Biosenseur à transistor à effet de champ graphène magnétique pour la détection ultra-sensible d'ADN simple brin

Résumé

Dans ce travail, nous présentons un biosenseur à transistor à effet de champ graphène magnétique (MGFET) fabriqué par transfert d'un film de graphène par dépôt chimique en phase vapeur (CVD) sur un substrat en verre pour former le canal conducteur et la couche de détection. La surface du graphène est fonctionnalisée avec de l'ester succinimidyl de l'acide 1-pyrenebutanoïque (PBASE), qui agit comme une ancre moléculaire pour immobiliser un aptamère sonde. L'ADN simple brin complémentaire (cDNA) marqué magnétiquement est capturé par hybridation avec l'aptamère, et l'interaction est transduite en un changement d'impédance mesurable. Sous un champ magnétique modulé périodiquement, l'impédance du MGFET présente des oscillations dont l'amplitude est directement proportionnelle à la concentration en cDNA. En utilisant ce principe, le capteur détecte l'ADN simple brin avec une limite de détection de 1 pM. Le comportement observé est rationalisé par un modèle dans lequel la force magnétique courbe le complexe ADN-bille, modulant ainsi la capacitance de double couche du canal de graphène. En appliquant un champ magnétique périodique, l'impédance peut être échantillonnée répétitivement, permettant l'amélioration du rapport signal/bruit (SNR) par intégration sur plusieurs périodes. Cette étude démontre un biosenseur ADN hautement sensible et suggère son applicabilité potentielle à d'autres biomolécules et essais cellulaires.

Introduction

La détection de l'ADN est cruciale pour la recherche en biologie moléculaire et le diagnostic des troubles génétiques [1,2,3]. Au cours de la dernière décennie, des biosenseurs basés sur la fluorescence [4,5], l'électrochimie [6–9] et les transistors à effet de champ (FET) [10–13] ont été développés à cet effet, les capteurs de type FET attirant une attention particulière en raison de leur sensibilité et spécificité inhérentes. Kaisti et al. ont introduit un FET fonctionnalisé par acide peptidique-nucléique pour la détection d'ADN simple brin non marqué [12], tandis que Kim et al. ont fabriqué un capteur de charge ADN basé sur la technologie CMOS (complementary-metal-oxide-semiconductor) [13]. Le graphène, avec sa surface exceptionnelle, sa conductivité électrique et sa mobilité de porteurs, a émergé comme une plateforme idéale pour construire des biosenseurs FET [14–16]. Cai et collègues ont rapporté un GFET (graphene FET) capable de détection ADN ultrasensible via hybridation acide peptidique-nucléique [15], et notre groupe a précédemment démontré un GFET multi-canal pour étudier la cinétique de liaison ADN et les mismatches de paires de bases [16]. Dans les GFET conventionnels, une électrode de grille externe génère un champ électrique qui établit une double couche à l'interface graphène-électrolyte [17–19], modulant ainsi la conductance du dispositif. Des études récentes ont atteint des limites de détection femtomolaires avec des GFET [20,21] ; cependant, ces hautes sensibilités reposent sur des analyseurs semi-conducteurs coûteux et des électrodes de référence Ag/AgCl, limitant le déploiement pratique. Pour surmonter ces défis, nous avons conçu un FET graphène magnétique (MGFET) qui utilise un champ magnétique, plutôt qu'une grille électrique, pour moduler le canal de graphène. Le MGFET incorpore un film de graphène CVD transféré sur un substrat en verre flanqué d'électrodes d'oxyde d'indium-étain (ITO). Le graphène est fonctionnalisé avec PBASE, permettant l'attachement covalent d'un aptamère sonde qui capture le cDNA marqué magnétiquement. Lorsqu'il est soumis à un champ magnétique périodique, l'impédance du MGFET oscille d'une manière qui corrèle avec la concentration en cDNA. Cette approche magnétique élimine le contact direct avec l'électrode, simplifiant l'intégration et élargissant l'applicabilité. Les sections suivantes détaillent la fabrication, le système de détection et le mécanisme de détection sous-jacent de ce nouveau biosenseur MGFET.

Méthodes

Matériaux et instruments

Un substrat en verre avec électrodes ITO provenait de Hua Nan Xiang Cheng Ltd. (Chine). L'aptamère sonde, le cDNA et l'ADN mal apparié ont été achetés auprès de Sangon Biotech Inc. (Shanghai, Chine). La séquence de l'aptamère est (5′‑NH₂‑TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC‑FAM‑3′) ; la séquence d'ADN complémentaire (cDNA) est (5′‑NH₂‑GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA‑3′) ; l'ADN complètement mal apparié est (5′‑NH₂‑TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC‑3′) ; et l'ADN mal apparié à une base est (5′‑NH₂‑GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA‑3′). Le PBASE et le diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été obtenus de Sigma-Aldrich (Shanghai, Chine). Des nanobilles magnétiques (MB) avec fonctionnalisation carboxyl (10 mg mL⁻¹) ont été acquises auprès de Xianfeng Nano Material Technology Co., Ltd. (Nanjing, Chine). Le chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide, l'hydroxysuccinimide, le dodécylbenzenesulfonate de sodium (SDS) et le tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Shanghai, Chine).

Un spectromètre Raman (SPEX-1403, SPEX) a caractérisé la qualité du graphène et confirmé la fonctionnalisation PBASE. La photométrie de fluorescence (LS55, PerkinElmer) a quantifié le couplage des nanoparticules magnétiques au cDNA. Un système d'acquisition de données personnalisé a enregistré l'impédance MGFET en temps réel.

Couplage du cDNA aux MB

Après sonication pendant 20 min, 20 µL de suspension de MB à 4 mg mL⁻¹ ont été mélangés avec 200 µL d'EDC à 2 mg mL⁻¹ et 200 µL de NHS à 2 mg mL⁻¹ pendant 15 min pour activer les MB [22,23]. Par la suite, 20 µL de cDNA ont été ajoutés et incubés pendant 2 h à température ambiante avec agitation douce. Un champ magnétique a ensuite enrichi les conjugués MB/cDNA, qui ont été lavés trois fois avec PBS et resuspendus pour une utilisation en aval.

Fabrication des MGFET

Les MGFET ont été fabriqués en un processus en trois étapes : (1) un film de graphène CVD a été transféré sur une plaque de verre servant de canal conducteur entre les deux électrodes ITO (Fig. 1a). (2) Une solution de PBASE à 10 mM dans le DMSO a été incubée sur le graphène pendant 12 h à température ambiante, permettant l'empilement π–π avec le réseau de graphène (Fig. 1b). L'excès de PBASE a été éliminé par rinçage avec DMSO et PBS. (3) Une solution d'aptamère sonde à 2 µM a été introduite et incubée pendant 4 h à température ambiante, permettant le couplage covalent via l'ester NHS du PBASE (Fig. 1c). Finalement, l'aptamère non lié a été lavé avec 0,2 % SDS trois fois.

Résultats et discussion

Caractérisation des MGFET

Le film de graphène CVD a été transféré avec succès sur le substrat en verre, comme confirmé par le spectre Raman (Fig. 2). La présence des pics G, D et 2D indique un graphène de haute qualité ; le rapport I_2D/I_G confirme un film multicouche, tandis que le faible rapport I_D/I_G témoigne de défauts minimes [24–26].

L'attachement direct d'aptamères au graphène pur est difficile en raison de l'absence de groupes fonctionnels ; par conséquent, PBASE sert de lien ancré par π–π. Le groupe succinimide du PBASE réagit avec le NH₂ 5′ de l'aptamère via la chimie NHS (Fig. 1c). L'immobilisation réussie de l'aptamère a été confirmée par l'intensité de fluorescence du marqueur FAM 3′ (Fig. 3). La fluorescence augmentait avec la concentration d'aptamère jusqu'à un plateau à ~2 µM, indiquant la saturation de la surface. Par conséquent, les expériences ultérieures ont utilisé une concentration d'aptamère de 2 µM.

Caractérisation des MB/cDNA

La microscopie électronique à transmission a révélé que les MB ont un diamètre de ~7 nm (Fig. 4a,b). Pour maximiser l'efficacité de capture, une concentration de MB de 4 mg mL⁻¹ a été employée pour l'activation. L'efficacité de couplage a été surveillée en mesurant la diminution de la fluorescence FAM dans le surnageant (Fig. 4d). Un enrichissement complet de 10 nM cDNA a été atteint, comme en témoigne le niveau de fluorescence du surnageant revenant à celui du PBS.

Analyse de l'intensité du champ magnétique

Après une incubation de 10 min des MB/cDNA avec les MGFET, les MB non liés ont été éliminés par lavages PBS, laissant seulement les MB/cDNA sur le capteur (Fig. 1d). Un aimant permanent monté sur un moteur rotatif appliquait un champ magnétique périodique (Fig. 1e). L'impédance du MGFET a été enregistrée à l'aide d'un dispositif de détection personnalisé.

La relation entre l'intensité du champ magnétique et l'impédance du MGFET a été étudiée pour identifier les paramètres de champ optimaux (Fig. 5). Dans les MGFET, la force magnétique courbe le complexe MB/cDNA, modifiant la distance entre le complexe et la surface du graphène, ce qui module à son tour la capacitance de double couche. Trois régimes ont été observés : (1) <100 mT, où la force magnétique est insuffisante pour courber l'ADN, produisant un changement d'impédance négligeable ; (2) 100–200 mT, où le cintrage se produit rapidement, produisant une réponse d'impédance prononcée ; et (3) >220 mT, où la tige d'ADN atteint sa limite de cintrage, et l'impédance se stabilise (Fig. 5b). Ce modèle de tige élastique s'aligne avec les rapports antérieurs sur la mécanique de l'ADN [29,30].

Détection du cDNA

Avec un champ magnétique fixe de 240 mT, les changements d'impédance ont été enregistrés sur une gamme de concentrations de MB/cDNA (Fig. 6a). L'application du champ magnétique périodique a induit une oscillation d'impédance claire. Pour supprimer le bruit, un algorithme d'intégration d'échantillonnage (SIA) a été employé : (1) les points de données collectés pendant la période non magnétique (T₀) ont été normalisés à zéro ; (2) les points pendant chaque période magnétique (T_M) ont été échantillonnés et moyennés ; après quatre cycles, le changement d'impédance périodique a été extrait (Fig. 6b). Cette approche améliore efficacement le SNR en exploitant l'échantillonnage répété.

Le changement d'impédance présentait une relation linéaire avec la concentration en cDNA (Fig. 7). La haute sensibilité découle de (1) le cintrage mécanique du complexe MB/cDNA, qui amplifie la modulation de la double couche de graphène, et (2) le champ magnétique périodique qui permet la suppression du bruit basée sur SIA. En augmentant le nombre de périodes magnétiques, le SNR du système peut être encore amélioré.

Sélectivité des MGFET

La sélectivité a été évaluée en utilisant un ADN complètement mal apparié et un ADN mal apparié à une base, chacun couplé aux MB. Après 10 min d'incubation avec les MGFET et lavage PBS, le complexe MB/ADN complètement mal apparié a été largement éliminé, résultant en un changement d'impédance négligeable (Fig. 8a), confirmant une haute sélectivité. L'ADN mal apparié à une base a produit un changement d'impédance légèrement inférieur au brin complètement complémentaire mais supérieur au contrôle non complémentaire, démontrant que le capteur peut discriminer les mismatches à une base (Fig. 8b). Bien que la spécificité intrinsèque de l'aptamère gouverne la sélectivité, l'architecture MGFET contribue à la sensibilité globale.

Conclusions

Nous avons développé un biosenseur FET graphène magnétique qui exploite l'ADN marqué magnétiquement et un champ magnétique périodique pour transduire les événements de liaison en oscillations d'impédance. La force magnétique courbe mécaniquement le complexe MB/cDNA, modulant la double couche de graphène et produisant une limite de détection de 1 pM pour l'ADN simple brin. Le champ magnétique périodique permet la suppression du bruit basée sur l'intégration de signal, améliorant davantage la sensibilité. Au-delà de la détection d'ADN, cette plateforme offre un cadre polyvalent pour mesurer les propriétés mécaniques des acides nucléiques et pour détecter d'autres biomolécules ou cellules.