Détection rapide sur site de la rongalite dans les aliments par test à flux latéral sandwich à base d'aptamères

Résumé

Nous présentons un test à flux latéral (LFSA) rapide et convivial qui utilise deux aptamères hautement spécifiques — A09 et B09 — fonctionnalisés avec des nanoparticules d'or (AuNPs) pour détecter la rongalite, un réactif dangereux occasionnellement utilisé comme additif alimentaire. L'aptamère A09 biotinylé est immobilisé sur une membrane de nitrocellulose enduite de streptavidine comme sonde de capture, tandis que l'aptamère B09 conjugué aux AuNPs sert de sonde de signalisation. Le test fournit une ligne rouge nette à la zone de test pour des concentrations de rongalite aussi faibles que 1 µg mL⁻¹, observable à l'œil nu en 15 minutes, le rendant idéal pour le criblage sur site de produits agricoles et alimentaires.

Contexte

La rongalite (sulfinate d'hydroxyméthyle de sodium) est largement employée dans la teinture industrielle et la chimie des polymères comme agent réducteur. Cependant, son addition involontaire ou intentionnelle à des denrées alimentaires a causé de graves problèmes de santé, notamment la libération de formaldéhyde et des effets indésirables rapportés en Chine [5]. Des méthodes de détection fiables et rapides sont donc essentielles pour garantir la sécurité alimentaire et la santé publique.

Les aptamères — molécules d'ADN ou ARN simple brin — offrent des avantages distincts sur les anticorps : ils sont synthétisés chimiquement avec une haute cohérence de lot, présentent une faible immunogénicité et peuvent être facilement modifiés pour diverses plateformes de détection [6]. Bien que des tests aptamériques électrochimiques et à liaison enzymatique existent pour la rongalite, ils nécessitent souvent une instrumentation complexe et des temps d'analyse prolongés [10]. En contraste, les tests à flux latéral (LFSA) fournissent une solution en une étape, portable et peu coûteuse adaptée aux tests au point de soin.

À ce jour, seulement une poignée de tests chromatographiques à base d'aptamères ont ciblé la rongalite [13]. Face à la surveillance réglementaire croissante et à la prévalence des additifs illicites, nous avons développé un LFSA format sandwich qui exploite la spécificité de deux aptamères et la clarté optique des AuNPs, permettant une détection rapide sur site de la rongalite dans diverses matrices alimentaires.

Méthodes

Matériaux et réactifs

La rongalite provenait de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Le chlorure d'or(III) trihydraté (HAuCl₄) et le citrate de trisodium étaient achetés chez Sigma-Aldrich (USA). Les réactifs de support (NaCl, BSA, saccharose, PEG₂₀₀₀₀, Tween-20) étaient obtenus de Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd. Les membranes de nitrocellulose (NC) (Pall 90, Pall 170, Millipore 135) étaient fournies par Pall Corporation et Millipore Corporation via Jiening Biotech Company. Les échantillons alimentaires — gâteau de riz (ersi), nouilles, tofu et tofu au glucono-δ-lactone — étaient collectés sur les marchés locaux.

Préparation des aptamères par SELEX

Le protocole d'évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) a été suivi pour isoler des aptamères à haute affinité pour la rongalite. La bibliothèque initiale d'ADN simple brin 82-mer (5′-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N₄₀-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3′) était incubée avec la rongalite, les séquences non liées étaient lavées, et les aptamères liés étaient amplifiés par PCR. Après 12 cycles d'enrichissement — incluant une contre-sélection contre des composés structuralement apparentés — le séquençage clonal a produit deux aptamères à haute affinité : A09 et B09. Leurs séquences sont listées ci-dessous et ont été synthétisées par Tsingke Biological Technology.

• Aptamère primaire A09 (biotinylé) : 5′-Biotin-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
• Aptamère secondaire B09 (biotinylé) : 5′-Biotin-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3′

Production des AuNPs

Les nanoparticules d'or (~40 nm de diamètre) ont été synthétisées par réduction au citrate de HAuCl₄ suivant un protocole standard [18]. La taille et la monodispersité étaient confirmées par spectroscopie UV/Vis (λ_max ≈ 530 nm) et microscopie électronique à transmission (MET) (Fig. 2). L'aptamère secondaire B09 était conjugué aux AuNPs en incubant 1 mL de solution AuNP avec 4 µL de B09 100 µM, suivi de précipitation induite par sel, centrifugation, et resuspension dans 1 mL PBS (pH 7,4) contenant 5 % BSA, 5 % saccharose, 1 % PEG₂₀₀₀₀ et 0,05 % Tween-20.

Conception de la bande à flux latéral

L'assemblage LFSA (Fig. 3) impliquait un tampon d'échantillon, un tampon conjugué or, une membrane NC (Pall 90) et un tampon absorbant sur une carte support. Le tampon d'échantillon était pré-traité avec PBS + 3 % BSA + 0,05 % Tween-20 et séché à 37 °C pendant 2 h. Le tampon conjugué or recevait les B09-AuNPs. La ligne de test sur la membrane NC était créée en déposant 1 µL de biotine-A09 (10 µM) mélangé avec 10 µL de streptavidine (1 mg mL⁻¹) pendant 1 h à 4 °C, tandis que la ligne de contrôle consistait en streptavidine seule. Après séchage, la bande était coupée en sections de 40 mm et stockée overnight à 37 °C.

Test de spécificité

Les bandelettes de test étaient mises au défi avec 80 µL de rongalite, formol ou eau déionisée à 10 µg mL⁻¹. L'apparition d'une ligne de test rouge distincte confirmait la spécificité, tandis que la ligne de contrôle restait visible sous toutes les conditions.

Test dose-dépendant

Des concentrations de rongalite (0, 0,8, 1, 5, 10 µg mL⁻¹) étaient préparées dans le PBS et 80 µL était appliqué sur le tampon d'échantillon. Une ligne rouge visible dans les 15 min définissait la limite de détection, observée à 1 µg mL⁻¹.

Test sur échantillons alimentaires

Cinq échantillons alimentaires soupçonnés de contenir de la rongalite étaient extraits (1 g + 10 mL eau). Après filtration, 80 µL de chaque extrait était testé sur le LFSA. Les résultats étaient validés croisés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC).

Résultats et discussion

Affinité et spécificité des aptamères

La régression non-linéaire des courbes de saturation (Fig. 4a) a produit des constantes de dissociation de 61,1 ± 16,4 nM pour A09 et 39,8 ± 12,7 nM pour B09, confirmant une liaison forte et spécifique à la rongalite (Fig. 4b).

Performance du test

Le LFSA sandwich produit une ligne de test rouge lorsque les AuNP-B09 lient la rongalite et sont capturés par l'A09 immobilisé. La ligne de contrôle, formée par la streptavidine liant l'excès d'AuNP-B09, confirme l'intégrité du test (Fig. 5). Les tests de spécificité contre le formol et l'eau déionisée n'ont produit aucun faux positif, et la limite de détection était établie à 1 µg mL⁻¹ — bien en dessous des niveaux rapportés dans les échantillons alimentaires contaminés [5].

L'analyse d'échantillons alimentaires a confirmé la présence de rongalite dans plusieurs produits, corroborée par HPLC (Tableau 1). La robustesse du test était attribuée au tampon optimisé (PBS pH 7,4 + 5 % BSA + 5 % saccharose + 1 % PEG₂₀₀₀₀ + 0,05 % Tween-20) et à la sélection de la membrane NC Pall 90, qui offrait un flux optimal et une liaison non-spécifique minimale.

Comparé aux méthodes chromatographiques (GC, HPLC), le LFSA offre une sensibilité comparable tout en éliminant le besoin d'instrumentation sophistiquée et de temps de traitement prolongés. Son faible coût, son fonctionnement en une étape et sa lecture visuelle le rendent idéal pour les inspections de sécurité alimentaire sur site et la conformité réglementaire.

Conclusions

Nous avons développé un LFSA format sandwich fiable et rentable qui détecte la rongalite dans les matrices alimentaires avec une limite de 1 µg mL⁻¹. Le test exploite la spécificité d'aptamères doubles et la clarté optique des AuNPs, permettant un criblage immédiat sur site. Cette plateforme peut jouer un rôle clé dans l'atténuation de la contamination alimentaire par la rongalite et la protection de la santé publique.

Abréviations

AuNPs :

Nanoparticules d'or

HPLC :

Chromatographie liquide à haute performance

LFIA :

Test immunoà flux latéral

LFSA :

Test à flux latéral

Membrane NC :

Membrane de nitrocellulose

POCT :

Test au point de soin

SELEX :

Évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel

MET :

Microscopie électronique à transmission