Le ferumoxytol atténue la fonction des MDSC pour améliorer l'immunosuppression induite par le LPS dans le sepsis

Introduction

Le FMT, un supplément de fer approuvé par la Food and Drug Administration, a été utilisé pour traiter l'anémie ferriprive chez les adultes atteints d'insuffisance rénale chronique (IRC) [1], et le FMT est également largement utilisé comme agent de contraste et vecteur de médicament [2] . Des études antérieures ont montré que FMT avait des propriétés immunomodulatrices, telles que sa capacité à induire un changement phénotypique dans les macrophages M2 vers un CD86 élevé ⁺ , sous-type de macrophage M1 positif pour le TNF-α [3, 4]. Cependant, les effets de la FMT sur d'autres cellules immunitaires n'ont pas été examinés.

Les MDSC sont une population hétérogène de cellules myéloïdes immatures dotées d'une puissante capacité de suppression immunitaire [5]. Chez la souris, les MDSC sont identifiables comme Gr-1 ⁺ CD11b ⁺ cellules, tandis que les MDSC humaines n'ont pas l'homologue Gr-1 et sont définies comme CD14 ⁻ HLA-DR ⁻ CD11b ⁺ CD33 ⁺ ou CD14 ⁺ HLA-DR ⁻ CD11b ⁺ CD33 ⁺ cellules [6]. Les MDSC se composent de deux grands groupes de cellules, les granulocytes ou PMN-MDSC et les M-MDSC, et les deux populations ont des fonctions immunosuppressives grâce à la production d'iNOS, de ROS et d'Arg-1. L'activité accrue de l'Arg-1 épuise la L-arginine et le manque de L-arginine inhibe la prolifération des cellules T en diminuant l'expression de la chaîne zêta CD3. INOS génère du NO, qui inhibe les fonctions de JAK3 et STAT6 dans les cellules T, ainsi que l'expression de MHC II. Les ROS induisent la modification post-traductionnelle des récepteurs des cellules T et peuvent provoquer une absence de réponse des cellules T spécifiques à l'antigène [7]. Les M-MDSC proviennent de précurseurs de monocytes et peuvent se différencier en macrophages et en CD dans des conditions de cytokines appropriées. La plupart de nos connaissances sur les MDSC proviennent d'études sur le cancer. Ces dernières années, une expansion des MDSC a également été décrite dans les maladies inflammatoires aiguës et chroniques, notamment l'inflammation, les brûlures et les maladies auto-immunes [8, 9]. Récemment, un niveau élevé d'absorption de nanoparticules fluorescentes par les MDSC dans l'œsophage et la rate de souris a été rapporté dans des études d'imagerie [10]. Cependant, il n'est pas clair si la FMT modifie la fonction des MDSC impliquées dans le développement de maladies inflammatoires.

La septicémie, une réponse inflammatoire dérégulée de l'hôte à une infection grave pouvant entraîner un dysfonctionnement d'un organe potentiellement mortel, est la cause la plus fréquente de décès dans l'unité de soins intensifs. La septicémie déclenche une réponse pro-inflammatoire écrasante qui, si elle n'est pas traitée tôt, se transforme rapidement en immunosuppression à long terme. L'expansion des MDSCs a été décrite dans la rate et les ganglions lymphatiques dans des modèles animaux septiques [8, 11], ainsi que chez des patients atteints de sepsis [12,13,14]. L'activation de cellules immunosuppressives telles que les MDSC est essentielle pour un contrôle approprié de l'hyperréactivité du système immunitaire inné, mais leur expansion excessive peut entraîner une hyperimmunosuppression, qui est la principale force motrice de l'infection secondaire et de la mortalité dans le sepsis tardif. Un nombre accru de MDSC est en corrélation avec la suppression de la prolifération lymphocytaire. Il a été rapporté que les MDSC acquièrent leur phénotype dans la moelle osseuse puis migrent vers les organes lymphoïdes secondaires pour inhiber les réponses des lymphocytes T et supprimer leur prolifération chez les souris immunodéprimées LPS [8]. La plupart des patients atteints de sepsis prolongé présentent un statut immunosuppresseur, et la plupart des décès par sepsis sont dus à une immunosuppression tardive. L'élimination des MDSC peut avoir des effets bénéfiques dans le sepsis tardif en restaurant la réponse immunitaire [15]. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que la FMT peut moduler les fonctions des MDSC pour réduire l'immunosuppression tardive de la septicémie.

Ici, nous avons montré un effet immunomodulateur de la FMT sur les MDSC. Nous avons utilisé les propriétés magnétiques du FMT pour révéler que les MDSC étaient capables de phagocyter le FMT in vitro. De plus, nous avons constaté que la FMT atténuait la fonction immunosuppressive des MDSC via une régulation négative de Arg-1 et ROS. En outre, des expériences in vivo ont confirmé que la FMT améliorait le stade tardif de la septicémie induite par le LPS chez la souris en affaiblissant la capacité des MDSC à inhiber les cellules T. Nos données suggèrent que la fonction immunomodulatrice de la FMT peut être utilisée pour traiter l'immunosuppression qui survient lors d'un sepsis tardif.

Matériaux et méthodes

Souris

Des souris mâles C57BL/6 (âgées de 8 à 10 semaines) ont été achetées auprès du Model Animal Research Center de l'Université de Nanjing (Nanjing, Chine). Les souris ont été élevées dans des conditions spécifiques sans agent pathogène (SPF) sur un cycle lumière/obscurité de 24 heures et ont permis un accès libre à la nourriture et à l'eau. Toutes les expériences avec des souris ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'université de Nanjing.

Teinture au bleu de Prusse

La distribution intracellulaire de FMT a été détectée à l'aide du kit de coloration au bleu de Prusse de Perl (Solarbio, Chine) conformément aux instructions du fabricant. En bref, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min, puis incubées avec du ferrocyanure de potassium à 10 % pendant 25 à 30 min, suivi d'un lavage et d'une contre-coloration avec du rouge rapide nucléaire pendant 10 min. Les cellules contenant des particules bleues dans le cytoplasme étaient positives pour la coloration au bleu de Prusse.

Génération de MDSC dérivés de la moelle osseuse

Des cellules de moelle osseuse ont été obtenues par rinçage des fémurs et des tibias de souris de type sauvage suivi d'une lyse des globules rouges. Les cellules de moelle osseuse ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 complet avec 10 % de FBS, 1 % v/v de pénicilline et de streptomycine (Gibco, CA), 40 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) (Miltenyi Biotech, Allemagne) et 40 ng/mL d'IL-6 (Miltenyi Biotech, Allemagne) à 37 °C dans un 5% CO₂ incubateur pendant 4 jours. Les cellules non adhérentes ont été collectées pour d'autres expériences.

Test de viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été analysée à l'aide du Cell Counting Kit-8 (Dojino, Kumamoto, Japon) selon les instructions du fabricant. En bref, les MDSC (5 × 10 ³ ) ont été étalés dans des plaques de culture à 96 puits et incubés dans une solution à 5 % de CO₂ atmosphère à 37°C avant traitement. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu frais contenant différentes concentrations de FMT (250, 500, 1000, 2000µg/mL) pendant 24µh. Le surnageant a ensuite été jeté et du milieu frais contenant une solution de CCK-8 a été ajouté. Après incubation à 37°C pendant 3 h, l'absorbance a été mesurée à 450  nm en utilisant un lecteur de microplaques Gen5 (BioTek, USA).

Isolement de l'ARN total et PCR en temps réel

L'ARN total a été extrait des cellules à l'aide du réactif TRIzol (Invitrogen, USA) et quantifié avec un spectrophotomètre Nanodrop (Thermo Scientific, USA) avant d'être rétrotranscrit à l'aide du kit de synthèse d'ADNc 1er brin HiScript II (Vazyme Biotech Co., Ltd, Chine) selon les instructions du fabricant. Une amplification en chaîne par polymérase (PCR) quantitative en temps réel a été réalisée à l'aide du kit SYBR Green PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) sur un système qPCR en temps réel Applied Biosystems StepOne-Plus (Applied Biosystems, Forster City, CA). L'expression des gènes a été normalisée à GAPDH en utilisant le 2 ^−ΔΔCt méthode. Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le fichier supplémentaire 1 :tableau S1.

Cytométrie en flux

Les tissus ont été préparés sous forme de suspensions unicellulaires avec de la collagénase de type D (1 mg/mL) et de la DNase I (0,1 mg/mL) dans une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) à 37 °C pendant 30 min, puis les globules rouges de la rate a été lysée. Les suspensions cellulaires ont été filtrées à travers des tamis cellulaires de 70 µm, et les lymphocytes ont été collectés par centrifugation à 300 µg pendant 5 µmin à 4°C. Après lavage, les cellules ont été immédiatement préparées pour un tri cellulaire activé par fluorescence. Des cellules individuelles ont été incubées avec un réactif bloquant FcR (Miltenyi Biotech, Allemagne) pendant 10 min, suivies d'une coloration avec les conjugués d'anticorps suivants pendant 20 min :anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD4 et anti-CD8 marqué au FITC; anti-Ly6G marqué au PE ; Anti-Ly6C, anti-CD3, anti-F4/80 et anti-MHC II marqués APC (BioLegend, CA). Après lavage, les cellules ont été détectées avec un FACS Calibur (BD, CA) et les données ont été analysées à l'aide de FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., USA)

Coloration H&E

Les tissus du foie et des poumons ont été fixés dans du formaldéhyde tamponné au phosphate à 4 %. Le tissu fixé a été inclus dans de la paraffine et des coupes de 5 μm d'épaisseur ont été colorées à l'hématoxyline et à l'éosine pour la microscopie optique.

Dosage immuno-enzymatique

Les taux sériques de TNFα, MCP-1 et IL-1β ont été déterminés à l'aide de kits ELISA spécifiques (Dakewe, Chine) selon les instructions du fabricant. Chaque échantillon a été analysé en double.

Détection de ROS

Les ROS intracellulaires ont été mesurés à l'aide du kit 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) (Beyotime, China) selon les instructions du fabricant. Brièvement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et incubées avec 5 µM de DCFH-DA à 37°C dans l'obscurité pendant 30 µmin, puis lavées avec du milieu RPMI-1640 et remises en suspension dans du PBS. Les cellules ont été analysées pour la fluorescence verte intracellulaire à l'aide d'un cytomètre en flux (BD, CA).

Test de prolifération des cellules T

CD3 total ⁺ Les cellules T ont été enrichies à partir de la rate de souris de type sauvage à l'aide d'un kit CD3ε MicroBead (Miltenyi Biotech, Allemagne) et d'un colorant CFSE incubé (Invitrogen, USA). Pour la prolifération des lymphocytes T induite par les anticorps anti-CD3/CD28, les lymphocytes T ont été activés avec un anticorps anti-CD3 (1 µg/mL) et un anticorps anti-CD28 (1 µg/mL). G-MDSC (Gr-1 ^élevé Ly-6G ⁺ ) et M-MDSC (Gr-1 ^dim Ly-6G ⁻ ) isolées de rates de souris traitées par FMT ou traitées avec un véhicule à l'aide d'un kit d'isolement cellulaire suppresseur myéloïde (Miltenyi Biotech, Allemagne) selon les instructions du fabricant. Les MDSC ont été co-cultivées dans un rapport 1:1 avec des CD3 ⁺ marqués CFSE Cellules T dans des plaques à fond plat à 96 puits pendant 3 jours. CFSE est divisé également entre les cellules filles à chaque division ; par conséquent, la prolifération a été déterminée par cytométrie en flux. La pureté des cellules après tri était> 90 %.

Statistiques et analyse des données

Toutes les statistiques ont été calculées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, CA) et sont présentées sous forme de moyennes ± écarts types (SD). Les différences entre les deux groupes ont été analysées par le Mann-Whitney U test ou non apparié, bilatéral t de Student test. Une ANOVA à un facteur a été utilisée pour la comparaison de plusieurs groupes. Toutes les expériences ont été répétées au moins trois fois. Différences avec p les valeurs <0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Résultats

Un grand nombre de MDSC utilisent FMT

Pour vérifier si les cellules avec FMT internalisé sont séparées par MACS MicroBeads, nous avons utilisé la coloration au bleu de Prusse pour détecter la teneur en fer intracellulaire dans les macrophages traités avec FMT (1000 ng/mL) pendant 24 h. Les cellules ont été divisées en trois groupes :avant séparation magnétique, les cellules positives FMT qui ont été sélectionnées magnétiquement (FMT+) et celles qui n'ont pas été isolées magnétiquement (FMT-). La coloration au bleu de Prusse a démontré que la majorité des cellules sélectionnées magnétiquement étaient positives au bleu de Prusse (Fig. 1a). Pour comparer la capacité à phagocyter la FMT entre les MDSC, les macrophages et les CD, nous avons isolé des splénocytes de souris C57BL/6 naïves traitées avec la FMT pendant 6 h, 12 h, 24 h et 48 h. Les splénocytes ont été divisés en deux sous-ensembles :avant séparation magnétique et cellules FMT-positives. L'analyse par cytométrie en flux a révélé que près de 60 % des MDSC et plus de 60 % des macrophages ont accumulé la FMT après 12 à 48 h (Fig. 1b, c). Seulement environ 40 % des CD étaient FMT-positives à 24 h h. Ces données ont montré que, comme les macrophages, les MDSC peuvent absorber la FMT et suggèrent que la FMT peut influencer la fonction des MDSC.

Capacités des MDSC, des macrophages et des DC à absorber la FMT. un Les macrophages ont été traités avec du FMT (1000 ng/mL) pendant 24 h, puis colorés au bleu de Prusse pour vérifier la présence cellulaire et le dépôt de fer parmi trois groupes :avant séparation magnétique, sélectionnés magnétiquement (FMT+), non isolés magnétiquement (FMT-) . b Les splénocytes de souris C57BL/6 naïves ont été incubés avec du FMT pendant 6 h, 12 h, 24 h et 48 h. Analyse FACS des pourcentages de MDSC, macrophages et DC dans deux sous-ensembles :avant séparation magnétique, cellules FMT-positives. c Le rapport des cellules FMT-positives aux cellules avant la séparation magnétique. Toutes les données sont représentatives de trois expériences indépendantes pour chaque groupe expérimental et sont affichées sous forme de moyennes ± écart type

FMT inhibe l'expansion des MDSC in vitro

Il a été rapporté que la FMT induit un déplacement phénotypique des macrophages M2 vers un CD86 ⁺ élevé , sous-type de macrophage M1 positif pour le TNF-α [3]. Étant donné qu'il existe un grand nombre de MDSC pouvant utiliser la FMT, nous avons émis l'hypothèse que la FMT peut altérer la fonction des MDSC. Premièrement, les effets cytotoxiques du FMT à 250, 500, 1 000 et 2 000 g/mL sur les MDSC ont été évalués par le test de viabilité cellulaire CCK8. Les résultats ont montré que la FMT n'avait aucun effet sur la viabilité cellulaire à faibles doses et ne présentait qu'une cytotoxicité modérée à la dose maximale de 2000 g/mL (Fig. 2a). Nous avons ensuite testé si FMT à différentes concentrations affecterait la génération de MDSC. Des cellules de moelle osseuse isolées de souris C57BL/6 naïves ont été traitées avec des concentrations moyennes ou diverses de FMT (250, 500, 1000 et 2000 g/mL) pendant 4 jours, suivies d'une caractérisation par cytométrie de flux au jour 4. GM-CSF et L'IL-6 a été ajoutée au jour 0. Les résultats de trois expériences indépendantes ont révélé que la FMT à 1 000 et 2 000  μg/mL diminuait significativement l'expansion des MDSC (Fig. 2b, c).

Quantification par cytométrie de flux du pourcentage de CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ cellules après traitement avec FMT à 250, 500, 1000, 2000 µg/mL in vitro. un La viabilité des cellules MDSC a été détectée à l'aide de tests CCK8 après traitement avec diverses concentrations de FMT pendant 24 h. b , c Des cellules de moelle osseuse isolées de souris C57BL/6 ont été cultivées pendant 4 jours avec du GM-CSF et de l'IL-6 en présence de différentes concentrations de FMT, et les phénotypes cellulaires ont été évalués par cytométrie en flux. Toutes les données sont représentatives de trois expériences indépendantes pour chaque groupe expérimental et sont affichées sous forme de moyennes ± écart type. *p <0,05, ***i>p <0,01, ****p <0,001 tel que déterminé par le t d'un étudiant non apparié test versus cellules traitées avec véhicule seul

FMT réduit la capacité immunosuppressive des MDSC

Les MDSC utilisent plusieurs mécanismes pour inhiber la prolifération et la fonction effectrice des cellules T, le mieux décrit étant la production de ROS et d'Arg-1. L'expression du composant p47phox du complexe nicotinamide adénine dinucléotide phosphate-oxydase (NOX) est responsable de la production de ROS dans les MDSC [5]. Il a été rapporté que S100A8/A9 est synthétisé et sécrété par les MDSC dans une boucle inflammatoire autocrine et que cela est important dans la suppression de la fonction des cellules dendritiques dans les modèles murins [16]. Pour déterminer si FMT pouvait altérer la fonction des MDSC, nous avons obtenu des MDSC dérivés de la BM comme décrit précédemment et utilisé la RT-PCR pour mesurer l'expression de l'ARNm dans les MDSC traités par FMT par rapport aux témoins non traités. Les résultats ont révélé que les MDSC traitées par FMT réduisaient significativement les niveaux d'expression d'Arg-1, S100A8, S100A9 et p47phox par rapport aux MDSC non traités (Fig. 3a–h). Ensuite, nous avons évalué les niveaux de ROS dans les MDSC de contrôle et les MDSC traités par FMT. Les résultats ont révélé que les MDSC traitées par FMT affichaient un niveau de ROS significativement inférieur à celui des cellules témoins (Fig. 3i, j). Nous avons ensuite comparé les changements dans les sous-populations de MDSC dans les groupes traités par FMT et non traités. Les résultats ont montré que la FMT diminuait le pourcentage de G-MDSC, avec une légère augmentation des M-MDSC également observée (Fig. 3k, l).

La FMT modifie la fonction des MDSC in vitro. MDSC dérivés de la moelle osseuse traités avec un véhicule ou FMT pendant 24 h. un –h Expression des gènes Arg-1, S100A8, S100A9 et p47phox à partir de MDSC traités telle que mesurée par RT-PCR quantitative. je Les MDSC dérivés de la BM ont été incubés avec du FMT pendant 24 h et la production de ROS a été détectée par le FCM. j Données quantitatives de i . k Sous-populations de MDSC dans les groupes traités par FMT et témoins. l Analyse FACS des pourcentages de G-MDSC et M-MDSC. Toutes les données sont représentatives de trois expériences indépendantes pour chaque groupe expérimental et sont affichées sous forme de moyennes ± écart type. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 tel que déterminé par le t d'un étudiant non apparié test versus cellules traitées avec véhicule seul

FMT favorise la différenciation des MDSC en macrophages

Pour déterminer si la FMT stimule la différenciation finale des MDSC en macrophages, nous avons traité des cellules avec 1000  μg/mL de FMT au jour 0 et effectué une cytométrie en flux pour les marqueurs associés aux macrophages CD11b et F4/80 aux jours 1, 3 et 5. Le les résultats ont montré que 1 jour après l'ajout de 1000  μg/mL de FMT, la proportion de macrophages a augmenté de manière significative de plus de 2 fois par rapport aux cellules non traitées. De même, 3 jours et 5 jours après le traitement par FMT, les proportions de macrophages ont également augmenté de manière significative (Fig. 4a, b).

Effet de la FMT sur la différenciation des MDSC. un , b Les MDSC dérivés de la moelle osseuse ont été traités avec ou sans 1000  μg/mL de FMT et le nombre de macrophages a été évalué après 1 jour, 3 jours et 5 jours par FACS. Toutes les données sont représentatives de trois expériences indépendantes pour chaque groupe expérimental et sont affichées sous forme de moyennes ± écart type. *p <0,05, versus cellules traitées avec véhicule seul

FMT atténue les symptômes chez les souris septiques induites par LPS

Il a été rapporté que la septicémie est associée à des lésions tissulaires et conduit à une défaillance organique et à un dysfonctionnement endothélial [17]. Pour déterminer si la FMT réduit les symptômes de sepsis tardif, l'étendue des dommages aux organes chez les souris expérimentales a été évaluée après 10 jours. Un examen histopathologique des poumons dans la septicémie induite par le LPS a indiqué que la FMT réduisait le recrutement des globules blancs et l'épaississement de la paroi alvéolaire par rapport aux souris traitées avec le véhicule. La coloration H&E a également révélé que la zone de nécrose du foie était plus petite chez les souris traitées par FMT par rapport aux souris traitées avec le véhicule (Fig. 5a, b). De plus, les taux sériques d'aspartate transaminase, utilisés comme marqueur biochimique du dysfonctionnement hépatique chez ces animaux, étaient significativement inférieurs dans le foie des souris traitées par FMT par rapport au témoin (Fig. 5c). Cependant, FMT n'a pas affecté les niveaux d'alanine aminotransférase (Fig. 5d). De plus, on pense que la septicémie est associée à des effets indésirables tels qu'une production élevée de cytokines inflammatoires; par conséquent, nous avons évalué les changements dans les niveaux de cytokines pro-inflammatoires dans le sérum. Le niveau de TNF-α dans le sérum était légèrement, mais pas significativement, inférieur chez les souris traitées par FMT à 3h après l'injection de LPS, et aucune différence dans les niveaux de MCP-1 ou d'IL-1β n'a été observée entre les souris traitées par FMT et le véhicule. -souris traitées (Fig. 5e–g).

La FMT améliore les lésions hépatiques chez les souris septiques induites par le LPS. un Les souris ont reçu soit du PBS, soit un i.p. injection de 5 mg/kg de poids corporel de LPS bactérien au jour 0. Après 1 h et 5 jours, FMT à une dose de 10 mg/kg ou 100 μL de solution saline a été administrée par la veine caudale. Les souris ont été divisées en quatre groupes (n =6) :véhicule témoin, récepteur; LPS, réception LPS uniquement ; FMT, réception FMT uniquement ; et LPS + FMT, recevant LPS et FMT. b Les tissus pulmonaires et hépatiques ont été colorés à l'hématoxyline et à l'éosine. c-d Les transaminases sériques (ALT et AST) ont été mesurées (n =6). Les taux de cytokines (TNF-a, IL-1β et MCP-1) ont été mesurés par ELISA. e -g Effets de la septicémie induite par le LPS sur la production de cytokines chez des souris traitées avec un véhicule ou du ferumoxytol. Taux de cytokines mesurés par ELISA dans le sérum de souris traitées avec le véhicule ou le ferumoxytol après i.p. Provocation au LPS (50µmg/kg). **p <0,01 tel que déterminé par le t d'un étudiant non apparié tester

FMT diminue le nombre de MDSC dans la rate des souris septiques induites par LPS

De plus en plus de preuves soutiennent que l'immunosuppression associée au sepsis augmente la mortalité [18], et les MDSC sont considérées comme une composante majeure du réseau immunosuppresseur [8]. Il a été rapporté que les G-MDSC sont plus spécifiquement étendues chez les patients septiques et semblent être des acteurs majeurs de la suppression immunitaire induite par le sepsis [12]. Pour déterminer si le FMT module les populations de MDSC chez les souris de type sauvage, des souris C57BL/6 ont reçu du FMT via la veine caudale à l'heure 1 et au jour 5. Les résultats ont montré qu'aucune différence significative dans le pourcentage de MDSC n'a été détectée dans la rate ou l'os. moelle entre le contrôle et les souris traitées par FMT (Fig. 6a, e). Il est à noter que FMT a diminué l'expansion dépendante du LPS de CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ cellules dans la moelle osseuse et la rate (Fig. 6a, e), ce qui est cohérent avec les études in vitro. De plus, la FMT a également diminué le pourcentage de G-MDSC et de M-MDSC dans la rate, tandis que seul le pourcentage de G-MDSC a diminué dans la moelle osseuse (Fig. 6c, g). Ces données indiquent que la FMT diminue le nombre de MDSC dans la rate des souris septiques induites par le LPS.

La FMT diminue le nombre de MDSC chez les souris septiques induites par le LPS. Les souris ont été divisées en quatre groupes (n =6) :véhicule témoin, récepteur; LPS, réception LPS uniquement ; FMT, réception FMT uniquement ; et LPS + FMT, recevant LPS et FMT. un CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ les populations cellulaires dans la moelle osseuse ont été détectées par FACS. b Données quantitatives de a . c Diagramme de points de cytométrie en flux de l'expression de Ly6C et Ly6G dans le CD11b ⁺ fermé cellules de la rate. d Quantification des pourcentages des sous-ensembles granulocytaires et monocytes. e CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ les populations cellulaires dans la rate ont été détectées par FCM. f Données quantitatives de e . g Diagramme de points de cytométrie en flux de l'expression de Ly6C et Ly6G dans les cellules CD11b+ fermées de la rate. h Quantification des pourcentages des sous-ensembles granulocytaires et monocytes. *p <0,05 tel que déterminé par le t d'un étudiant non apparié tester

FMT réduit les propriétés immunosuppressives des cellules T des MDSC in vivo

La réduction numérique de plusieurs populations de cellules immunitaires, y compris les cellules T CD4 et CD8, est une caractéristique majeure de la réponse immunitaire adaptative après une septicémie. Elle est associée à un risque accru de décès, ainsi qu'à d'autres mauvais résultats [19, 20]. Il a été montré que les MDSC suppriment la prolifération des cellules T en altérant l'expression de la chaîne zêta des cellules T chez les patients atteints de sepsis [21]. Pour évaluer la proportion de lymphocytes dans la septicémie à un stade avancé, nous avons mesuré la proportion de cellules T CD4 et CD8 dans un modèle de sepsis murin. Les résultats ont montré que le FMT provoquait une augmentation des cellules T CD4 et CD8 dans la rate des souris induites par le LPS (Fig. 7a, b). Il n'y avait aucune différence dans les pourcentages de cellules T CD4 et CD8 dans la rate des souris traitées par FMT par rapport aux souris témoins (Fig. 7a, b). Pour confirmer davantage le rôle des MDSC dans la suppression de la prolifération des cellules T in vivo, les G-MDSC et M-MDSC ont été isolés de la rate de souris infectées par le LPS et traitées par FMT par MACS et co-cultivés avec des cellules T CD3 à un rapport 1:1 rapport. Nos résultats ont montré que le traitement FMT réduisait les fonctions immunosuppressives des cellules T des G-MDSC et M-MDSC (Fig. 7e, f). En outre, nous avons également mesuré les niveaux d'expression d'Arg-1 et de p47phox dans les MDSC isolées de la rate de souris. Comme prévu, l'expression des gènes Arg-1 et p47phox était significativement réduite dans le CD11b ⁺ splénique Gr-1 ⁺ cellules isolées de souris traitées par FMT avec LPS par comparaison avec des souris avec LPS (Fig. 7g, h). Ces données indiquent que la FMT a diminué les fonctions immunosuppressives des MDSC en diminuant la production d'Arg-1 et de ROS, suggérant que la FMT peut réduire l'immunosuppression à long terme dans le sepsis à un stade avancé.

La FMT réduit les propriétés immunosuppressives des MDSC. un CD3 ⁺ CD4 ⁺ les populations cellulaires dans la rate ont été détectées par FACS. b Données quantitatives de a . c CD3 ⁺ CD8 ⁺ les populations cellulaires dans la rate ont été détectées par FACS. d Données quantitatives de a . e La capacité des G-MDSC de souris à supprimer la prolifération des lymphocytes T induite par la stimulation anti-CD3/CD28 a été mesurée par FACS (n =3 par groupe). Un histogramme représentatif est affiché. f La capacité des M-MDSC de souris LPS traitées par véhicule ou FMT à supprimer la prolifération des lymphocytes T induite par la stimulation anti-CD3/CD28 a été mesurée par FACS (n =3 par groupe). Un histogramme représentatif est affiché. g , h Expression de l'ARNm d'Arg-1 et de p47phox dans les MDSC provenant de souris infectées par le LPS et traitées par FMT

Discussion

Le supplément de fer FMT approuvé par la FDA a été largement utilisé comme vecteur de médicament et agent de contraste dans l'IRM. Il a été constaté que la FMT inhibe la croissance du cancer en induisant une réponse immunitaire pro-inflammatoire avec une polarisation des macrophages M1 [3], indiquant que la FMT a des fonctions immunomodulatrices. Dans cette étude, nous avons évalué l'effet de la FMT sur les MDSC en comparant le phénotype et la fonction des MDSC traitées par la FMT avec les MDSC témoins non traités. Des études antérieures ont montré que les MDSC sont capables d'absorber des nanoparticules magnétiques [10], et nos données ont en outre démontré que la FMT atténue les fonctions immunosuppressives des MDSC dans la rate via une régulation négative de Arg-1 et ROS. Nos données ont également indiqué que la FMT a un effet direct sur la différenciation des MDSC, avec environ un cinquième des cellules se différenciant uniformément en macrophages après 5 jours dans des expériences in vitro. Bien que nous n'ayons pas étudié le phénotype des macrophages exposés à la FMT, nous avons émis l'hypothèse qu'ils étaient du sous-type pro-inflammatoire M1. Les résultats ont clairement démontré que la FMT améliore la différenciation et la maturation des MDSC, et suggère donc que cela sous-tend la réduction de la population de MDSC que nous avons observée au cours du sepsis tardif.

Le sepsis initie une réponse immunitaire complexe qui varie dans le temps et s'accompagne à la fois de réponses pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Des études antérieures ont montré que la mort dans les premiers stades de la septicémie est due à une inflammation excessive. Derive et ses collègues ont rapporté que le transfert adoptif de MDSC au jour 10 dans des souris septiques a atténué la production de cytokines péritonéales et amélioré le taux de survie [22]. Plus récemment, Namkoog et al. ont observé que le prétraitement à la clarithromycine améliorait la survie dans un modèle murin de choc induit par le LPS en élargissant le CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ population cellulaire [23]. They described that MDSCs play a protective role in sepsis, however, it should be noted that they were concerned about the early stages of sepsis. Most patients with sepsis display rapid signs of profound immunosuppression, and deaths in this phase are typically due to the acquisition of a secondary hospital-acquired infection, often with opportunistic pathogens [24]. Overzealous MDSC proliferation may facilitate a physiological syndrome of persistent immunosuppression, causing poor outcomes [25]. McClure et al. reported that they did not observe any protective effects from MDSC transfer once the mice entered the late immunosuppressive state [26]. They had previously shown that MDSCs massively expand in the bone marrow, spleen, and lymph nodes of mice with ongoing septic processes and contribute to sepsis-induced T cell suppression [11]. Additionally, Uhel reported that M-MDSCs and G-MDSCs strongly contribute to T cell dysfunction in patients with sepsis [12]. Our data demonstrated that FMT significantly decreased the percentage of MDSCs and attenuated the functions of MDSCs to restore the number of T cells present in mice during late sepsis. Therefore, when studying the role of MDSCs in sepsis, it is crucial to clearly distinguish the early and late stages of sepsis.

Mohus et al. suggested that iron deficiency was associated with increased risk of future bloodstream infections that cause sepsis, indicating that the immune defense mechanisms may be depressed compared to bacterial iron sequestration in low iron environments [27]. Controversies shown in iron supplemental studies reported that intravenous iron therapy was associated with an increased risk of infection [28]. It should be noted the iron supplements differ significantly in their physicochemical properties, which give them different biological properties [29]. With FMT, an iron core is wrapped in a carbohydrate shell, which leads to low toxicity, lysosomal uptake and degradation [30, 31]. It has been reported that FMT does not cause liver toxicity in patients or animal models and is typically metabolized within 2 months [32]. Our data showed that FMT does not increase the production of inflammatory cytokines in early sepsis, indicating that FMT can be administered in sepsis.

Conclusion

This study demonstrated a novel immune-modulatory property of FMT; however, further studies are needed to elucidate the mechanism of FMT suppression of MDSCs. Furthermore, we provide an attractive therapeutic approach for the treatment of sepsis-associated immunosuppression and targeting MDSCs may provide a promising new option for restoring the immune response during sepsis.

Disponibilité des données et des matériaux

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Abréviations

ALT:

Alanine aminotransferase

Arg1:

Arginase 1

AST:

Aspartate aminotransferase

FMT:

Ferumoxytol

G-MDSCs/PMN-MDSCs:

Polymorphonuclear MDSCs/granulocytic MDSCs

HE:

Hematoxylin–eosin

IL-1β:

Interleukin-1β

iNOS:

Inducible nitric oxide synthase

LPS:

Lipopolysaccharide

MCP 1:

Monocyte chemotactic protein 1

MDSC:

Myeloid-derived suppressor cell

MHC II:

Major histocompatibility complex

M-MDSCs:

Monocytic MDSCs

PBS :

Phosphate-buffered saline solution

ROS:

Espèces réactives de l'oxygène

TLR:

Toll-like receptor

TNF-α:

Tumor necrosis factor α