Imagerie hyperspectrale avancée pour la détection multiplexée de nanoprobes infrarouges à ondes courtes dans les systèmes biologiques

Résumé

L'imagerie optique biologique avec des luminophores exogènes émettant dans la région spectrale de l'infrarouge à ondes courtes (SWIR, ~ 1000–1700 nm) est un domaine en plein essor, et le développement de multiples nanoprobes photoluminescents SWIR a été récemment rapporté. À cet égard, l'imagerie hyperspectrale (HSI), combinée à des algorithmes de démélange, est un outil prometteur qui permet un multiplexage efficace des nanoagents émetteurs SWIR par leurs profils spectraux de photoluminescence (PL). La technique HSI SWIR décrite ici est développée pour multiplexer deux types de nanoprobes : des nanoparticules polymères dopées avec un colorant organique (PNPs) et des nanoparticules fluorées dopées aux terres rares (RENPs). Les deux types de nanoprobes présentent une PL dans la même gamme spectrale (~ 900–1200 nm), ce qui entrave la séparation spectrale de la PL avec des filtres optiques et limite les possibilités d'imagerie multiplexée dans les tissus biologiques. En appliquant l'HSI SWIR, nous avons exploité les différences dans les profils spectraux de PL et atteint l'imagerie sélective et sensible du signal PL de chaque type de nanoparticules. Le démélange des données acquises a permis le multiplexage des nanoprobes à spectres chevauchants par leur profil PL. La distribution quantitative et spatiale de chaque type de nanoparticules a été obtenue à partir de leurs suspensions mélangées. Finalement, la technique HSI SWIR avec le protocole de démélange a été appliquée à l'imagerie in vivo de souris injectées sous-cutanément avec des PNPs et des RENPs. L'applicabilité des techniques hyperspectrales au multiplexage des nanoprobes dans l'imagerie in vivo a été démontrée avec succès.

Introduction

Les technologies d'imagerie biomédicale se développent rapidement depuis plusieurs décennies, permettant la détection précoce et l'évaluation de diverses maladies et pathologies. Parmi les différentes modalités d'imagerie, l'imagerie optique occupe une place unique grâce à sa haute résolution spatiale et temporelle et à son coût relativement faible. De multiples approches d'imagerie optique basées sur la photoluminescence (ou, plus spécifiquement, la fluorescence) sont en développement et en cours de traduction clinique. Par exemple, l'imagerie du système lymphatique et la chirurgie guidée par imagerie par fluorescence ont montré des résultats prometteurs pour faire progresser les soins de santé [1, 2]. D'autre part, des sondes photoluminescentes exogènes ciblant des régions d'intérêt spécifiques (par exemple, tumeur) sont activement développées pour l'imagerie in vivo et ex vivo. En plus des exigences habituelles pour les sondes PL (c'est-à-dire absorbance élevée, rendement quantique d'émission et photostabilité), la position spectrale et la forme de l'émission PL sont également des paramètres vitaux à considérer. Comme l'atténuation de la lumière par les tissus biologiques est connue pour être plus faible dans la gamme spectrale du proche infrarouge (NIR, ~ 700–950 nm) que dans le visible, l'existence d'une fenêtre de transparence NIR pour les tissus biologiques (~ 700–950 nm) a été introduite et de nombreux efforts sont consacrés au développement et aux applications de sondes émettrices NIR [3,4,5,6]. De plus, les avancées récentes ont conduit à l'introduction des deuxième et troisième fenêtres NIR (NIR-II et NIR-III) dans la gamme spectrale de ~ 1000–1700 nm, souvent appelée infrarouge à ondes courtes (SWIR), en particulier par les fabricants dans le domaine en plein essor de l'imagerie infrarouge [7,8,9]. Malgré une absorption d'eau plus élevée dans la gamme SWIR par rapport à la fenêtre NIR conventionnelle, une autofluorescence et une diffusion plus faibles des tissus biologiques permettent une résolution d'imagerie supérieure et une plus grande profondeur d'imagerie en bioimagerie PL SWIR [10,11,12]. Par exemple, dans l'imagerie PL SWIR des vasculatures lymphatiques et cérébrales, en utilisant le nouveau colorant fluorescent SWIR CH1055-PEG, la résolution et le rapport signal/bruit se sont révélés supérieurs par rapport à l'imagerie PL NIR conventionnelle avec le colorant NIR-I, le vert d'indocyanine [13]. De plus, l'utilisation de nanoprobes émettrices SWIR (nanotubes de carbone à paroi unique) et d'une caméra d'imagerie SWIR a permis au groupe de Dai de visualiser des vaisseaux sous-10 μm à une profondeur de > 2 mm en imagerie non invasive (sans craniotomie) de la cérébrovasculature de souris, ce qui est inaccessible pour l'imagerie PL dans le visible ou le NIR-I [8].

Les colorants organiques et les complexes de colorants avec une absorption intense dans la première fenêtre NIR et une fluorescence dans la fenêtre NIR-II pourraient être considérés comme des sondes NIR-SWIR prometteuses ; ils ont été montrés comme agents de contraste exceptionnels pour l'imagerie vasculaire et ganglionnaire, la délimitation tumorale et la chirurgie guidée par l'image [13,14,15,16]. Il convient de noter que le colorant organique vert d'indocyanine (ICG) est le seul agent de contraste par fluorescence NIR actuellement approuvé par la FDA américaine pour une utilisation chez l'homme [17]. En même temps, les sondes d'imagerie moléculaire (c'est-à-dire colorants ou complexes de colorants) ont des limitations associées à la nécessité de modifier leur structure moléculaire pour changer leurs caractéristiques de bioprobe (par exemple, solubilité dans l'eau, perméabilité cellulaire, etc.) ou les doter d'autres modalités d'imagerie ou de ciblage. En revanche, les nanoparticules (NPs) comprenant des centres PL peuvent avoir leur surface modifiée de façon covalente avec différentes molécules pour une dispersibilité et une stabilité dans l'eau améliorées, une charge de surface contrôlée, ou des fins de ciblage. De plus, l'introduction de nanoplates-formes PL NIR-SWIR permet de combiner l'imagerie PL avec d'autres modalités d'imagerie, de diagnostic ou thérapeutiques. Des études récentes rapportent l'imagerie de tissus profonds, du corps entier, tumorale ou transcrânienne avec des nanoformulations émettrices SWIR utilisées pour surveiller divers processus in vivo [14, 18,19,20,21]. Parmi les divers nanoprobes émettrices NIR-SWIR rapportés pour l'imagerie in vivo, deux types peuvent être distingués : avec une fluorescence NIR-SWIR provenant de molécules organiques (c'est-à-dire polymère conjugué) ou de nanocristaux céramiques (par exemple, fluorure) dopés aux ions de terres rares. Les nanoparticules à base de polymère (PNPs) sont parmi les nanomédecines les plus réussies en traduction clinique, en raison de la relative facilité de synthèse et de fonctionnalisation chimique, ainsi que d'une biocompatibilité et biodégradabilité supérieures [22]. Lorsqu'elles sont chargées avec des fluorophores NIR-SWIR, les PNPs peuvent servir de sondes d'imagerie prometteuses ou de véhicules d'administration de médicaments guidés par l'imagerie [23, 24]. D'autre part, les nanoparticules dopées aux ions de terres rares (RENPs) sont une classe bien connue de nanoprobes, qui possèdent des propriétés de photoluminescence uniques accessibles à la fois par upconversion (décalage anti-Stokes) et down-conversion (décalage Stokes) [25,26,27,28,29,30]. Récemment, les RENPs ont été traduites pour une utilisation en imagerie NIR-SWIR. En contraste avec les sondes NIR-SWIR basées sur des molécules organiques, elles possèdent un rendement quantique élevé, une photostabilité exceptionnelle et des bandes d'émission étroites dans toute la région spectrale NIR-SWIR, qui peuvent être ajustées par dopage avec divers ions [20, 31, 32]. Les RENPs ont été appliquées à l'imagerie de la vasculature et des organes de petits animaux, à la détection tumorale, à l'imagerie multiplexée et multispectrale [3, 19, 20, 33,34,35].

Avec le développement émergent de la bioimagerie PL, une capacité à suivre simultanément plusieurs molécules PL in vivo peut être requise pour différents objectifs (par exemple, imagerie ciblée de cellules ou d'organes sélectionnés conjointement avec l'administration de médicaments guidée par l'imagerie). Pour relever ce défi, des méthodes d'imagerie multiplexée ont été développées. L'imagerie multiplexée fait référence à la complémentarité de l'information anatomique et fonctionnelle dans le système biologique imagé ; son application peut permettre la combinaison de biomarqueurs d'imagerie, de contrastes et de modalités pour augmenter l'utilité de l'imagerie dans les applications de recherche et cliniques [36]. L'imagerie PL multiplexée peut améliorer la dimension théranostique de la nanomédecine, offrant la capacité d'introduire plusieurs contrastes d'imagerie PL avec une modalité thérapeutique. Les méthodes d'imagerie multiplexée les plus couramment utilisées distinguent les sondes PL par la position spectrale de leur émission PL, en utilisant des filtres optiques appropriés [37,38,39]. Cependant, un multiplexage approprié dans une telle approche nécessite l'utilisation de nanoprobes avec des spectres PL étroits et non chevauchants. À cet égard, l'imagerie hyperspectrale (HSI) combinée à des algorithmes d'analyse de mélange spectral est un outil prometteur pour le multiplexage PL. Cependant, les applications biomédicales de l'HSI PL sont principalement limitées à la microscopie à fluorescence, pour le multiplexage de différents types de nanoprobes et l'élimination du fond et de l'autofluorescence [40, 41]. En ce qui concerne l'HSI in vivo, elle est le plus souvent utilisée en mode imagerie par réflexion par acquisition et analyse séquentielle des spectres de réflexion des tissus [42], bien que l'imagerie HSI in vivo (aussi appelée imagerie multispectrale) ait également été rapportée pour la PL dans les gammes visible et NIR [3, 5]. Cependant, aucun rapport sur l'HSI de nanoprobes émettrices SWIR n'a pu être trouvé dans la littérature.

Récemment, nous avons rapporté le développement d'un système HSI à acquisition séquentielle par bandes combiné à un logiciel de démélange spectral pour l'imagerie PL SWIR [43]. La procédure HSI à acquisition séquentielle par bandes était basée sur l'acquisition consécutive d'images 2D à travers un élément à transmittance spectralement variable (c'est-à-dire filtre à cristal liquide accordable, LCTF). Les données PL SWIR obtenues à partir de suspensions de RENPs étaient présentées sous forme de cube de données spectral tridimensionnel (hypercube) comprenant deux dimensions spatiales et une dimension spectrale. L'application ultérieure de la procédure de démélange spectral à chaque pixel spatial de l'hypercube acquis a permis le calcul des abondances dans un composant de mélange PL. Ici, nous avons appliqué l'HSI pour adresser le multiplexage des nanoprobes pour la bioimagerie PL SWIR in vivo. Nous avons utilisé deux types de nanoparticules émettrices SWIR avec des émissions qui se chevauchent spectralement et ne peuvent pas être facilement distinguées en imagerie PL conventionnelle avec des filtres optiques, malgré leur profil spectral différent. La Figure 1 illustre le problème du mélange spectral de la PL de ces nanoparticules et la façon de le surmonter en utilisant le démélange séquentiel par bandes avec HSI.

L'HSI a été appliquée pour acquérir l'imagerie PL sélective et sensible pour les deux types de nanoparticules. Pour démélanger les profils spectraux PL SWIR, le protocole de démélange a été développé, nous permettant d'obtenir le cartographiage quantitatif et spatial des composants dans le mélange, avec détermination des distributions d'intensité en plus des abondances. Les techniques HSI SWIR et le protocole de démélange développé ont été ensuite appliqués à l'imagerie in vivo de souris injectées sous-cutanément avec des nanoparticules pour démontrer l'applicabilité de l'HSI au multiplexage des nanoprobes PL SWIR dans l'imagerie in vivo.

Méthodes

Préparation et caractérisation des nanoformulations

Synthèse de nanoparticules coquille-cœur polymériques chargées avec un colorant fluorescent organique NIR-SWIR

Des nanoparticules coquille-cœur en polystyrène (PS)-poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAM) ont été synthétisées par polymérisation en microémulsion, avec modification de la méthode décrite précédemment [44, 45]. Premièrement, des nanoparticules cœur PS-co-PNIPAM (10 % en poids de PNIPAM) ont été préparées comme suit. NIPAM (0,1 g), dodécylsulfate de sodium SDS (0,1 g) et 0,005 g de NaH₂PO₄ × H₂O ont été dissous dans 45 ml d'H₂O. Du styrène (1 g) a été ajouté goutte à goutte sous agitation vigoureuse lorsque la température a été portée à 60 °C. À l'étape suivante, de l'Ar a été bubblé dans le mélange pendant 30 min, la température a été élevée à 70 °C, et 0,08 g de K₂S₂O₈ dissous dans 1 ml d'H₂O a été injecté pour initier la polymérisation. Deuxièmement, la coquille PNIPAM a été déposée sur le cœur PS-co-PNIPAM. À cet effet, le réacteur a reçu une solution aqueuse de monomère NIPAM (1,8 g) et d'agent de réticulation N,N'-méthylènebisacrylamide (BIS) (0,18 g) dans 4 ml H₂O à l'aide d'une seringue. La réaction a été laissée à continuer pendant 4 h à 70 °C. Le mélange a été refroidi à température ambiante et dialysé pendant 74 h en utilisant une membrane de cellulose avec PMCO 3500 Da. En résultat, une suspension de nanoparticules PS-PNIPAM a été fabriquée ; une structure coquille-cœur des nanoparticules est clairement révélée par les images de microscopie électronique à transmission (MET) (Fig. 3a). Afin d'obtenir des PNPs fluorescentes NIR-SWIR, le colorant fluorescent 2-butyl-6-[5-(2-butyl-1,3-diméthylcyclo-hepta[c]pyrrol-6(2H)-ylidène)penta-1,3-dién-1-yl]-1,3-diméthylcyclohepta[c]pyrrolium tétra-fluoroborate (étiqueté JB9-08) [46] a été post-chargé [47] dans les nanoparticules PS-PNIPAM. Huit microlitres de solution de colorant JB9-08 à 1 mM dans le DMF ont été ajoutés à 2 mL de suspension aqueuse de PNPs à 0,25 % en poids et conservés pendant 24 h avant utilisation.

Synthèse de RENPs coquille-cœur

Les RENPs ont été synthétisées suivant le protocole modifié rapporté ailleurs [48]. Premièrement, les nanoparticules cœur α-NaYF₄ : 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺ ont été préparées par décomposition du trifluoroacétate de métal à haute température. Dans une procédure typique, 0,05 mmol Yb₂O₃, 0,15 mmol Nd₂O₃, et 0,25 mmol Y₂O₃ ont été chargés dans un ballon de 250 ml contenant 5 ml d'eau déionisée et 5 ml de TFA et chauffés à 90 °C pendant 1 h pour obtenir une solution claire. La solution claire résultante a été évaporée à cette température sous purge d'argon pour obtenir une poudre boueuse de RE(TFA)₃. Par la suite, 8 ml OA, 8 ml OM, 12 ml ODE, et 2 mmol NaTFA ont été ajoutés dans le ballon. La solution a été chauffée à 120 °C et maintenue à cette température pendant 30 min, suivie d'un chauffage jusqu'à 300 °C pendant 30 min avant refroidissement naturel à température ambiante. Un environnement argon a été appliqué pendant tout le processus de synthèse. Les nanoparticules résultantes ont été précipitées en ajoutant 20 ml d'éthanol au ballon de réaction refroidi. Après lavage par centrifugation avec l'éthanol trois fois, la poudre blanche collectée a été finalement dispersée dans 10 ml d'hexane pour utilisations ultérieures.

Deuxièmement, les RENPs coquille-cœur α-NaYF₄ : 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ ont été préparées via un processus de croissance épitaxiale médiée par germes, impliquant l'utilisation de nanoparticules cœur α-NaYF₄ : 10% Yb³⁺, x% Nd³⁺ comme germe et la croissance correspondante dans la solution de précurseur de coquille. Pour préparer le précurseur de coquille, d'abord, 2 mmol CaO avec 5 ml d'eau déionisée et 5 ml TFA ont été ajoutés à un ballon de 250 ml et chauffés à 90 °C pendant 1 h pour produire une solution claire. Cette solution a ensuite été évaporée à cette température pour obtenir le précurseur de coquille de trifluoroacétate de calcium (Ca(TFA)₂). Ensuite, 0,5 mmol nanoparticules cœur NaYF₄ : 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺, 7 ml OA, et 7 ml ODE ont tous été ajoutés au ballon. La solution a ensuite été chauffée à 120 °C pendant 30 min, suivie d'un chauffage jusqu'à 300 °C pendant 60 min avant refroidissement naturel. Tout le processus a été réalisé sous environnement argon. Les nanoparticules coquille-cœur résultantes ont été précipitées en ajoutant 20 ml d'éthanol au ballon de réaction refroidi. Après lavage par centrifugation avec l'éthanol trois fois, les NPs coquille-cœur collectées ont été finalement dispersées dans 10 ml d'hexane pour utilisations ultérieures. Pour la préparation de la dispersion aqueuse, les RENPs coquille-cœur α-NaYF₄ : 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ préparées (5 ml dispersion hexane) ont d'abord été mélangées avec 5 ml de solution de tétrafluoroborate de nitrosonium (NOBF₄) (0,1 M) dans le N,N-diméthylformamide (DMF) à température ambiante. Une agitation douce a été appliquée au mélange jusqu'à l'observation de la précipitation des RENPs. Par la suite, du toluène et de l'hexane (1:1, volume) ont été ajoutés au mélange, qui a ensuite été centrifugé à 10000 tr/min pendant 10 min. Le précipité a été collecté et dispersé dans 5 ml DMF. Deuxièmement, 250 mg d'acide polyacrylique (PAA, PM = 18 000) ont été ajoutés à la solution de 5 ml DMF de RENPs traitées au NOBF₄, qui a été chauffée à 80 °C et maintenue à cette température pendant 30 min sous agitation vigoureuse. Après cela, les NPs ont été précipitées en ajoutant de l'acétone, lavées avec l'éthanol, et finalement dispersées dans de l'eau distillée.

Microscopie électronique à transmission

Les morphologies des PNPs et RENPs ont été évaluées en utilisant la microscopie électronique à transmission (MET). Pour être imagées avec la MET, 10 μL de suspension de nanoparticules ont été déposés sur des films de support de carbone stabilisés avec du formvar. Afin de visualiser la structure coquille-cœur des PNPs, elles ont été colorées négativement avec une solution aqueuse à 1 % d'acide phosphotungstique avant d'être déposées sur les films de support. Les films de support de carbone ont été séchés à l'air et lavés avec 5 μL d'eau pure. Les images ont été obtenues en opérant à une tension d'accélération de 100 kV sur MET (JEM-1230, JEOL).

Spectroscopie de photoluminescence

Les spectres PL pour les deux types de nanoparticules ont été mesurés dans les gammes NIR et SWIR en utilisant un spectrofluorimètre Fluorolog-3 équipé d'un spectromètre iHR320 pour la gamme NIR-SWIR (Horiba) ; une diode laser à fibre couplée émettant à 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics) a été utilisée pour exciter la PL des PNPs et RENPs.

Système d'imagerie hyperspectrale

Le système HSI SWIR développé en interne exploite la méthode d'acquisition séquentielle par bandes (Fig. 2) et comprend une caméra NIR (Xeva-1.7-320, Xenics, Belgique), une optique de focalisation (TEC-M55MPW, Computar, USA), et un filtre à cristal liquide accordable (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, USA) comme élément dispersif. Le système a une résolution de 340 × 258 pixels et opère dans la gamme spectrale 900–1700 nm. Les sources d'illumination dans le système incluent une lampe à incandescence (pour l'alignement d'image, la mise au point et l'imagerie en champ clair) et une diode laser à fibre couplée à 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics, USA), alimentée par une source d'alimentation laser (Laser Source 4308, Arroyo Instruments, USA), pour l'excitation PL en imagerie PL. L'acquisition du cube de données spectral a été réalisée par accord séquentiel de la transmittance LCTF de largeur spectrale 20 nm dans la gamme de 900 à 1200 nm avec un pas de 10 nm et la capture des images correspondantes. Le temps d'exposition de la caméra NIR pendant l'acquisition HSI a été réglé à 200 ms. La densité de puissance laser sur l'échantillon a été fixée à ~ 100 mW/cm². Pour l'acquisition d'images PL dans toute la gamme NIR-SWIR, le LCTF a été remplacé par un filtre passe-long à 850 nm (Edmund Optics, USA).

Logiciel de démélange spectral

Pour l'analyse du cube de données spectral obtenu, nous avons développé un algorithme de démélange spectral en utilisant l'environnement MATLAB. Le spectre de chaque pixel est considéré comme un mélange linéaire d'endmembers connus : F(λ) = Σ aᵢ Gᵢ(λ), où F(λ) est le spectre du pixel, Gᵢ sont les spectres des endmembers, et aᵢ sont les abondances des endmembers. Le but du logiciel de démélange est d'estimer les abondances des endmembers connus en résolvant le problème d'analyse de mélange spectral linéaire (LSMA) dans chaque pixel du cube de données spectral acquis. Supposons que L est le nombre de bandes spectrales, et p est le nombre d'endmembers présents dans un mélange. Alors, le problème LSMA peut être énoncé comme F = Ga + n, où F est le vecteur L × 1 des intensités de pixel, G est la matrice L × p contenant tous les vecteurs d'endmembers, a est le vecteur p × 1 des abondances inconnues, et n est le vecteur d'erreur L × 1. Une méthode basée sur l'erreur des moindres carrés (LSE) pour résoudre le problème LSMA peut être formulée comme la tâche d'optimisation suivante : minₐ{(F − Ga)ᵀ(F − Ga)}, et la solution classique est a(r) = (GᵀG)⁻¹GᵀF. Cependant, une telle solution peut contenir des valeurs négatives pour les abondances, qui n'ont pas de sens physique. Pour résoudre cet obstacle, la tâche d'optimisation LSE doit être modifiée : minₐ{(F − Ga)ᵀ(F − Ga)}, sous réserve de a ≥ 0. Pour résoudre cette tâche, nous utilisons un algorithme itératif, basé sur l'analyse de mélange spectral linéaire à contrainte de non-négativité (NC-LSMA) qui est décrit en détail dans [49, 50]. Après le calcul des abondances pour chaque composant, elles sont cartographiées sous forme de graphiques colormap 2D. Finalement, le logiciel de démélange fournit des images d'intensité des composants correspondants, basées sur les abondances obtenues : Iᵢ(x,y) = aᵢ(x,y) Σλ Gᵢ(λ), où Iᵢ(x,y) est l'intensité intégrale de l'i-ème endmember dans le pixel, et aᵢ(x,y) est l'i-ème abondance.

Expériences animales

Des souris nues BALB/c (Source : The Jackson Laboratory, USA) ont été élevées dans des conditions obscures et aseptiques dans un petit animalier. Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux critères de la Réglementation nationale de la Chine pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Avant l'imagerie, des souris nues mâles (6 semaines, 20 ± 2 g) ont été anesthésiées avec 5 % d'hydrate de chloral (0,06 ml par gramme de poids de souris) par injection intrapéritonéale. Pour l'imagerie PL SWIR in vivo, les nanoparticules ont été suspendues dans du tampon phosphate salin (PBS) 10x et 100 μL de chaque suspension PBS de PNPs, RENPs, ou de leur mélange ont été injectés sous-cutanément dans les souris.

Résultats et discussion

Deux types de NPs photoluminescentes SWIR ont été préparés pour une utilisation en HSI : (1) PNPs post-chargées avec le colorant JB9-08, qui est pratiquement non fluorescent dans les solutions aqueuses [46] mais, comme montré par nous [51], restaure sa fluorescence dans l'eau par post-chargement dans la matrice polymérique des PNPs (Fig. 3a et b) et (2) RENPs NaYF₄:10%Yb³⁺,30%Nd³⁺@CaF₂ coquille-cœur dopées aux ions de terres rares et recouvertes de PAA (Fig. 3c et d). Les ions Nd³⁺ dans le cœur des RENPs peuvent être excités avec une lumière ~ 808 nm (transition ⁴I₉/₂ → ⁴F₅/₂) et transférer l'énergie aux ions Yb³⁺, qui émettent dans la gamme 950–1100 nm avec un pic à ~ 975 nm (transition ²F₅/₂ → ²F₇/₂). Le cœur des RENPs a été recouvert d'une coquille inerte de CaF₂ pour réduire les pertes non radiatives par les défauts de surface et l'interaction avec l'environnement environnant [48]. Les deux nanoformulations présentent une photoluminescence dans la gamme 900–1200 sous excitation à 808 nm (Fig. 3e).

Il convient de noter que les spectres d'émission PL des nanoparticules obtenus avec le spectrofluorimètre ne peuvent pas être utilisés comme endmembers dans le logiciel de démélange spectral pour deux raisons. Premièrement, la sensibilité du système HSI n'est pas corrigée spectralement, contrairement au spectrofluorimètre conventionnel, donc le profil spectral d'émission acquis est différent pour les deux méthodes d'acquisition. Deuxièmement, les images HSI sont collectées avec un pas de 10 nm, bien que la bande passante spectrale du LCTF soit de 20 nm. Cela entraîne un chevauchement du signal dans les images voisines, causant une distorsion du profil spectral obtenu par rapport à celui mesuré avec le spectrofluorimètre. Pour surmonter ces obstacles, les endmembers (profils spectraux des échantillons PNPs et RENPs) ont été acquis avec le système HSI. Dans ce but, les deux types de nanoprobes ont été suspendus dans le PBS et leurs suspensions PBS ont été placées dans des tubes microcentrifuges (Fig. 4a). Il est à peine possible de différencier deux échantillons avec l'imagerie PL conventionnelle, car leurs spectres d'émission PL se chevauchent (Figs. 4b et 3e). En utilisant le système HSI, 31 images PL ont été collectées dans une gamme spectrale de 900 à 1200 nm avec un pas de 10 nm (Fig. 4c). Les profils spectraux des PNPs, RENPs, et fond (BG) ont été calculés à travers la dimension spectrale du cube de données spectral en moyennant le signal dans les zones marquées par des carrés rouges, bleus et verts, respectivement (Fig. 4b). Les profils spectraux obtenus pour les PNPs et RENPs (Fig. 4d) se sont révélés similaires à ceux mesurés par spectrofluorimètre et ont été ultérieurement utilisés comme endmembers pour le démélange spectral. Par la suite, avec les profils spectraux PNPs, RENPs et BG comme endmembers, les abondances des composants correspondants sont calculées et cartographiées sous forme de graphiques colormap 2D (Fig. 4e). Les abondances ont été calculées pour chaque pixel spatial de l'hypercube et ont été représentées comme une valeur de 0 à 1, avec 0 et 1 indiquant l'absence totale et l'abondance totale du composant, respectivement. La somme des abondances de tous les composants dans chaque pixel est égale à 1. Il convient de noter que le logiciel de démélange utilisait un seuillage par l'intensité du signal pour éliminer les erreurs causées par les pixels de faible intensité. Si l'intensité maximale d'un pixel le long de la dimension spectrale était inférieure à 5 % du maximum de tout l'hypercube, un tel pixel était considéré comme entièrement abondant en composant bruit. De plus, les images d'intensité intégrale des PNPs et RENPs ont été calculées en tenant compte des abondances correspondantes et en éliminant le composant fond (Fig. 4f). Comme prévu, à la fois le cartographiage des abondances et les images d'intensité intégrale démontrent l'abondance totale des PNPs dans le tube de droite et des RENPs dans le tube de gauche, avec une légère erreur causée par la diffusion de l'émission PL et l'imperfection de l'algorithme de démélange.

Le démélange spectral est également capable de distinguer le mélange de PNPs et RENPs. Pour démontrer cela, trois tubes microcentrifuges ont été remplis avec des solutions de PNPs, RENPs, et de leur mélange. Après acquisition de l'hypercube et procédure de démélange spectral, le cartographiage des abondances indique la présence totale de PNPs dans le premier tube microcentrifuge, RENPs dans le second, et un mélange des deux dans le troisième (Fig. 5a). La reconstruction d'images d'intensité a été ensuite réalisée pour révéler la distribution d'intensité des signaux PL des PNPs et RENPs dans l'échantillon (Fig. 5b).

Nous avons en outre démontré l'applicabilité de notre méthode HIS au multiplexage des nanoprobes à spectres chevauchants en imagerie PL SWIR in vivo. Une souris nue a été anesthésiée et injectée sous-cutanément avec PNPs, RENPs, et un mélange des deux. L'imagerie NIR avec filtre passe-long 850 nm montre trois taches photoluminescentes indiscernables (Fig. 6a). Après réalisation de l'HSI et analyse, le cartographiage des abondances montre des abondances totales de PNPs et RENPs dans les sites d'injection supérieur et inférieur, respectivement, tandis que le mélange des deux a été identifié dans le site d'injection gauche (Fig. 6b). En outre, pour acquérir la distribution d'intensité PL, la reconstruction d'intensité a été effectuée (Fig. 6c). En ajustant la valeur de seuillage dans le logiciel de démélange à 15 % (estimée empiriquement), il est devenu possible d'éliminer le bruit dans les zones adjacentes aux taches d'émission (Fig. 6d). De tels résultats indiquent qu'à la différence de la modalité d'imagerie PL conventionnelle, qui utilise des filtres optiques passe-long ou passe-bande, l'HSI non seulement est capable de cartographier la distribution d'intensité dans l'échantillon, mais peut également multiplexer les composants présents dans le mélange en identifiant le profil spectral d'intensité dans chaque pixel de l'image.

Ainsi, la combinaison de l'acquisition HSI et du traitement par démélange spectral a été appliquée dans ce travail pour obtenir une imagerie multiplexée des nanoprobes PL SWIR à spectres chevauchants. Quelques questions doivent toutefois être considérées quant à l'applicabilité de la modalité HSI. Premièrement, en raison de l'acquisition spectralement étroite, chaque image HSI traite une intensité de signal relativement faible (en particulier dans le cas de l'émission PL spectralement large provenant des molécules organiques). De plus, une augmentation de la puissance du laser d'excitation PL en imagerie biologique est limitée par le danger de dommages tissulaires (ou phototoxicité). Cela entraîne des exigences plus élevées pour la brillance des sondes PL et leur photostabilité, car l'HSI peut nécessiter un temps d'acquisition d'un ordre de grandeur plus long par rapport à l'imagerie PL conventionnelle. Il convient également de noter que l'analyse de mélange linéaire et l'algorithme de démélange spectral peuvent fonctionner de manière satisfaisante pour l'imagerie PL multiplexée de tissus biologiques dans la gamme spectrale où la transmittance des tissus ne change pas beaucoup. En revanche, si la transmittance des tissus a des caractéristiques distinctives dans la gamme spectrale de l'HSI, le modèle de mélange spectral linéaire peut être difficilement applicable (en particulier dans le cas de tissus plus profonds) et des modèles non linéaires peuvent être envisagés.

Conclusions

En conclusion, nous avons développé une technique de bioimagerie hyperspectrale SWIR et l'avons appliquée pour le multiplexage de nanoparticules émettant dans la gamme spectrale SWIR. Deux types de nanoparticules avec des spectres PL chevauchants, qui sont indistinguables en imagerie conventionnelle, ont été multiplexés avec succès par leurs profils spectraux PL en utilisant l'acquisition hyperspectrale conjointement avec l'algorithme d'analyse de mélange spectral linéaire. La méthode développée a été employée avec succès pour l'imagerie multiplexée de nanoparticules PL SWIR à la fois dans des suspensions d'échantillons et injectées chez de petits animaux. Avec la bioimagerie SWIR ayant une résolution supérieure à une plus grande profondeur d'imagerie, l'approche HSI SWIR recèle un grand potentiel pour une utilisation dans diverses applications nécessitant une imagerie multiplexée avec des nanoprobes PL NIR-SWIR. De plus, comme la bioimagerie SWIR est à un stade très précoce, il y a beaucoup de place pour le développement d'applications biomédicales de sondes PL en combinaison avec l'HSI.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié.

Abréviations

BG :

Arrière-plan (Background)

HSI :

Imagerie hyperspectrale (Hyperspectral imaging)

LCTF :

Filtre à cristal liquide accordable (Liquid crystal tunable filter)

NIR :

Proche infrarouge (Near-infrared)

NPs :

Nanoparticules (Nanoparticles)

PL :

Photoluminescence

PNIPAM :

Poly-N-isopropylacrylamide

PNPs :

Nanoparticules polymères (Polymeric nanoparticles)

PS :

Polystyrène (Polystyrene)

RENPs :

Nanoparticules fluorées dopées aux terres rares (Rare-earth doped fluoride nanoparticles)

SWIR :

Infrarouge à ondes courtes (Short-wave infrared)

TEM :

Microscopie électronique à transmission (Transmission electron microscopy)