Examen des rôles de la taille des gouttelettes d'émulsion et du tensioactif dans le processus de fabrication basé sur l'instabilité interfaciale des nanocristaux micellaires

Contexte

Le potentiel d'application de nanomatériaux, tels que les nanocristaux semi-conducteurs fluorescents (points quantiques, QD) [1,2,3], les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPION) [4,5,6] et les nanoparticules d'or [7,8,9] , pour la détection biomédicale, l'imagerie et la thérapie sont bien établies après près de deux décennies de recherche [10, 11]. Ainsi, ces dernières années, l'objectif de la recherche sur les nanobiomatériaux est passé des expériences de validation de concept aux études mécanistes, qui visent à obtenir des informations et une compréhension systématique des processus de fabrication des nanomatériaux, des relations structure-propriété des nanomatériaux ainsi que des interactions nanomatériau-biosystème. , et la recherche translationnelle, qui vise à identifier et résoudre les problèmes clés de la traduction des nanomatériaux vers l'industrie et la clinique. Le présent travail se concentre sur l'acquisition de nouvelles connaissances sur un processus de fabrication émergent, connu sous le nom de méthode d'instabilité interfaciale, de nanocristaux micellaires, qui sont devenus une classe majeure de nanobiomatériaux.

Une stratégie principale pour solubiliser les nanomatériaux hydrophobes (par exemple, les QD, les SPION et les nanoparticules d'or synthétisées par la synthèse à haute température à base de solvant organique couramment utilisée [12,13,14]) dans l'eau consiste à utiliser une micelle pour encapsuler les nanomatériaux hydrophobes [ 15,16,17]. Une micelle est un système d'auto-assemblage classique, dans lequel les molécules amphiphiles forment spontanément une structure cœur-coquille (appelée micelle) dans un environnement aqueux, avec le segment hydrophile des molécules amphiphiles tourné vers l'extérieur comme la coque micellaire et le segment hydrophobe tourné vers l'extérieur. vers l'intérieur comme le noyau micellaire, pour minimiser l'énergie totale du système. Les micelles ont une longue histoire d'applications en tant qu'agents de nettoyage et systèmes d'administration de médicaments [18,19,20,21,22], principalement basées sur le fait que les molécules hydrophobes (par exemple, les huiles, de nombreux médicaments anticancéreux) peuvent être encapsulées dans les noyaux hydrophobes. des micelles entraînées principalement par l'interaction hydrophobe [23]. Plus récemment, des micelles ont été appliquées pour encapsuler des nanocristaux uniques (chaque micelle encapsulant un seul nanocristal) pour l'imagerie et la détection biomédicales [24]. Plus récemment, de nombreux groupes de recherche ont rapporté l'utilisation d'une micelle pour encapsuler plusieurs nanocristaux, pour la multifonctionnalité ou les effets synergiques entre les différents nanocristaux dans une micelle [25,26,27,28,29,30,31,32].

Une méthode émergente pour préparer des nanocristaux micellaires (micelles encapsulées dans des nanocristaux) est la méthode d'instabilité interfaciale [33,34,35]. Le processus d'instabilité interfaciale a été signalé pour la première fois en 2008 par Zhu et Hayward pour préparer des micelles encapsulées dans des nanoparticules d'oxyde de fer [33] et a ensuite été utilisé par Ruan et Winter et al. préparer des micelles encapsulant à la fois des QD et des SPION en 2010 et des micelles encapsulant des QD de différentes couleurs d'émission fluorescente en 2011 [25, 26]. Le processus d'instabilité interfaciale pour la préparation de micelles de poly (styrène-b-éthylène glycol) (PS-PEG) encapsulées QD implique deux étapes principales :(1) Formation de gouttelettes d'émulsion huile-dans-eau. Dans cette émulsion, la phase huileuse contient des QD hydrophobes et le copolymère à blocs amphiphile PS-PEG dissous dans un solvant organique apolaire (chloroforme dans le présent travail); la phase aqueuse contient un tensioactif poly(alcool vinylique) (PVA) dissous dans l'eau; (2) Formation de micelles encapsulées dans des nanocristaux. Lors de l'évaporation du solvant organique, l'interface huile/eau de l'émulsion devient instable et l'interaction hydrophobe pousse le système à former spontanément des micelles PS-PEG encapsulant des QD hydrophobes. Un indicateur simple de la formation réussie de micelles généralement utilisé dans les expériences est la transformation visuelle spectaculaire du système d'une dispersion laiteuse (émulsion) à une transparente (dispersion de nanocristal micellaire), grâce à la taille nanométrique (diamètre typique 30-40 nm ) des micelles. Dans les expériences précédentes de Ruan et Winter avec l'encapsulation de QD dans des micelles PS-PEG en utilisant le processus d'instabilité interfaciale, il a été constaté que, bien que ce processus ait de nombreuses caractéristiques positives, un problème majeur était la grande perte fréquemment observée de fluorescence QD du système au cours de la processus de fabrication/stockage, et la cause de la perte de fluorescence était inconnue. Les objectifs du présent travail sont doubles :d'une part, nous visons à minimiser la perte de fluorescence des micelles PS-PEG encapsulées QD préparées par le processus d'instabilité interfaciale; d'autre part, grâce au processus d'optimisation technologique et en tirant parti de la fluorescence des QD en tant que rapporteur pour suivre le processus de fabrication de matériaux nanocomposites contenant des QD, nous visons à mieux comprendre le processus général émergent de préparation de micelles encapsulées dans des nanocristaux , c'est-à-dire le processus d'instabilité interfaciale. Nos résultats suggèrent que la taille des gouttelettes d'émulsion et le tensioactif PVA jouent un rôle clé dans le processus de fabrication :chaque gouttelette d'émulsion fonctionne essentiellement comme un « micro-réacteur » dans lequel se produisent une instabilité interfaciale et des « réactions » d'auto-assemblage, le tensioactif PVA étant requis pour la formation des « micro-réacteurs » ; L'utilisation d'une grande taille de « micro-réacteur » (~ 25 μm) conduit à une grande partie de micelles de PVA encapsulées dans des nanocristaux colloïdalement instables en plus des micelles de PS-PEG encapsulées dans des nanocristaux colloïdalement stables, tout en utilisant une petite taille de « micro-réacteur » (~ 3 μm ou moins, généré par sonication ou électrospray) ne donne que des micelles PS-PEG encapsulées dans des nanocristaux colloïdalement stables.

Méthodes

Matériaux

Les points quantiques core-shell CdSe/ZnS (QD, longueur d'onde d'émission 600 nm, recouverts d'octadécylamine) ont été achetés auprès d'Ocean Nanotech. Le poly (styrène-b-éthylène glycol) (PS-PEG) et le poly (styrène-b-éthylène glycol) à terminaison acide carboxylique (PS-PEG-COOH) (PS 9,5 k Dalton, PEG 18,0 k Dalton) ont été achetés auprès de Polymer Source . Le poly (alcool vinylique) (PVA) (poids moléculaire 13-23 kg/mol, 87-89 % hydrolysé) a été acheté auprès de Sigma-Aldrich. Le peptide Tat (séquence YGRKKRRQRRR) et le peptide RGD (Arg-Gly-Asp) ont été achetés auprès de ChinaPeptides. Le chlorhydrate de 1-éthyl-3-(-3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) et le sulfo-NHS ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich. Tous les autres produits chimiques étaient de qualité réactif. L'eau utilisée pour toutes les expériences a été doublement distillée et purifiée par un système de purification Millipore Milli-Q.

Préparation de nanocristaux micellaires via le processus d'instabilité interfaciale

Dans une procédure typique, une phase huileuse a d'abord été formée en mélangeant des QD (0,1 μM, 0,1 ml) et du PS-PEG (10 mg/ml, 20 μl) dans le solvant organique chloroforme. Ceci a été suivi par l'ajout d'une phase aqueuse (0,6 ml d'eau contenant 5 mg/ml de PVA). Une émulsion huile-dans-eau a été formée soit par agitation manuelle (secouant vigoureusement le mélange à la main pendant 1 min) soit par sonication (sication du mélange dans un sonicateur de bain ShuMei KQ218 pendant 30 s). Dans certaines expériences, l'électrospray a été utilisée pour générer des gouttelettes d'émulsion ultrafines pour le processus d'instabilité interfaciale [35]. Les différents traitements ont été utilisés pour générer des gouttelettes d'émulsion de différentes tailles pour étudier les effets de la taille des gouttelettes :des gouttelettes d'environ 25 μm (de diamètre) ont été formées par agitation manuelle, des gouttelettes d'environ 3 μm (de diamètre) ont été formées par sonication, et quelques des gouttelettes de plusieurs centaines de nanomètres à quelques micromètres (de diamètre) ont été formées par électrospray. L'émulsion a été diluée par un facteur supplémentaire de quatre avec de l'eau ultrapure (2,4 ml). L'émulsion a été laissée dans une hotte chimique avec agitation magnétique à 100 tr/min pour permettre l'évaporation du chloroforme, conduisant à la formation de QD micellaires. Une transition visible en apparence d'une dispersion laiteuse à une dispersion transparente était indicative d'une formation réussie de micelles.

Lorsque le tétrahydrofurane (THF) a été utilisé comme solvant organique, une phase huileuse a d'abord été formée en mélangeant des QD (0,1 μM, 1 ml) et du PS-PEG (10 mg/ml, 0,2 ml) dans du THF. De l'eau déminéralisée a été ajoutée à la solution goutte à goutte (1 goutte/20 s) jusqu'à ce que la teneur en eau atteigne 50 % v /v . La solution a ensuite été mélangée par votex pendant 10 à 15 min, puis dialysée contre de l'eau déminéralisée pendant 2 jours pour éliminer le THF (seuil de poids moléculaire 100 000 daltons).

Lorsque l'électrospray a été utilisé pour générer des gouttelettes pour le processus d'instabilité interfaciale, l'opération était la suivante [35]. Une configuration d'électrospray coaxiale a été utilisée. L'aiguille capillaire intérieure était un capillaire en acier inoxydable de calibre 27 (diamètre extérieur 500 μm ; diamètre intérieur 300 μm) et l'aiguille extérieure était un connecteur à trois voies en acier inoxydable de calibre 20 (diamètre extérieur 1000 μm ; diamètre intérieur 500 μm). La pointe de la buse était positionnée à 0,8 cm au-dessus d'un anneau en acier mis à la terre et à 10 cm au-dessus d'une coupelle de récupération en verre. Une phase huileuse a été formée en mélangeant des QD et du PS-PEG et a ensuite été délivrée au capillaire interne en acier inoxydable à un débit de 0,6 ml/h à l'aide d'une pompe à seringue (SPLab01, Shenzhen, Chine). Les concentrations de PS-PEG et de QD dans la phase huileuse étaient respectivement de 5 mg/ml et 0,2 μM. Une phase aqueuse a été préparée en dissolvant du PVA dans du H₂ désionisé O à 40 mg/ml. La solution aqueuse a été délivrée à l'anneau externe de l'aiguille coaxiale à un débit de 1,5 ml/h à l'aide d'une deuxième pompe à seringue (SPLab01, Shenzhen, Chine). Typiquement, à une tension comprise entre 6 et 7 kV, un jet conique concave (cône de Taylor) a été observé à l'extrémité de la buse coaxiale. Une coupelle de collecte en verre contenant 10 ml d'eau déminéralisée a été placée sous la pointe de la buse pour collecter les gouttelettes. Le temps d'électropulvérisation (après la formation d'un cône de Taylor stable) était généralement de 30 à 90 min. Ceci a été suivi d'une nouvelle évaporation dans la hotte chimique pendant une nuit. Enfin, la dispersion dans la boîte de collecte en verre a été transférée dans un tube à centrifuger de 15 ml pour les caractérisations.

Caractérisations des propriétés physiques des QD micellaires

La morphologie des QD micellaires a été caractérisée par microscopie électronique à transmission (MET, JEOL JEM-2100 (HR)), et tous les échantillons étudiés par TEM dans le présent travail ont été colorés négativement par 1% d'acide phosphotungstique (PTA). La taille des particules a été caractérisée par MET ou diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les spectres fluorescents ont été obtenus par un spectrophotomètre fluorescent Hitachi F-4600.

Cytotoxicité des nanomatériaux

Une étude de cytotoxicité a été réalisée sur trois lignées cellulaires cancéreuses humaines bien caractérisées, à savoir les cellules A549 (épithéliales basales alvéolaires), MCF-7 (sein) et HeLa (col de l'utérus) (achetées auprès de KeyGen Biotech, Chine). Les cellules ont été maintenues avec du DMEM cultivé avec 10 % de sérum bovin fœtal et des antibiotiques (pénicilline/streptomycine) dans un incubateur humide (37 °C et 5 % de CO₂ ). Pour l'évaluation de la cytotoxicité, les cellules ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits dans 200 μl de milieu pendant 24 h. Ensuite, les cellules ont été incubées avec différentes concentrations de QD micellaires dans un milieu de culture frais à 37 °C dans 5% de CO₂ atmosphère. Après 24 h d'incubation, les milieux de culture avec les QD micellaires dispersés ont été retirés et le test MTT a été appliqué selon le protocole du fabricant. Enfin, l'absorbance optique dans chaque puits a été mesurée à 570 nm dans un lecteur de plaque de microtitration.

Conjugaison de micelles PS-PEG-COOH QD-encapsulées avec des peptides

Des micelles PS-PEG-COOH ont été préparées avec la procédure d'instabilité interfaciale décrite ci-dessus, avec des molécules PS-PEG-COOH utilisées à la place de celles PS-PEG. La conjugaison avec le peptide Tat ou le peptide RGD a ensuite été réalisée via la méthode EDC/sulfo-NHS. Pour activer les groupes carboxyle des micelles, 0,3 ml de solution tampon MES 0,1 M contenant 2 mg/ml d'EDC et 5 mg/ml de sulfo-NHS a été ajouté à la dispersion de micelles (3 ml) et mis à réagir sans agitation pendant 30 min à température ambiante. . L'EDC et le sulfo-NHS supplémentaires ont ensuite été éliminés en utilisant un tube d'ultrafiltration de 30 kD (centrifugation à 10 krpm pendant 5 min), et la dispersion obtenue a été remise en suspension dans du PBS (1 ml). Par la suite, 50 μl de peptide Tat (2 mg/ml dans du PBS) ou 50 μl de peptide RGD (0,5 mg/ml dans du PBS) ont été ajoutés et mis à réagir pendant 12 h à 4 °C, respectivement. La dispersion QD micellaire PS-PEG conjuguée au peptide obtenue a été purifiée en utilisant un tube d'ultrafiltration de 50 kD (centrifugation à 10 krpm pendant 5 min) pendant trois fois pour éliminer les molécules de peptide supplémentaires et remise en suspension dans du PBS (1 ml).

Imagerie de cellules vivantes

L'imagerie des cellules vivantes a été utilisée pour étudier l'internalisation cellulaire et le transport intracellulaire des QD micellaires PS-PEG conjugués au peptide Tat. Des cellules HeLa (achetées à KeyGen Biotech, Chine) ont été ensemencées sur des plaques de culture tissulaire à fond de verre à une confluence initiale de 20 % (densité d'ensemencement 1 × 10 ⁵ cellules/ml) dans 600 μl de milieu (DMEM + 10% sérum bovin foetal) et ont été cultivés pendant 40 h dans 5% CO₂ à 37 °C. Des QD micellaires PS-PEG conjugués au peptide Tat (10 nM de QD dans un milieu de culture cellulaire) ont ensuite été ajoutés. Après avoir été incubées avec les QD micellaires pendant 1 h, les cellules ont été lavées deux fois avec du milieu de culture frais pour éliminer les QD micellaires libres (l'étape de lavage a été effectuée afin que le temps de démarrage du transport intracellulaire des QD micellaires internalisés puisse être approximativement le idem pour toutes les nanoparticules ajoutées). Après 6 h, chaque plaque de cellules a été imagée par un système d'imagerie de cellules vivantes, qui se compose d'une chambre d'incubation de cellules (IX3W, Tokai Hit), d'un microscope épi-fluorescent (IX-83, Olympus, avec une lampe halogène comme source lumineuse ), un système confocal à disque tournant (Andor) et une caméra à dispositif à couplage de charge multiplicateur d'électrons (EMCCD) (Evolve 512, Photometrics). Le système d'imagerie confocale de cellules vivantes utilisé ici permet une imagerie confocale à disque rotatif de cellules vivantes cultivées sur la platine du microscope, ce qui est particulièrement utile pour étudier le processus de transport cellulaire. En maintenant les cellules vivantes cultivées sur la platine du microscope, on pourrait s'assurer que le processus biologique naturel est surveillé avec un minimum de perturbations. Pour contre-colorer le noyau cellulaire, juste avant l'imagerie (à un moment donné du transport cellulaire), le colorant fluorescent Hoechst 33342 (5 μM dans un milieu de culture cellulaire) a été incubé avec des cellules vivantes pendant 20 min.

L'imagerie des cellules vivantes a également été appliquée pour étudier la liaison spécifique des QD micellaires PS-PEG conjugués au peptide RGD avec α _{v 3} -molécules d'intégrine, en utilisant un α _{v 3} -lignée cellulaire surexprimée d'intégrine (cellules U87 MG, achetées auprès de KeyGen Biotech, Chine) par rapport à une lignée cellulaire sans α _{v 3} -surexpression de l'intégrine (cellules MCF-7, achetées auprès de KeyGen Biotech, Chine). Le protocole d'imagerie cellulaire ci-dessus utilisé pour les QD micellaires PS-PEG conjugués au peptide Tat a été adopté, la principale modification étant que la concentration utilisée pour les QD micellaires conjugués au peptide RGD était de 100 nM (QD dans un milieu de culture cellulaire).

Résultats et discussion

Nous et d'autres avons récemment introduit la méthode d'instabilité interfaciale pour encapsuler des nanocristaux afin de former des nanoparticules composites pour des applications biologiques. Cependant, nous avons fréquemment rencontré des résultats non reproductibles et parfois contradictoires sur l'intensité de fluorescence des QD (les QD ont été utilisés comme modèle de nanocristaux ici). Cette question doit être abordée pour la traduction à l'industrie et à la clinique. De nombreux facteurs (par exemple, solvant, polymère, température, taille du « micro-réacteur ») impliqués tout au long du processus de fabrication pourraient entraîner une perte de fluorescence et des résultats non reproductibles. Nous avons étudié les différents facteurs impliqués et avons constaté que la taille du « micro-réacteur » (gouttelettes d'émulsion) est un facteur clé à cet égard, l'utilisation du surfactant PVA étant un facteur étroitement lié. Ci-dessous, nous décrivons principalement les résultats sur les effets de la taille des gouttelettes d'émulsion ainsi que sur le surfactant PVA.

Nous avons comparé les effets de deux méthodes différentes d'émulsification avec des résistances mécaniques très différentes, à savoir, l'agitation manuelle (secouer vigoureusement le mélange manuellement) et la sonication du bain (sonifier le mélange dans un sonicateur de bain). Nous avons constaté que ces deux méthodes pourraient éventuellement conduire à des dispersions transparentes et homogènes après évaporation du solvant organique, indiquant la formation réussie de micelles encapsulées dans des nanocristaux (Fig. 1b, c, en bas). Étant donné que l'apparence visuelle transparente et homogène est couramment utilisée comme indicateur simple et pratique de la formation réussie de micelles dans le processus de fabrication basé sur l'instabilité interfaciale, l'impact potentiel des différentes méthodes d'émulsification sur le produit micellaire était auparavant négligé. Nous avons utilisé la microscopie optique pour examiner la taille des gouttelettes d'émulsion générées par ces deux méthodes d'émulsification différentes, respectivement, et avons constaté que la méthode d'agitation manuelle conduisait à des gouttelettes d'environ 25 μm (de diamètre), tandis que la méthode de sonication du bain conduisait à environ 3 μm ( de diamètre) (Fig. 1b, c, en haut). Environ les tailles de 500 gouttelettes ont été mesurées pour chaque échantillon en utilisant des images de microscopie optique pour obtenir la taille moyenne et la distribution des tailles. Analyse statistique (t de l'étudiant test) montre que la différence entre la taille moyenne des gouttelettes formées par agitation manuelle (~25 μm) et celle par sonication (~3 μm) était statistiquement significative (P < 0,001). Surtout, nous avons également effectué des expériences de contrôle pour confirmer que ces deux méthodes d'émulsification différentes produisent systématiquement des tailles de gouttelettes d'émulsion dans les deux gammes de tailles différentes mentionnées ci-dessus, respectivement :une agitation manuelle avec plusieurs durées différentes (0,5, 1, 2 et 3 min) a toutes abouti dans des gouttelettes d'émulsion d'environ 25 μm (avec une distribution de taille similaire) et une sonication de bain avec plusieurs durées différentes (0,5, 1 et 2 min) ont tous donné des gouttelettes d'émulsion d'environ 3 μm (avec une distribution de taille similaire, fichier supplémentaire 1 :Figure S1) .

Observation visuelle des gouttelettes d'émulsion et des micelles encapsulées QD résultantes après évaporation du solvant organique. un Aucun PVA n'a été utilisé. Peu ou pas de gouttelettes d'émulsion se sont formées (image du haut ); peu ou pas de micelles encapsulées QD se sont formées lors de l'élimination du solvant organique (image du bas , l'encart montre l'image fluorescente correspondante à l'aide d'une lampe UV à main pour exciter le rouge Fluorescence QD). b Une agitation manuelle a été utilisée pour former des gouttelettes d'émulsion. Des gouttelettes d'émulsion d'environ 25 μm se sont formées (image du haut , l'encart montre le résultat de la mesure de la taille des gouttelettes à partir de l'analyse d'images de 500 gouttelettes). De plus, la variation de taille due aux différents temps d'agitation s'est avérée minime (Fig. S1). Lors de l'élimination du solvant organique, une dispersion transparente et homogène s'est formée, indiquant la formation réussie de micelles encapsulées dans des nanocristaux (image du bas , l'encart montre l'image fluorescente correspondante à l'aide d'une lampe UV à main pour exciter le rouge Fluorescence QD). c La sonication du bain a été utilisée pour former des gouttelettes d'émulsion. Des gouttelettes d'émulsion d'environ 3 μm se sont formées (image du haut , l'encart montre le résultat de la mesure de la taille des gouttelettes à partir de l'analyse d'images de 500 gouttelettes). De plus, la variation de taille due aux différents temps d'agitation s'est avérée minime (Fig. S1). Lors de l'élimination du solvant organique, une dispersion transparente et homogène s'est formée, indiquant la formation réussie de micelles encapsulées dans des nanocristaux (image du bas , l'encart montre l'image fluorescente correspondante à l'aide d'une lampe UV à main pour exciter le rouge Fluorescence QD). Pour analyser la taille des gouttelettes d'émulsion d'un échantillon particulier, d'abord, une image en microscopie optique des gouttelettes d'émulsion a été prise, et par la suite, les diamètres de ~ 500 gouttelettes ont été mesurés par le logiciel gratuit ImageJ pour obtenir la taille moyenne et la distribution des tailles de les gouttelettes d'émulsion de l'échantillon

En outre, nous avons également effectué un traitement d'émulsification en l'absence du tensioactif PVA et avons constaté que pratiquement aucune gouttelette d'émulsion ne s'était formée avec succès, à en juger par le résultat de la microscopie optique (Fig. 1a, en haut), et pratiquement, aucune micelle ne s'était formée avec succès, à en juger par l'observation d'une séparation de phase presque complète (précipitation QD) dans le produit final, c'est-à-dire l'incapacité à former un produit micellaire (Fig. 1a, en bas). Les résultats de la figure 1a suggèrent que le tensioactif PVA est nécessaire dans le processus d'instabilité interfaciale pour la formation réussie de gouttelettes d'émulsion (en tant que « micro-réacteurs ») et de micelles (en tant que produits finaux). Ceci n'est pas trivial car cela suggère que, bien que le PS-PEG soit également de nature amphiphile, la présence de PS-PEG seul (sans la présence de PVA) dans le système ne peut pas donner les gouttelettes d'émulsion nécessaires au processus d'instabilité interfaciale.

Bien que les dispersions de produits aient semblé transparentes et homogènes juste après leur formation (les résultats des caractérisations TEM et DLS ont montré des micelles encapsulées QD sphériques et monodispersées, fichier supplémentaire 2 :Figure S2), la différence de tailles de gouttelettes d'émulsion donnée par les deux Les méthodes d'émulsification, à savoir l'agitation manuelle et la sonication, se sont avérées conduire à une grande différence dans les produits de nanocristaux micellaires. Nous avons mesuré et suivi le changement d'intensité de fluorescence des QD micellaires (micelles encapsulées QD) formées par agitation manuelle et sonication, respectivement, sur une période de 40 jours à 4 °C. Nous avons constaté que, pour les micellaires, les QD formés par agitation manuelle (pendant 1 min, formés à partir de gouttelettes d'émulsion d'environ 25 μm), bien que l'intensité de fluorescence (mesurée par spectroscopie de fluorescence) ait été maintenue pendant le processus de formation des micelles, au fil du temps (~ 10 jours), l'intensité de fluorescence des QD micellaires a diminué progressivement jusqu'à seulement environ 50 % du niveau d'intensité de fluorescence d'origine, et est restée stable par la suite (Fig. 2a). En revanche, les QD micellaires formés par sonication (pendant 30 s, formés à partir de gouttelettes d'émulsion d'environ 3 μm) ont largement maintenu l'intensité de fluorescence (mesurée par spectroscopie de fluorescence) sur toute la période (Fig. 2a). De plus, nous avons utilisé à l'œil nu pour observer la partie inférieure des dispersions micellaires QD formées par agitation manuelle et sonication, respectivement, après que les échantillons aient été laissés au repos pendant 10 jours à 4 °C. Dans la partie inférieure des dispersions micellaires QD formées par agitation manuelle (pendant 1 min) après 10 jours de stockage, un précipité visible a été observé à l'œil nu (Fig. 2a, encadré). En revanche, dans la partie inférieure des dispersions micellaires QD formées par sonication (pendant 30 s) après 10 jours de stockage, aucun précipité visible n'a été observé à l'œil nu (Fig. 2a, encadré). Ces résultats suggèrent que, bien que les deux méthodes d'émulsification puissent conduire à la formation réussie de micelles encapsulées QD avec une efficacité d'encapsulation similaire, une grande partie des micelles encapsulées QD formées par des gouttelettes d'émulsion plus grosses (~ 25 μm, produites par agitation manuelle pendant 1 min ) était colloïdalement instable et, au fil du temps, entraînait une précipitation et donc une perte de fluorescence de la dispersion, tandis que toutes les micelles encapsulées QD formées par des gouttelettes d'émulsion plus petites (~ 3 μm, produites par sonication en bain pendant 30 s) étaient colloïdalement stables et donc maintenues fluorescence pendant une longue période de temps (l'étude MET de la dispersion après 10 jours de stockage a également montré une morphologie bien maintenue des nanocristaux micellaires, comme le montre le fichier supplémentaire 3 :Figure S3). De plus, nous avons constaté que, lorsque le temps de sonication passait de 30 s à 1 et 2 min pour former des gouttelettes d'émulsion, l'intensité de la fluorescence était considérablement réduite, bien que les micelles encapsulées QD aient été colloïdalement stables pendant une longue période pour les différents durées de traitement par sonication à en juger par l'intensité de fluorescence stable tout au long du temps de stockage (Fig. 2b). La perte de fluorescence montrée sur la figure 2b était probablement causée par la génération de défauts de surface sur les QD par le traitement mécanique fort et prolongé. Dans une expérience de contrôle, l'intensité de fluorescence des QD hydrophobes dissous dans le chloroforme s'est également avérée diminuer progressivement sous traitement par sonication avec un temps de sonication accru (Fichier supplémentaire 4 :Figure S4), ce qui soutient cette cause proposée de perte de fluorescence. Ensemble, les Fig. 2a, b révèlent les deux principaux mécanismes de perte de fluorescence dans le système de micelles encapsulées QD fabriqué par le processus d'instabilité interfaciale, à savoir, les micelles encapsulées QD colloïdalement instables et les défauts de surface QD générés par le traitement mécanique.

Stabilité de fluorescence des micelles encapsulées QD fabriquées par le processus d'instabilité interfaciale. un Changement d'intensité de fluorescence (mesuré par spectroscopie de fluorescence) au fil du temps pour les micelles encapsulées QD, avec les gouttelettes d'émulsion formées soit par agitation manuelle (pendant 1 min, soit ~ 25 μm de gouttelettes) ou par sonication (pendant 30 s, soit ~ 3 gouttelettes m), respectivement. Les encarts sont des images des dispersions de micelles encapsulées QD après 10 jours de stockage à 4 °C avec les gouttelettes d'émulsion formées soit par agitation manuelle (pendant 1 min, soit ~ 25 μm de gouttelettes) soit par sonication (pendant 30 s, soit ~ 3 gouttelettes m), respectivement. Panneau a indique qu'une cause de perte de fluorescence des micelles encapsulées QD est la présence de micelles encapsulées QD instables de manière colloïdale. b Changement d'intensité de fluorescence (mesuré par spectroscopie de fluorescence) au fil du temps pour les micelles encapsulées QD avec les gouttelettes d'émulsion formées par sonication (c. Panneau b indique que l'une des causes de la perte de fluorescence des micelles encapsulées QD est les défauts de surface QD générés par un traitement mécanique fort et prolongé

Parmi ces deux mécanismes de perte de fluorescence, bien qu'il soit bien connu que la perte de fluorescence QD peut être causée par des dommages à la surface QD, le résultat selon lequel une partie des micelles est instable du point de vue colloïdal nous a surpris. Ainsi, nous avons mené une étude plus approfondie sur ce mécanisme particulier. Nous avons d'abord posé la question de savoir si les QD précipités mentionnés ci-dessus étaient bien encapsulés dans des micelles (ou des structures d'assemblage de type micelles). Nous avons constaté que le simple fait de secouer la dispersion avec ces précipités pouvait conduire à un retour de l'intensité de fluorescence de la dispersion au niveau d'origine (Fig. 3a, à gauche) ; en revanche, une étude de contrôle sur l'utilisation du même traitement pour les QD hydrophobes précipités dans l'eau n'a montré aucune augmentation de l'intensité de la fluorescence (Fig. 3a, à droite). De plus, des images de microscopie électronique à transmission (MET) de la partie inférieure des échantillons de produits formés par agitation manuelle après 10 jours de stockage ont montré un grand nombre de QD regroupés dans de grandes structures sphériques et non sphériques (Fig. 3b, à gauche) ; en revanche, dans la partie inférieure des échantillons de produits formés par sonication après 10 jours de stockage, les images MET correspondantes ne montraient qu'un petit nombre de QD regroupés en structure sphérique (Fig. 3b, milieu). Ces résultats montrent ainsi que les QD précipités étaient bien encapsulés dans des micelles ou des structures d'assemblage de type micelles, c'est-à-dire que ces QD n'étaient pas des QD hydrophobes nus. Nous nous sommes alors posé la question de savoir quelle est la nature chimique de ces micelles colloïdales instables (ou structures d'assemblage de type micelles). Parce qu'une micelle PS-PEG doit être stable au niveau colloïdal, nous avons émis l'hypothèse que les micelles instables (ou structures d'assemblage de type micelle) étaient formées par le tensioactif PVA. Cette hypothèse est étayée par les deux lignes de preuves expérimentales suivantes. Tout d'abord, nous avons constaté que l'utilisation de PVA sans PS-PEG dans le processus d'instabilité interfaciale pouvait en effet entraîner des micelles encapsulant des QD (Fig. 3b, à droite). Deuxièmement, nous avons effectué des expériences de dialyse sur des QD micellaires PS-PEG et des QD micellaires PVA, respectivement, à des fins de comparaison. Après traitement de dialyse (le poids moléculaire seuil de la poche de dialyse étant de 200 kD, ce qui est supérieur aux poids moléculaires du PVA et du PS-PEG) contre de l'eau pure, les QD micellaires PS-PEG sont restés stables au niveau colloïdal, à en juger par le fait que la fluorescence QD est restée homogène dans la dispersion (Fig. 3c, à gauche). À l'opposé, la dispersion micellaire PVA QD a conduit à des agrégats fluorescents clairement visibles après un traitement de dialyse presque identique à celui ci-dessus (Fig. 3c, à droite). As the dialysis experiment could be considered as mimicking the dilution treatment that micelle-based nanomaterials would encounter once introduced to an in vivo environment, our dialysis experimental results indicate that the QD-encapsulated PVA micelles would become colloidally unstable in vivo. Therefore, the results shown in Fig. 3c suggest that the fluorescence loss from using large emulsion droplets (~25 μm, produced by manual shaking) is caused by colloidally unstable PVA micelles (or other micelle-like assembly structures) encapsulating QDs.

Examining the colloidally unstable part of the micellar QDs. un Left , the disappearance of fluorescence of the colloidally unstable part of the micellar QDs from the dispersion after 10-day storage could be resumed after the dispersion was shaken. Right , the fluorescence of hydrophobic QDs was not detected in water because they could not be dispersed in water. b Left and middle are the TEM images of the bottom portions of the micellar QD dispersions formed from manual shaking for 1 min (i.e., ~25 μm emulsion droplets) and sonication for 30 s (~3 μm emulsion droplets), respectively, after 10-day storage. Right , TEM image of PVA micellar QDs. c Dialysis (against water) treatment on PS-PEG micellar QDs (left ) and PVA micellar QDs (right ), respectivement. A hand-held UV lamp was used to excite the red QD fluorescence

Further, we conducted two additional experiments to confirm the roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA. In the first experiment, we used a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF) instead of the water immiscible organic solvent chloroform. In this case, the “emulsion droplet” size could be considered as zero, and the surfactant PVA was not used because it was not needed to facilitate the mixing of oil phase with water phase. It was found that the fabrication process produced QD-encapsulated micelles with stable fluorescence (Fig. 4a), which is consistent with the result that small emulsion droplets lead to colloidally stable QD-encapsulated micelles and stable fluorescence. In addition, it was observed that the micelles formed by this process (with THF, without PVA) had large size distribution and some of the formed micelles even had non-spherical shapes (Fig. 4b). This indicates that “zero droplet size” could lead to poorly controlled micelle size and shape (although the formed micelles are colloidally stable). Thus, the results of the “zero emulsion droplet size” experiment (with the water-miscible THF as the organic solvent), on the one hand, are consistent with the finding that smaller emulsion droplets lead to colloidally stable micellar nanocrystals (judging by the stable fluorescence given by “zero-sized emulsion droplets”), and on the other hand, indicate the advantage of having an emulsion droplet (with non-zero droplet size) compared with no emulsion droplet at all (“zero-droplet size”, which gives poor micelle morphology). In the second experiment, we used electrospray, which is known to give ultrafine and uniform droplets with the typical droplet size range being a few hundred nanometers to a few micrometers (smaller than what the sonication treatment generates), as the method to produce emulsion droplets (PVA was used in this case) [35,36,37,38,39]. It was found that this method led to micellar QDs with stable fluorescence and well-controlled micelle size and shape (Fig. 4c, d). It should be mentioned that electrospray typically can only produce droplet sizes smaller than what the sonication treatment gives (i.e., a few hundred nanometers to a few micrometers). Thus, to study the effect of larger emulsion droplet size, in this work, we used another mechanical treatment method, i.e., manual shaking, to give larger droplets (~25 μm). The actual size of electrospray-generated droplets is difficult to be obtained by direct imaging (for example, the size of electrospray-generated oil-in-water emulsion droplets would change greatly upon entering the large volume of water phase in the collection container due to aggregation and fusion, and the typical sub-micrometer size of electrospray-generated droplets is approaching the diffraction limit of optical microscopy), but could be theoretically calculated or experimentally measured by methods that characterize aerodynamic mobility as done previously in the literature.

Using additional methods to form small emulsion droplets to confirm the importance of droplet size. un , b Using water-miscible THF as the oil phase solvent (without using PVA) led to micellar QDs with stable fluorescence (a ) and irregular micelle shapes (b ). c , d Using electrospray (with PVA) to form droplets led to micellar QDs with stable fluorescence (c ) and regular micelle shape (d )

Figure 5 presents a schematic to summarize our results and insights on the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystals-encapsulated micelles (with QDs as the model for nanocrystals). Each oil-in-water emulsion droplet serves as a “micro-reactor” for the interfacial instability-mediated self-assembly “reaction.” When no PVA (surfactant) is used, emulsion droplet does not form, and thus, no micelle is formed. When the emulsion droplet is large in size (~25 μm), only a part of the QDs (approximately 50%, based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, Fig. 2a) in the droplet get encapsulated in PS-PEG (an amphiphilic block copolymer) micelles, which are colloidally stable, while the other part of the QDs get encapsulated in PVA (also an amphiphilic polymer, but not a block copolymer) micelles, which are colloidally unstable. When the emulsion droplet is small in size (~3 μm or smaller), nearly all QDs (based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, combined with comparison of fluorescent intensity with hydrophobic QDs undergoing similar mechanical treatment, Fig. 2a, Fig. 4a, c, and Additional file 4:Fig. S4) in the droplet get encapsulated in stable PS-PEG micelles. Thus, the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystal-encapsulated micelles are intricate and intertwined, particularly in the context of biological applications:the surfactant PVA is required for successful formation of emulsion droplets and micelle products, and yet it is also responsible for formation of the colloidally unstable part of nanocrystal-encapsulated micelles, which would be detrimental in a number of biological applications; and the key to avoid the colloidally unstable nanocrystal-encapsulated PVA micelles is to use emulsion droplets small in size (~3 μm or smaller).

Roles of emulsion droplet size and surfactant in the interfacial instability-based fabrication of micellar nanocrystals

In addition, it should be mentioned that, for a well-dispersed oil-in-water emulsion to form, a surfactant is often required to lower the surface tension between the oil phase and water phase, and PVA was selected here as the surfactant because it was applied in nearly all the previous works on using the interfacial instability method to fabricate micelles [25, 26, 33,34,35]. We cannot rule out the possibility that other surfactants could give different results. Examining the effects of different types of surfactant would be part of the future studies.

Finally, we performed proof-of-concept biological experiments using live cells to demonstrate that our micellar nanocrystal products (with the emulsion droplets formed from sonication treatment for 30 s) are (1) fairly biocompatible, (2) can be functionalized with biological molecules, (3) can be introduced into live cells, and (4) if conjugated with biological targeting molecules, can bind with specific biological targets (Fig. 6). Cytotoxicity studies by MTT assay showed that the QD-encapsulated PS-PEG micelles had fairly low cytotoxicity in three different cell lines compared with the negative control (cultured cells in the absence of nanomaterials added, i.e., concentration being zero) (Fig. 6a). To bio-functionalize QD-encapsulated PS-PEG micelles, in the micelle fabrication process the PS-PEG molecules were replaced with PS-PEG-COOH molecules, the latter of which could then be conjugated with a wide spectrum of biomolecules (e.g., peptides, nucleic acids, and antibodies) via well-established bioconjugation methods. To show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be introduced into live cells, the micelles were conjugated with Tat peptide, which is derived from HIV virus and is known to be able to introduce a variety of nanomaterials into live cells with high efficiency and low toxicity [40,41,42]. The thus-formed Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs were then incubated with HeLa cells, and live cell confocal imaging was conducted to study the cellular transport of the fluorescent nanomaterials. The live cell confocal imaging system used here permits spinning-disk confocal imaging of live cells cultured on the microscope stage, ensuring that the natural transport process is followed with minimal disturbance. HeLa cells were selected here because this cell line was used in the first tracking study of the cellular transport of Tat peptide-conjugated QDs by Ruan et al. [42]. It was found that, 6 h after the first contact of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs with the cells, many of the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs had been internalized by the cells, judging by the composite confocal images to show the positions of QDs, cell nucleus and cell periphery, and the cellular uptake level was much higher than that without the assistance of Tat peptide (Fig. 6b). Imaging of the change of QD distribution at different time points of cellular transport for the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs indicated that, after entering the cells, they were gradually accumulated at a perinuclear region (Additional file 5:Fig. S5). Additional file 6:video 1 shows a three-dimensional reconstructured image of the distribution of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs in the cell at the time point of 24 h, which further confirms cellular internalization and perinuclear accumulation. The behavior of the cellular transport of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs is consistent with that of Tat peptide-conjugated QDs previously reported in the literature [42]. Further, to show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be modified (bio-functionalized) to bind with specific biological targets via ligand-receptor binding, the micelles were conjugated with RGD peptide, which is known to specifically recognize integrins on cell surface [43]. Fluorescent microscopy imaging results indicated that RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs could bind with α _v β₃ -integrin over-expressed cells (U87MG cell line, a human glioblastoma cell line, Fig. 6c, right), judging by the significant QD fluorescence on or in the cells. In contrast, the two control experiments, one of which used RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to incubate with MCF cells (without α _v β₃ -integrin over-expression, Fig. 6c, left) and the other of which used PS-PEG-COOH micellar QDs (without RGD peptide conjugation) to incubate with U87MG cells (Fig. 6c, middle), showed little to no QD fluorescence on or in the cells. Thus, these results demonstrated the ability of RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to specifically bind with α _v β₃ -integrin molecules.

Interactions of PS-PEG micellar QDs (prepared by using sonication 30 s in the interfacial instability method) with biological cells. un PS-PEG micellar QDs were fairly biocompatible judging from the MTT cytotoxicity assay results. The concentrations were based on the amounts of QDs used. b Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can be internalized by live cells. c RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can specifically recognize and bind with the α _v β₃ -integrin molecules over-expressed on U87MG cells (right image ). In comparison, in the absence of α _v β₃ -integrin over-expression (MCF-7 cells, left image ) or Tat peptide (PS-PEG-COOH micellar QDs, middle image ), no significant binding (QD fluorescence) was observed. The red fluorescence was from QDs. The cell nucleus was stained by the blue fluorescent dye Hoechst 33342. Cell periphery is shown by white line (from the corresponding bright field microscopy images)

Conclusions

In conclusion, we have used QDs as the model nanocrystals to follow the interfacial instability process, an emerging general method to fabricate nanocrystal-encapsulated micelles. Our results reveal the key roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA in the interfacial instability process. These results not only help to optimize the quality of nanocrystal-encapsulated micelles for biological applications such as biological detection, imaging and therapy, but offer helpful new knowledge on the interfacial instability process in particular and self-assembly in general.

Abréviations

EDC:

1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

PS-PEG:

Poly (styrene-b-ethylene glycol)

PS-PEG-COOH:

Carboxylic acid terminated poly (styrene-b-ethylene glycol)

PTA:

Phosphotungstic acid

PVA:

Poly (vinyl alcohol)

QD:

Quantum dot

SPION:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticle

TEM :

Microscopie électronique à transmission

THF:

Tetrahydrofuran