuite, le culot QD a été remis en suspension dans 800 μl de chloroforme. Une solution de d,l-cystéine dans du méthanol a été ajoutée à la suspension avec un rapport pondéral QD à d,l-cystéine de 1:0,13, et le mélange a été centrifugé à 16 873g pendant 10 min (Centrifuge 5418, Eppendorf, États-Unis). Le culot QD a été lavé de l'excès de d,l-cystéine avec du méthanol au moyen d'une centrifugation pendant 3 minutes à la même vitesse. Le culot QD a été séché dans un concentrateur centrifuge Concentrator Plus (Eppendorf, USA) pendant 2 min. Les QD séchés ont été mis en suspension dans 650 μl d'hydroxyde de sodium 0,1 M et soniqués pendant 10 min dans un bain à ultrasons Elma Sonic P30H (Elma Schmidbauer, Allemagne). Ensuite, la solution a été centrifugée à 5509g pendant 10 min, et le surnageant a été filtré à travers un filtre Millipore avec une taille de pores de 0,22 μm (Merck, Allemagne). Le contenu QD des échantillons a été déterminé par spectrophotométrie à la longueur d'onde du premier pic d'absorption d'excitons.

Les échantillons QD hydrosolubles obtenus ont été stabilisés en ajoutant du HS−(PEG)₁₂ −COOH à un rapport molaire du dérivé QD sur PEG de 1:4,6 et incubation du mélange à 2-8 °C pendant 24 à 48 h.

Synthèse de microparticules de carbonate de calcium

Des microparticules de carbonate de calcium ont été obtenues comme décrit ailleurs [33, 34]. Quinze ml de 0,33 M Na₂ CO₃ (Sigma-Aldrich, Allemagne) solution a été ajoutée à 15 ml d'un 0,33 M СаСl₂ (Sigma-Aldrich, Allemagne) solution sous agitation. Le mélange réactionnel a été agité à des vitesses de 250, 500 et 750 tr/min sur un agitateur magnétique RCT Basic (IKA, Allemagne) à température ambiante pendant 15 à 60 s. Le аСl₂ et Na₂ CO₃ les solutions ont été préalablement filtrées à travers des filtres avec une taille de pores de 0,22 μm.

Après cela, l'agitation a été arrêtée et le mélange réactionnel a été incubé pendant 10 minutes. Le mélange a été lavé avec de l'eau MilliQ en alternant remise en suspension et centrifugation à 452g pendant 5 min à l'aide d'une Centrifuge 5810 (Eppendorf, USA). Les microparticules obtenues ont été lavées quatre fois. Après le dernier lavage, le culot a été séché dans une étuve à 60 °C pendant 90 min.

Préparation de microcapsules de polyélectrolyte codées avec des points quantiques

Les microparticules ont été codées avec des QD en utilisant une technique modifiée de dépôt couche par couche de polymères de charges opposées [31, 35] et de QD hydrosolubles carboxylés sur des microparticules de carbonate de calcium préparées, qui ont servi de matrice. Les couches de polyélectrolyte étaient constituées de couples de polymères :le polycation poly(chlorhydrate d'allylamine) (PAH) de Mw ≈ 15 000 Da (Sigma-Aldrich, USA) et le polyanion poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS) de Mw ≈ 70 000 Da ( Sigma-Aldrich, États-Unis).

Les calques ont été appliqués dans l'ordre suivant :СаСО₃ /PAH/PSS/PAH/PSS/PAH/QD-S-(PEG)₁₂ -COOH/HAP/PSS/HAP/SPS/HAP/SPS.

Un échantillon de microparticules séchées a été remis en suspension dans 0,5 ml d'eau MilliQ et soniqué dans un bain à ultrasons pendant 10 min. Une aliquote de 0,5 ml de solution de HAP à 2 mg/ml dans 0,5 M de NaCl a été ajoutée à la suspension contenant 3,7  × 10 ⁸ microparticules de carbonate de calcium dans l'eau MilliQ. La suspension a été soniquée dans un bain à ultrasons pendant 60 s puis incubée pendant 20 min sous agitation. Après cela, la suspension de microparticules a été lavée de l'excès de polymère par centrifugation à 1054g pendant 5 min suivi d'une remise en suspension dans de l'eau MilliQ. Le lavage des microparticules de carbonate de calcium après la stratification du polycation a été répété trois fois. Pour l'application de la couche suivante (polyanionique), les microparticules ont été préalablement remises en suspension dans 0,5 ml d'eau MilliQ ; la suspension a été mélangée avec 0,5 ml d'une solution de PSS à 2 mg/ml dans 0,5 M de NaCl, soniquée dans un bain à ultrasons pendant 60 s, incubée pendant 20 min sous agitation, puis lavée de l'excès de polymère comme décrit ci-dessus.

Cinq couches de polyélectrolyte, la couche externe constituée de PAH, ont été appliquées sur les particules de carbonate de calcium avant le codage. De 0,10 à 2,24 mg de QD ont été ajoutés à la suspension des microparticules. Le mélange a été incubé pendant 80 min sous agitation puis lavé trois fois par centrifugation comme décrit ci-dessus. Après cela, des couches successives de polymères de charges opposées ont été appliquées. Les microparticules encodées ont été conservées à +  4 °C dans l'obscurité.

Pour obtenir des microcapsules de polyélectrolyte codées QD, le noyau de carbonate de calcium a été retiré des microparticules. A cet effet, après centrifugation, le culot de microparticules codées QD a été remis en suspension dans 2 ml d'éthylènediaminetétraacétate disodique (EDTA) 0,2 M (pH 6,5), et la suspension a été incubée pendant 15 min. Pour garantir la dissolution du noyau de carbonate de calcium, nous avons répété cette procédure deux fois de plus, en remplaçant à chaque fois la solution par une nouvelle aliquote d'EDTA 0,2 M (pH 6,5) après une centrifugation de 5 min de l'échantillon à 2152g . Ensuite, la suspension de microcapsules codées QD a été lavée de l'excès d'EDTA quatre fois par remise en suspension dans de l'eau MilliQ et centrifugation dans les conditions spécifiées ci-dessus. Les microcapsules de polyélectrolyte résultantes ont été conservées à +  4 °C dans l'obscurité.

Lors de l'étude de l'interaction des microcapsules polyélectrolytiques codées QD avec les cellules, nous avons modifié la surface de la microcapsule avec de la BSA (fraction de choc thermique, sans protéase, faible teneur en endotoxines, adaptée à la culture cellulaire, pH 7,  98 % ; Sigma-Aldrich, États-Unis) . En bref, les microparticules codées avec une couche supérieure de polycation ont été en outre recouvertes d'un polyanion acide polyacrylique (PAA) avec Mw 15 000 Da (Sigma-Aldrich, USA), et le noyau a été retiré comme décrit ci-dessus. Après le dernier lavage, les microcapsules ont été dispersées dans une solution de tampon phosphate 50 mM (pH 7,4) contenant 1% de BSA et incubées à + 4 °C dans l'obscurité. Avant utilisation, les microcapsules ont été lavées de l'excès de BSA avec une solution tampon phosphate 50 mM (pH 7.4).

Caractérisation des points quantiques, des microparticules et des microcapsules polyélectrolytiques codées avec des points quantiques

Étude de taille et de charge

Le diamètre hydrodynamique des QD solubilisés, des microparticules codées par QD recouvertes de coques polymères et des microcapsules de polyélectrolytes codées par QD ont été déterminés par la méthode de diffusion dynamique de la lumière ; la charge de surface a été estimée à partir de leur mobilité électrophorétique en utilisant l'effet Doppler au moyen d'un Zetasizer NanoZS (Malvern, UK).

Analyse de fluorescence

Les durées de vie de fluorescence (cinétique de décroissance de la fluorescence) des QD solubilisés, des microparticules codées QD recouvertes de coques polymères et des microcapsules de polyélectrolyte codées QD ont été mesurées à la longueur d'onde du maximum de fluorescence. La deuxième harmonique d'un YAG:Nd ³⁺ un laser avec une longueur d'impulsion de 350 ps et une fréquence d'impulsion de 50 Hz a été utilisé comme source d'excitation. Le signal a été détecté par un détecteur photomultiplicateur connecté à un oscillographe DPO 3054 (Tektronix, USA) avec une résolution temporelle de 2 ns. Les suspensions de microparticules et de microcapsules codées QD ont été agitées en permanence pendant les mesures au moyen d'un agitateur magnétique MIXcontrol eco (2mag, Allemagne) pour empêcher la sédimentation de l'échantillon.

Estimation de l'efficacité d'encodage

L'efficacité de codage a été estimée à partir de la teneur en QD du surnageant après l'application (adsorption) de QD sur la surface des microparticules. La quantité de QD adsorbés sur la surface des microparticules (\( {Q}_{{\mathrm{QD}}_{\mathrm{abs}}} \)) a été calculée comme

où \( {Q}_{{\mathrm{QD}}_0} \) est la quantité initiale de QD dans l'aliquote utilisée pour l'encodage, et \( {Q}_{{\mathrm{QD}}_i} \ ) est la quantité de QD dans le surnageant du i e échantillon.

Le contenu QD des échantillons a été déterminé par spectrophotométrie à l'aide d'un lecteur de plaques multimode Infinite 200 PRO (Tecan, Suisse).

Microscopie électronique à balayage

Des microphotographies électroniques des microparticules de carbonate de calcium ont été obtenues en utilisant un microscope électronique à balayage JSM-7001F (JEOL, Japon) équipé d'une cathode Schottky. La poudre de microparticules séchées a été appliquée sur un ruban adhésif en carbone conducteur et balayée à une moyenne de 50, un courant de faisceau de 20 pA et une tension d'accélération de 15 à 30 kV.

Pour obtenir des microphotographies des microparticules recouvertes de couches de polyélectrolytes, une goutte d'une suspension de microparticules diluée contenant ~ 10 ⁶ des microparticules par 0,5 ml ont été placées sur un substrat de silicium préalablement purifié et séchées à température ambiante. Les échantillons résultants ont été scannés à une moyenne de 50, un courant de faisceau de 20 pA et une tension d'accélération de 3 à 30 kV.

Fluorescence et microscopie confocale

La morphologie et la distribution de taille des microparticules codées QD ont été analysées au moyen d'une microscopie à fluorescence en utilisant un microscope Carl Zeiss Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Allemagne) équipé d'un filtre d'émission de fluorescence Texas Red ; Une solution aqueuse à 20 % de glycérol a été utilisée comme support de montage de lames.

Les échantillons de microcapsules codées QD ont également été étudiés à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Allemagne) équipé de lasers pour l'excitation 405, 458, 476, 488, 496, 514, 561 et 633 nm et Leica LAS Logiciel AF version 2.7.3.9723. L'analyse a été menée à la longueur d'onde d'excitation de 488 nm et à un ensemble de filtres collecteurs couvrant la plage d'émission de 555 à 620 nm à l'aide d'un objectif Leica HCX PL APO CS 63×/1,20 CORR WATER. Une solution à vingt pour cent de glycérol dans un tampon PBS pH 7,4 a été utilisée comme support de montage de lames. Le logiciel Image J 1.51 (États-Unis) a été utilisé pour l'analyse et le traitement des images.

Capture de microcapsules de polyélectrolyte codées avec des points quantiques par des cellules vivantes in vitro

La lignée cellulaire de macrophages alvéolaires de souris immortalisés MH-S (ATCC, USA) a été maintenue dans un milieu RPMI supplémenté avec 10 % de FCS, 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol et 2,06 mM de glutamine dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ et 37°C. Les cellules MH-S cultivées jusqu'à 3×10 ⁶ cellules en coupelles μ de 35 mm et 1,2×10 ⁶ des microcapsules de polyélectrolyte codées QD recouvertes de BSA ont été ajoutées à chaque boîte . Les cellules ont ensuite été incubées à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 4 et 24 h respectivement. Ensuite, les noyaux cellulaires ont été contre-colorés à l'aide de la sonde fluorescente DRAQ5 (longueurs d'onde ex/em 646/697 nm, ThermoFisher, États-Unis) pendant 30 min, puis les échantillons de cellules ont été lavés et analysés à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Allemagne ). Les images de l'absorption cellulaire des microcapsules de polyélectrolyte codées QD ont été acquises à l'aide de HCX PL APO CS 63,0 × 1,30 GLYC/OIL, HCX PL APO lambda blue 40,0 × 1,25 OIL. La fluorescence des QD a été excitée à 488 nm et l'émission a été collectée à 555-620 nm, tandis que la fluorescence des noyaux cellulaires contre-colorés avec DRAQ5 a été excitée à 633 nm et l'émission collectée à 650-750 nm.

Analyse statistique

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide des logiciels MS Office Excel 2007 et Origin Pro 2015. Toutes les données sont présentées sous forme de moyennes et d'écarts types en utilisant les résultats d'au moins trois expériences indépendantes.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation de microparticules de carbonate de calcium

L'utilisation de cristaux inorganiques sphériques, en particulier de microsphérolites de carbonate de calcium, comme substrat est déterminée par leur biocompatibilité, ainsi que la possibilité de leur élimination au cours de la formation de microcapsules polyélectrolytiques sans utiliser de solvants agressifs pour les systèmes vivants. Les microparticules de carbonate de calcium en soi peuvent également être utilisées comme système d'administration de médicaments à libération modifiée ou prolongée, servant de matrice pour charger les médicaments et contrôler leur libération dans le microenvironnement, c'est-à-dire qu'elles ont de multiples utilisations potentielles dans les systèmes d'administration [36,37 ,38,39,40,41,42,43,44,45,46].

Les facteurs clés déterminant la taille et la forme des microcristaux sont la vitesse et la durée d'agitation et le temps d'incubation du mélange réactionnel [33, 41]. Nous avons déterminé expérimentalement les conditions d'obtention de microsphérolites de carbonate de calcium avec une distribution de taille optimale. CaCO₃ unique les microparticules se sont avérées avoir une forme arrondie presque régulière. Fichier supplémentaire 1 :La figure S2 montre les distributions de taille des microparticules de carbonate de calcium obtenues à différentes vitesses d'agitation. Comme on le voit à partir de ces données, l'hétérogénéité de taille des particules augmente avec l'augmentation de la vitesse d'agitation. Si la vitesse d'agitation était de 250 tr/min, la taille des particules obtenues variait de 4,0 à 6,0 µm. Dans ce cas, toutes les microparticules de l'échantillon étaient séparées et leur distribution de taille était proche de la normale (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2a). Cependant, si le mélange était agité à 500 tr/min, nous observions des particules de forme irrégulière qui étaient des agrégats de particules plus petites, la taille moyenne des particules individuelles variant de 2,7 à 5,6 μm (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2b). À une vitesse d'agitation de 750 tr/min, la dispersion de la taille des particules a été augmentée. Cet échantillon contenait également des agrégats de forme irrégulière, la taille moyenne des microparticules individuelles étant comprise entre 3,8 et 5,7 μm (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2c).

Ainsi, l'agitation du mélange réactionnel à une vitesse de 250 tr/min a permis d'obtenir des particules avec une distribution granulométrique optimale et une forme presque régulière et a empêché les agrégations de particules. Par conséquent, nous avons estimé l'effet de la durée d'agitation sur la distribution de la taille des microparticules à cette vitesse d'agitation (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3). L'agitation du mélange réactionnel pendant 15 s a donné un nombre accru de particules plus grosses par rapport à une agitation de 30 s. Une augmentation de la durée d'agitation à 60 s a eu un effet similaire. C'est-à-dire que la durée d'agitation était insuffisante dans le premier cas (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3a) et excessive dans le dernier cas (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3c). Ainsi, nous avons considéré que la vitesse de 250 tr/min et la durée de 30 s étaient des conditions optimales d'agitation.

Selon les données de microscopie électronique à balayage (MEB), la surface des microparticules de carbonate de calcium était hétérogène, caractérisée par une porosité (Fig. 1a). À un grossissement de × 40 000, on pouvait voir que les microparticules étaient, à leur tour, formées de particules submicrométriques plus petites (Fig. 1b). Ainsi, les microparticules obtenues avaient une structure poreuse et représentaient des matrices qui non seulement conviennent comme substrats, mais peuvent également être utilisées en soi comme systèmes de délivrance et en raison de leur structure de surface particulière peuvent être facilement utilisées comme matrice pour couche par couche dépôt de polymère.

Microphotographies électroniques à balayage de microparticules de carbonate de calcium (a ) et leur surface à plus fort grossissement (b )

Préparation et caractérisation de microcapsules de polyélectrolyte codées avec des points quantiques

Les QD hydrosolubles préparés étaient caractérisés par un large spectre d'absorption et un spectre de fluorescence étroit avec une émission maximale de 590 nm (Fig. 2). Le diamètre hydrodynamique de ces échantillons QD variait de 23,96 à 28,2 nm. Fichier supplémentaire 1 :la figure S4 montre la distribution de la taille des QD stabilisés avec HS−(PEG)₁₂ -COOH. La modification de la surface QD avec HS−(PEG)₁₂ −COOH a assuré la stabilité des QD dans la phase aqueuse, ainsi que la charge négative de surface suffisante pour l'adsorption efficace des QD entre les couches de polyélectrolyte chargées positivement pendant la procédure de codage [22, 47].

Caractéristiques optiques des points quantiques cœur/coquille CdSe/ZnS solubilisés avec HS−(PEG)₁₂ −Ligands COOH

Les valeurs de charge de surface mesurées des échantillons de microparticules de carbonate de calcium au cours de chaque étape de dépôt des couches de polyélectrolyte et des QD (tableau 1) ont confirmé que la charge de surface de la matrice d'origine, les QD solubilisés, ainsi que la recharge de surface après chaque dépôt de polymères sont suffisantes pour l'absorption efficace de chaque couche suivante.

La charge de surface intrinsèque et la structure de surface poreuse des microparticules de carbonate de calcium synthétique leur ont permis d'être utilisées comme matrice pour le polyélectrolyte de charge opposée et le dépôt QD (Fig. 3). L'application de polymères PAH et PSS dans des microcapsules polymères polyélectrolytiques codées par QD est déterminée par leur biocompatibilité et leur non-toxicité ainsi que par leur non-biodégradabilité qui aide en outre à conserver les QD dans la coque. La biodégradabilité de la poly-l-arginine, de la poly-l-lysine, du chitosane, du sel de sodium de l'acide alginique et du sulfate de dextrane, qui sont également largement utilisés dans la formation de microcapsules de polyélectrolyte, induira la diffusion QD hors de la membrane polymère qui devrait entraîner une diminution des propriétés fluorescentes des microparticules [3, 11, 39, 48,49,50,51,52]. Le polycation PAH et le polyanion PSS utilisés dans cette étude contiennent respectivement des groupements amine et sulfate assurant une interaction électrostatique entre les couches polymères, ce qui entraîne la formation de complexes interpolymères [16, 25, 36, 37]. Le choix de la première couche de polymère a été déterminé par la valeur de charge de surface des microparticules de carbonate de calcium synthétisées.

Mode opératoire de préparation de microcapsules codées par des points quantiques :formation des couches du polycation (1) et du polyanion (2), les polyélectrolytes PAH et PSS, respectivement, à la surface de la matrice; codage des microparticules résultantes avec des points quantiques et dépôt supplémentaire de polymères couche par couche (3) ; élimination du noyau de carbonate de calcium (4)

La figure 4 montre des images SEM des étapes de formation de la coque polymère à la surface du substrat. Comme on le voit sur les microphotographies, les microparticules contenaient un noyau de grains de carbonate de calcium et une enveloppe, qui devenaient plus distinctes avec l'augmentation du nombre de couches de polymère adsorbées. La surface des microparticules recouvertes des couches de polyélectrolyte suivait la forme du substrat avec son homogénéité caractéristique, ce qui suggérait qu'il était également poreux (Fig. 4a, b) [44]. Au fur et à mesure que la coque en polymère devenait plus épaisse, la surface des microparticules devenait plus uniforme et plus lisse (Fig. 4c, d).

Images de microscopie électronique à balayage de microparticules de carbonate de calcium après application de quatre (a , b ) et dix (c , d ) couches de polyélectrolyte

L'étape finale de préparation des microcapsules polyélectrolytiques codées QD comprenait l'élimination du noyau de carbonate de calcium et la formation de la structure ultime des microcapsules. Pour dissoudre la matrice constituée de grains de carbonate de calcium, les microparticules ont été lavées avec de l'EDTA. L'EDTA a été utilisé principalement parce qu'il forme des complexes hydrosolubles lors de l'interaction avec des sels de métaux divalents, y compris le calcium, et son faible poids moléculaire assure la perméabilité de l'enveloppe polyélectrolytique pour l'EDTA et sa complexation avec Ca ²⁺ . Cela conduit à la dissolution du noyau des particules de polyélectrolyte et à la formation d'une structure creuse [45, 46].

Les microparticules codées QD et les microcapsules polyélectrolytiques obtenues dans notre étude avaient une forme sphérique ou presque sphérique et une taille de 3,8 à 6,5 μm (Fig. 5). L'analyse de la morphologie et de la structure des microparticules et des microcapsules en mode fluorescent a montré des cavités dans les microcapsules de polyélectrolyte, comme en témoigne leur plus grande transparence par rapport aux microparticules (Fig. 5b). Cela a démontré que la procédure de dissolution du noyau avec EDTA était efficace. Les données de microscopie confocale ont également montré la structure creuse des microcapsules de polyélectrolyte fluorescentes obtenues (Fig. 6). Ces microcapsules pourraient être distinguées comme des particules simples (Fig. 6a, b) qui peuvent être caractérisées comme des particules sphériques à surface rugueuse en raison de leur modification de surface par revêtement BSA.

Images de microscopie à fluorescence de microparticules de carbonate de calcium recouvertes de polyélectrolyte et codées avec une boîte quantique (a ) et des microcapsules polyélectrolytiques obtenues à partir de celles-ci (b )

Images de microscopie confocale des microcapsules polyélectrolytiques codées par des points quantiques et revêtues par BSA :coupes transversales des microcapsules (a ); Projection 3D d'une seule microcapsule polyélectrolyte (b )

Estimation de l'efficacité de l'encodage

L'efficacité du codage a été estimée par la quantité de QD adsorbés sur la surface polymère chargée positivement de la microparticule. L'estimation des quantités de QD dans la solution originale utilisée pour le codage des microparticules et dans le surnageant avant et après l'incubation des microparticules avec la solution QD a montré que le nombre de QD liés à la surface des microparticules augmentait linéairement avec l'augmentation de la teneur en QD dans le mélange réactionnel de 0,36 à 2,241 mg (Fig. 7a). Further increase in the amount of QDs in the solution led to a decrease in the number of adsorbed QDs. This may have resulted from an insufficient density of the positive charge determined by amine groups of PAH on the microparticle surface because of an excessive amount of QDs and the resultant saturation of the surface with them. Apparently, the QDs were adsorbed more efficiently if their amount was smaller than 2.241 mg owing to sterically favorable conditions and less interference with one another’s attachment. The pattern of the dependence of the encoding efficiency on the QD content of the solution used for the encoding agrees with our earlier data [22].

Estimation of the efficiency of encoding of microparticles with different amounts of quantum dots (a ) and their fluorescence characteristics (b ). Asterisk indicates significant difference of QD-encoded microbeads from the QD-encoded microcapsules (p  < 0.05)

Estimation of the optical characteristics of the obtained polyelectrolyte microcapsules is an essential stage of the assessment of encoding efficiency. Its results show how suitable the given technique is for fabrication of imaging agents based on QD-encoded polyelectrolyte microcapsules.

Figure 7b shows the fluorescence intensities of the microparticles and microcapsules measured as the mean normalized intensity of gray color as dependent on the amount of QDs used for encoding them. As seen from the figure, the fluorescence intensity of the encoded microparticles was higher than that of the microcapsules obtained from them. At the same time, the microcapsules encoded with different amounts of QDs did not differ significantly from one another in fluorescence intensity (p> 0,05). Despite some decrease in the fluorescence intensity of the microcapsules, their encoding with the amount of QDs indicated above ensures a contrast sufficient for effective imaging.

Quantum Dot Fluorescence Lifetime within Encoded Polyelectrolyte Microcapsules

As noted above, the fluorescence intensity of the polyelectrolyte microcapsules was decreased compared to the microparticles used for their fabrication and encoded with the same QDs. Therefore, we have estimated the fluorescence lifetimes of both the original QDs and the same QDs embedded in the microparticles or the polymeric walls of the microcapsules.

The QD fluorescence kinetic curves (Fig. 8) are characterized by monoexponential dependence of fluorescent intensity on time according to the following equation:

Fluorescence lifetimes of the solubilized CdSe/ZnS quantum dots with a fluorescence peak at 590 nm incorporated in the fabricated microparticles and microcapsules

où je (t ) is the intensity of QD fluorescence in response to excitation pulses and A ₁ , х , and t ₁ are parameters describing the change in the intensity with time.

We determined the fluorescence lifetime for each sample (Table 2). The original solubilized QDs had the longest fluorescence lifetime; it was decreased after the QDs were adsorbed onto the microparticles and incorporated into the structure of the polymer shell. This may have resulted from interaction between the QDs and PAH, as we found earlier [22]. In the case of microcapsules, the QD fluorescence lifetime tended to further decrease compared to the QDs within the microparticles from which the microcapsules were fabricated. A possible cause of this decrease was a technological factor entailed in the fabrication of microcapsules, namely, the dissolution of the core and the related increase in the necessary number of washings.

It should be noted, that the fluorescence lifetime also tended to decrease with time after the microcapsule fabrication. However, since 48 h after the microcapsule fabrication, further changes in the mean fluorescence lifetime were insignificant. The fluorescence decay was apparently caused by a decrease in the fluorescence quantum yield of QD embedded in the shells of the capsules. This effect is likely to have resulted from the change in the distribution of the electron potential and the geometric rearrangement of QDs in the inner layers of the polymer shell after the core removal that increased the probability of nonradiative recombination due to the charge transfer to between neighboring QDs or between QDs and polymer molecules [22].

Interaction of Quantum Dot- Encoded Polyelectrolyte Microcapsules with Phagocytic Cells In Vitro

We used confocal microscopy to analyze the interaction of QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with live phagocytic cells, their uptake by cells, and the possibility of cell labeling. The murine alveolar macrophage (MH-S) cells were used as a model, because of the capability of these cells to phagocytize xenogenic objects.

The MH-S cells were treated with approximately 1.2×10 ⁶ of QD-encoded microcapsules by short-term (4 h) or long-term (24 h) incubations. We observed signs of primary uptake of the microcapsules in both cases:after the short- and (Fig. 9a–d) long-term incubation (Fig. 9e–h). Polyelectrolyte microcapsules or their conglomerates could be seen in green color. The microcapsules could be clearly distinguished both in the external environment of cells and inside the MH-S cells that could be evidenced by the distance between the microcapsules and nuclei of the MH-S cells which were stained by far-red DNA stain DRAQ5 and can be seen as red spherical shaped objects at all the microphotographs. As individual microcapsules and as their conglomerates were detected to undergo the uptake process. The fact that microcapsules were located in internal cell environment or at least attached to the surface of the macrophages is confirmed by clearly distinguished short distances between the nuclei and the polyelectrolyte microcapsules (Fig. 9b, d, g, h). In Fig. 9g, residually stained boundaries of the macrophage cytoplasmic membranes are distinctly seen, which indicates effective uptake, and well-discernible microcapsules are easy to detect to be attached on their surface either within the cells.

Confocal images of the MH-S cells treated with the QD-encoded polyelectrolyte microcapsules coated with BSA. The upper row shows the images of the samples after 4 h of short-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (a –d ). The lower row demonstrates the images of the samples after 24 h of long-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (e –h ). The nuclei of the macrophages were counterstained with far-red DNA stain DRAQ5

During the short-term incubation, single microcapsules were found to be phagocytized by MH-S cells prior to conglomerates of the microparticles. While after long-term incubation (24 h), the amount of the conglomerates of the polyelectrolyte microcapsules undergoing the uptake process and located inside cells or at least attached to the cell surface was more significant than after short-term incubation. Thus, the polyelectrolyte microcapsules obtained in this study used as promising tools for imaging and tracking of live cells.

Conclusions

Our study has demonstrated the feasibility of fabrication of stable QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with optimized fluorescence characteristics and a narrow size distribution. The technique for incorporation of water-soluble and stabilized with three-functional polyethylene glycol derivatives core/shell QDs into the polymer wall of the microcapsules and detailed characterization at each stage of experimental procedure ensured efficient fluorescent encoding of microcapsules. The efficient intracellular uptake of developed QD-encoded microcapsules by murine macrophages was demonstrated, thus confirming the possibility of efficient use of developed system for live cell imaging and visualization of microcapsules transportation and delivery within the living cells.

Abréviations

EDTA:

Disodium ethylenediaminetetraacetat

PAA:

Polyacrylic acid

PAH:

Polycation poly(allylamine hydrochloride)

PEG:

Polyethylene glycol

PSS :

Polyanion poly(sodium 4-styrenesulfonate)

QD :

Point quantique

RPMI medium:

Roswell Park Memorial Institute medium

SEM :

Microscopie électronique à balayage

TOPO :

Oxyde de trioctylphosphine