Détection rapide de Rongalite via un test de bandelette à flux latéral en sandwich à l'aide d'une paire d'aptamères

Contexte

La rongalite (hydroxyméthylsulfinate de sodium) est un réactif industriel généralement utilisé pour la teinture en cuve [1] ou pour la polymérisation en émulsion [2] en tant qu'agent réducteur. La rongalite peut également être trouvée dans les conditionneurs d'eau (par exemple, la réduction du chlore et de la chloramine) [3], dans les décolorants cosmétiques commerciaux malgré la génération de formaldéhyde (un cancérogène humain connu), ou même dans les formulations pharmaceutiques en tant qu'antioxydant [4] . Ce composé a également provoqué des effets indésirables en Chine après son incorporation dans plusieurs produits agroalimentaires [5]. Ce test développé fournit une plate-forme fiable de détection de rongalite sur site et peut contribuer à résoudre les problèmes de sécurité alimentaire.

Les aptamères, les oligonucléotides simple brin et les oligopeptides ont été considérés comme des alternatives parfaites aux anticorps en raison de leur spécificité élevée, de leur production facile et reproductible, de leur modification facile et de leur réponse moins immunogène [6]. Des études récentes ont révélé le fort potentiel des aptamères en tant que biosondes pour le ciblage de médicaments, la biodétection et le développement de nouveaux médicaments [7]. Des essais électrochimiques [8] et enzymatiques d'aptamères [9] impliquant un couple d'aptamères ont été développés comme un outil prometteur pour la détection des rongalites. Cependant, ces méthodes souffrent généralement de temps d'analyse longs et de procédures complexes, ce qui entrave leurs applications [10].

Le test de bandelette à flux latéral (LFSA, également appelé test de bandelette) a été développé pour la première fois en 1956 comme une extension logique de la technologie du test d'agglutination au latex [11]. En tant qu'approche en une seule étape, LFSA a attiré une attention considérable pour la détection sur site de plusieurs analytes en raison de son format convivial, de son faible coût de production, de son utilisation rapide et de sa stabilité à long terme dans un large éventail de conditions [ 12]. Malgré ces caractéristiques positives, les applications pratiques de la plate-forme de bandelettes à flux latéral à base d'aptamère n'ont pas encore été commercialisées, et seuls quelques tests de bandelettes chromatographiques à base d'aptamère ont été rapportés pour la détection de la rongalite dans les échantillons alimentaires [13] . Compte tenu de la fréquence élevée des affaires de sécurité alimentaire et de l'utilisation courante de la rongalite en tant qu'additif alimentaire illégal, il est nécessaire de développer un LFSA à base d'aptamère pour la détection sur site et rapide de ce composé dans les échantillons d'aliments.

Deux types de capteurs aptamères à flux latéral peuvent être développés, à savoir les capteurs compétitifs et de type sandwich [14]. La plate-forme de type sandwich est parfaitement adaptée lorsqu'un couple d'aptamères est disponible pour une molécule cible spécifique. Dans le présent travail, des nanoparticules d'or spécifiques (AuNP), qui sont connues pour être les nanomatériaux les plus prometteurs pour le développement de capteurs d'aptamères (par exemple, propriétés physico-chimiques), ont été utilisées pour le développement d'une sonde de détection d'aptamère à bande sandwich à flux latéral. Pendant ce temps, des processus de conjugaison d'aptamère ont déjà été démontrés sur des AuNP via une chimisorption ou une adsorption physique qui fournit une plate-forme simple mais sensible pour le capteur d'aptamère qui a ensuite été utilisé comme sonde de signalisation dans cette étude [15]. En raison des avantages dérivés de l'utilisation des AuNPs et des aptamères, un test de flux latéral visible, rapide, en une étape et sur site a été développé pour l'analyse de la rongalite dans les échantillons alimentaires. Afin de réaliser ce capteur aptamère de type sandwich, deux sondes aptamères (A09/B09) ont été utilisées servant de sondes de capture et de signalisation. Les résultats positifs de ce biocapteur ont été confirmés par la chromatographie liquide haute performance (HPLC).

Méthodes

Matériaux et réactifs

Rongalite a été fourni par Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. HAuCl₄ (citrate trisodique déshydraté) a été acheté chez Sigma Aldrich (USA). NaCl, BSA, saccharose, formol, PEG20000 et Tween20 provenaient de Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd.

Les membranes NC (c'est-à-dire pall 90, pall 170 et Millipore 135) proviennent de Pall Corporation et de Millipore Corporation, séparément, et achetées auprès de Jiening Biotech Company.

Des échantillons de nourriture, de l'ersi (fines tranches carrées de gâteau de riz en Chine), des nouilles, du tofu et du glucono-δ-lactone-tofu, ont été achetés sur les marchés voisins.

Préparation d'aptamères via l'évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX)

Le procédé SELEX comprend les étapes suivantes (Fig. 1) :(i) incubation de la cible avec une banque d'ADN aléatoire, (ii) isolement de l'ADN lié à la cible, (iii) amplification de l'ADN par amplification en chaîne par polymérase (PCR) , (iv) préparation d'ADN simple brin pour la bibliothèque du tour suivant, (v) répétition des étapes i à iv pendant 5 à 15 cycles impliquant un criblage par compteur d'intervalle avec des substances non cibles pour éliminer les ADNsb non spécifiques, et (vi) clonage final et séquençage de la bibliothèque enrichie [16].

Processus typique de sélection d'aptamères (SELEX)

Les aptamères ont été criblés en suivant les étapes décrites précédemment. En bref, une bibliothèque initiale d'aptamères d'ADNsb constituée de nucléotides 82-mères avec une longue séquence randomisée centrale à base de 40 de chaque aptamère a été synthétisée (Tsingke Biological Technology). La séquence randomisée du pool d'aptamères ssDNA est 5′-GACATATTCAGTCTGACACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3′, où N signifie un nucléotide randomisé de A, G, C ou T.

Dans cette recherche, l'amorce 1 (5′-GACATATTCAGTCTGACAGC-3′) et l'amorce 2 (5′-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3′) ont été utilisées pour l'amplification de la bibliothèque.

Pour cribler les aptamères se liant spécifiquement à la rongalite, la bibliothèque d'ADNsb aléatoire synthétisée a été ajoutée à la plaque avec de la rongalite. Ensuite, l'ADNsb non lié a été éliminé par lavage; l'ADNsb lié a été récupéré et amplifié par PCR. L'affinité de liaison des aptamères augmentait progressivement à mesure que le cycle de sélection augmentait.

La spécificité et K _d la valeur des aptamères individuels a été déterminée de la même manière que les méthodes de Tang [17].

Les séquences d'aptamères utilisées dans ce travail étaient les suivantes :

• Aptamère primaire A09,

  5′-Biotine-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC

• Aptamère secondaire B09,

  5′-Biotine-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3′

Ces séquences d'aptamères (A09 et B09) ont été synthétisées et achetées auprès de Tsingke Biological Technology.

Production d'AuNP

Les AuNPs ont été synthétisés via la réduction de citrate de HAuCl₄ protocole [18]. La production monodispersée d'AuNPs de taille adéquate a été confirmée par spectrophotométrie UV/Vis (Thermo Scientific™ Evolution 60S). Des AuNPs de forme sphérique (environ 40 nm de diamètre) et de couleur rouge foncé ont été synthétisés. La taille de ces AuNP non modifiées a été estimée en utilisant la loi de Beer-Lambert à 530 ± 2 nm et la microscopie électronique à transmission (Fig. 2) (JEOL Ltd. JEM-1011).

L'aptamère secondaire B09 conjugué avec AuNPs a été préparé en suivant les protocoles rapportés [18]. En bref, 1 mL des AuNP tels que préparés a été incubé avec 4 μL de la solution secondaire d'aptamère B09 (100 μM), et le mélange a été conservé dans un tiroir à température ambiante pendant au moins 16 h. Une molaire de NaCl a ensuite été ajoutée goutte à goutte au flacon en secouant doucement à la main jusqu'à atteindre une concentration finale de 0,1 M dans le mélange. Les flacons ont été conservés dans un tiroir pendant au moins 1 jour avant utilisation. Les aptamères thiolés non conjugués ont été éliminés par centrifugation à 12.000g pendant 20 min à 4 °C. Les tubes ont été retirés de la centrifugeuse et un liquide surnageant clair a été obtenu, les nanoparticules étant au fond des tubes. Le mélange a été centrifugé pendant 5 min supplémentaires en cas de surnageant de couleur rouge. Le surnageant a été doucement pipeté et les nanoparticules ont finalement été dispersées dans 1 mL de tampon PBS 0,01 M (solution saline tamponnée au phosphate) (pH = 7,4) contenant 5 % de BSA, 5 % de saccharose, 1 % de PEG20000 et 0,05 % de Tween20.

Conception de bande d'écoulement latéral

Le LFSA a été conçu comme le montre la Fig. 3. En bref, la bande contenait plusieurs tampons qui se chevauchaient sur un échantillon de carte de support (GF-08, 20 × 300 mm), conjugué d'or, membrane de nitrocellulose (NC) (Pall 90, 60 × 300 mm) et d'absorption (H-5076, 20 × 300 mm). La longueur du chevauchement était de 2 mm. Le tampon d'échantillon a été immergé dans un tampon PBS 0,01 M (pH =  7,4) contenant 3 % de BSA et 0,05 % de Tween20 et ensuite séché à 37 °C pendant 2 h. Le tampon d'or conjugué a été traité avec un tampon PBS 0,01 M (pH  =  7,4) contenant 5 % de BSA, 5 % de saccharose, 1 % de PEG20000 et 0,05 % de Tween20. Les AuNPs fonctionnels ont ensuite été pulvérisés avec un pulvérisateur (XYZ3010-1429) sur le tampon d'or conjugué traité. Un microlitre d'aptamère biotine-A09 (10 μM) a été incubé avec 10 μL de streptavidine (1 mg/mL) pendant 1 h à 4 °C. La streptavidine conjuguée à l'aptamère a ensuite été recouverte d'un distributeur (XYZ3010-1429) sur une membrane NC pour former la ligne de test, tandis que la streptavidine (1 mg/mL) a été recouverte de l'instrument pour former la ligne de contrôle. Après cela, la membrane NC traitée a été séchée à 37 °C pendant 2 h pour immobilisation. Enfin, les bandelettes ont été assemblées et le LFSA a été découpé en bandes de 40 mm de large et conservé à 37 °C pendant la nuit jusqu'à utilisation.

Images TEM d'AuNP (40 nm)

Configuration typique des bandelettes réactives à flux latéral (format sandwich)

Test de spécificité

Quatre-vingt microlitres d'une solution de rongalite (10 μg/mL) ont été ajoutés au tampon d'échantillon des bandelettes assemblées. Cette étape a été répétée pour les autres contre-cibles, y compris le formol et l'eau déminéralisée pour les tests de spécificité. De l'eau déminéralisée a été utilisée comme témoin. Une ligne rouge devrait apparaître dans la zone bordée attendue. Chaque contrôle a été répété deux fois.

Test dose-dépendant

Semblable au test spécifique, des solutions de rongalite avec des concentrations variables (0,8, 1, 5 et 10 μg/mL) ont été préparées. Quatre-vingt microlitres de la solution de rongalite ont été ajoutés au tampon échantillon des bandes assemblées. L'observation de la couleur rouge dans les 15 minutes sur la ligne de test a été considérée comme le critère de détermination de la limite de détection.

Test d'échantillon alimentaire

Pour évaluer la faisabilité et la précision de ce nouveau LFSA, cinq échantillons d'aliments contenant éventuellement de la rongalite ajoutée ont été collectés sur un marché autour de l'institut. Un gramme d'échantillon a été extrait avec 10 mL d'eau. Ensuite, 80 μL de chaque solution d'extrait d'échantillon ont été appliqués sur la bande d'écoulement latéral à base d'aptamère pour la détection de la rongalite. Ces résultats ont été confirmés par chromatographie liquide haute performance (HPLC).

Résultats et discussion

Les constantes de spécificité et de dissociation (K _d ) des Aptamères sélectionnés

Différentes concentrations d'aptamères A09 et B09 ont été incubées avec une quantité fixe de rongalite. Les courbes de saturation traçant l'absorbance mesurée à 450 nm par rapport à la concentration d'aptamère d'entrée correspondante sont présentées sur la figure 4a. Une analyse de régression non linéaire a été utilisée pour K _d calcul de valeur. Le K _d la valeur de A09 est 61,12 ± 16,36 nM et B09 est de 39,81 ± 12,73 nM. Comme le montre la figure 4b, l'affinité de liaison entre A09/B09 et la rongalite est élevée.

un Mesure du K _d valeur de A09 et B09. GraphPad Prism a été utilisé pour effectuer une analyse d'ajustement de cure non linéaire pour K _d calcul. b L'affinité de liaison spécifique entre A09/B09 et la rongalite

Spécificité et sensibilité

L'aptamère A09 marqué à la biotine (capteur d'aptamère) était lié à la streptavidine initialement tapissée sur la membrane. Cette ligne a été choisie comme ligne de test. Pendant ce temps, la streptavidine a été alignée sur la zone de contrôle.

Comme le montre la figure 5a, une fois que l'aptamère secondaire AuNP (en tant que sonde de signalisation) est lié à la rongalite, l'aptamère primaire bordé sur la zone de test est lié à un autre site de ce composé. Une ligne rouge générée par les AuNP doit apparaître sur la zone de test en cas d'analyse positive. En ce qui concerne l'expérience de contrôle, la streptavidine sur la zone de contrôle capture l'aptamère B09 marqué AuNP restant modifié avec de la biotine, fournissant ainsi un signal de contrôle à tout moment.

Spécificité (a ) et la sensibilité (b ) de LFSA pour la rongalite. un 80 μL d'une solution de rongalite (10 μg/mL) ont été ajoutés au tampon d'échantillon des bandelettes assemblées. Cette étape a été répétée pour les autres contre-cibles dont le formol pour les tests de spécificité. De l'eau déminéralisée a été utilisée comme témoin. b Des solutions étalons de Rongalite avec des concentrations variables (0, 0,8, 1, 5 et 10 μg/mL) ont été préparées. 80 μL de solutions étalons ont été pipetés sur le tampon d'échantillon, et l'observation de la couleur rouge dans les 15 min sur la ligne de test a été considérée comme le critère de détermination de la limite de détection

Comme le montre la figure 5b, le résultat montre que la rongalite a été facilement détectée à l'œil nu à des concentrations aussi faibles que 1 μg/mL.

Ces échantillons d'aliments ont été analysés via le LFSA développé ici, et les résultats sont présentés dans le tableau 1.

Fait intéressant, la ligne de contrôle n'a pas été maintenue après chaque LFSA. Des concentrations élevées de rongalite ou d'ions de sel peuvent entraîner un faible signal sur la zone de contrôle. Par conséquent, la composition du tampon de remise en suspension affecte de manière critique les performances du test de bandelette. Selon les résultats obtenus, un tampon PBS 0,01 M (pH = 7,4) contenant 5 % de BSA, 5 % de saccharose, 1 % de PEG20000 et 0,05 % de Tween20 a été choisi comme tampon de remise en suspension.

La composition des divers tampons a un effet considérable sur les performances du test sur bandelettes. Parmi les différentes alternatives, la membrane NC s'est avérée être le support solide le plus approprié pour l'adsorption et l'hybridation des acides nucléiques. NC a été largement utilisé comme tampon de signal dans la bande d'écoulement latéral car il fournit des débits suffisants [19]. Différents types de membranes NC de tailles différentes avec des débits respectifs peuvent convenir à ces dosages. Dans ce travail, trois membranes NC couramment utilisées (c'est-à-dire pall 90, pall 170 et Millipore 135) achetées auprès de Jiening Biotech Company ont été testées. Pall 90 a été choisi ici comme la membrane NC la plus appropriée pour LFSA.

De nombreuses technologies ont été développées pour la détection des rongalites. Cependant, peu ont été largement appliqués dans la détection sur site, principalement en raison des coûts élevés associés et des protocoles complexes, tels que GC et HPLC, qui sont lourds pour l'opérateur quotidien. LFSA, une approche en une seule étape, est devenue une plate-forme parfaite en raison de son format convivial, de son faible coût de production et de sa commodité. Malgré la moins bonne sensibilité que les bandelettes de chromatographie, la LFSA serait une méthode prometteuse dans le domaine des tests au point de service.

Le LFSA a toujours une sensibilité inférieure à celle des bandelettes chromatographiques. De plus, les technologies LFSA utilisant des aptamères présentent des avantages inhérents par rapport au dosage immunologique à flux latéral (LFIA, méthode basée sur les anticorps) et ce quelles que soient les avancées récentes dans ce domaine. Bien que des tests similaires puissent également être conçus à l'aide d'anticorps, les capteurs aptamères offrent une stabilité et des avantages à faible coût. En outre, les aptamères sont plus flexibles pour développer différents formats car ils sont composés d'acides nucléiques ayant des caractéristiques d'hybridation intra- et intermoléculaire, de réplication enzymatique et de détermination de séquence facile. En vertu de ces propriétés positives, de nombreux capteurs aptamères ont été développés pour les dosages multiplexés.

De plus, le LFSA peut utiliser différents marqueurs, notamment les points quantiques récemment développés [20] et les phosphores à conversion ascendante [21]. Cependant, parmi toutes les étiquettes signalées, les AuNP sont les plus largement utilisées pour la LFSA. La propriété la plus remarquable du marqueur Au réside dans sa capacité à colorer la membrane NC permettant une observation directe à l'œil nu. Cette caractéristique différencie LFSA des méthodes de laboratoire coûteuses actuelles, faisant de cette technologie un outil d'analyse pratique.

Les tests au point de service (POCT) ont été proposés comme un outil idéal pour réduire les coûts de ces tests. La plateforme de biocapteurs LFSA, le test le plus connu, est actuellement utilisée pour la POCT [22]. La plateforme de biocapteurs LFIA comprend principalement des formats sandwich et compétitifs (ou d'inhibition). En général, les dosages en format sandwich sont conçus dans le cas de molécules cibles ayant au moins deux épitopes. Un double aptamère lié à la rongalite à deux sites de liaison différents a été développé ici contenant des sondes de capture et de signalisation assemblées dans le format de type sandwich.

Conclusions

Un LFSA simple et peu coûteux avec un format sandwich a été développé avec succès pour la détection rapide sur site de la rongalite. L'essai impliquait un couple d'aptamères conjugués à des AuNPs. Après avoir optimisé certains paramètres clés, le test développé a fourni une sensibilité élevée avec des valeurs limites de détection aussi basses que 1 μg/mL. Cette technologie pourrait être facilement utilisée pour étudier la contamination d'échantillons d'aliments par la rongalite. Ce test fournit une plate-forme fiable de détection de rongalite sur site et peut contribuer à résoudre les problèmes de sécurité alimentaire.

Abréviations

AuNP :

Nanoparticules d'or

HPLC :

Chromatographie liquide haute performance

LFIA :

Dosage immunologique à flux latéral

LFSA :

Dosage par bandelette à flux latéral

Membrane NC :

Membrane nitrocellulosique

POCT :

Tests au point de service

SELEX :

Evolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel

TEM :

Microscopie électronique à transmission