Une nanoparticule magnétique à double ciblage pour la détection du cancer humain

Introduction

Les tumeurs malignes représentent une grande menace pour la santé humaine [1]. Des études antérieures ont montré que le microenvironnement tumoral affecte les caractéristiques biologiques des tumeurs, telles que les métastases liées à la tumeur [2, 3]. Cependant, les mécanismes potentiels, en particulier le processus par lequel les cellules endothéliales lymphatiques (LEC) favorisent la métastase tumorale, ne sont toujours pas clairs [4]. Il est donc nécessaire de concevoir des stratégies de diagnostic des tumeurs basées sur le ciblage des vaisseaux lymphatiques. Le manque de marqueurs lymphatiques spécifiques, en particulier ceux qui distinguent les LEC de l'endothélium vasculaire, limite les recherches sur les fonctions des LEC. Au cours des dernières années, des marqueurs spécifiques des LEC, tels que le récepteur hyaluronique endothélial des vaisseaux lymphatiques 1 (LYVE-1) [5, 6], la podoplanine [7], le récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire 3 (VEGFR-3) [8] et Prox -1 ont été identifiés [9]. Cela a accéléré la recherche sur les vaisseaux lymphatiques tumoraux, notamment en ciblant les vaisseaux endolymphatiques tumoraux pour diagnostiquer les tumeurs. Elle a également permis des études sur le mécanisme de métastase tumorale par tri des cellules endothéliales endolymphatiques tumorales à l'aide de billes immunomagnétiques [10]. Cependant, à l'instar de nombreux autres marqueurs utilisés en pathologie moléculaire, aucun des marqueurs moléculaires associés aux LEC n'est complètement spécifique des LEC. En raison de l'expression transitoire de Prox-1 dans le noyau [11], il n'est pas adapté aux applications cliniques. Bien que le VEGFR-3 soit exprimé dans les LEC, il manque de spécificité lymphatique dans le cancer car il est également exprimé dans l'épithélium vasculaire [8]. LYVE-1 est spécifiquement exprimé dans les LEC ainsi que dans les sinusoïdes hépatiques normaux, l'endothélium de la rate, les veinules endothéliales hautes, ainsi que les macrophages tissulaires activés, mais il n'est pas exprimé dans l'épithélium vasculaire [7]. La podoplanine n'est pas exprimée dans les cellules épithéliales vasculaires mais c'est un marqueur spécifique des LEC [7, 12].

L'oxyde ferroferrique magnétique, l'or nano, les points quantiques, les liposomes et l'oxyde de titane sont largement utilisés dans le diagnostic et le traitement du cancer en raison de leur biocompatibilité élevée, de leur grande surface spécifique et de leur facilité de modification avec d'autres molécules biologiques fonctionnelles [13, 14]. En plus des caractéristiques ci-dessus, l'oxyde ferroferrique magnétique (Fe₃ O₄ ) a une distribution de taille étroite, une bonne dispersibilité, un paramagnétisme élevé et une taille contrôlable, ce qui le rend approprié pour l'imagerie par résonance magnétique [15]. Parmi eux, l'oxyde de fer superparamagnétique recouvert d'anticorps a été largement utilisé dans la séparation cellulaire, la reconnaissance et le diagnostic précoce des tumeurs [16, 17]. En tant que substance naturelle de haut poids moléculaire, la surface du chitosane est riche en groupes hydroxyle et amino et a été largement utilisée en raison de ses excellentes propriétés telles que la biocompatibilité, la compatibilité sanguine, la sécurité et la dégradabilité microbienne [18]. Par conséquent, la combinaison de chitosane ou de dérivé de chitosane et de Fe₃ magnétique O₄ est plus propice aux applications biologiques, car il peut empêcher les billes magnétiques de s'agglomérer les unes avec les autres pour former des fluides magnétiques. Pour cette raison, il produit une meilleure performance de dispersion.

Dans la recherche sur les tumeurs, la détection des vaisseaux lymphatiques dans les tumeurs repose sur un marquage direct avec des anticorps, ou via un anticorps combiné à des billes magnétiques pour trier les cellules endothéliales lymphatiques. Ici, pour cibler plus précisément les vaisseaux lymphatiques intratumoraux, nous avons conçu une nanosonde multi-ciblée, c'est-à-dire deux anticorps hautement spécifiques contre les cellules endothéliales lymphatiques, l'anticorps anti-Lyve-1 et l'anticorps anti-podplanine. Ces anticorps étaient liés à des nanoparticules de tétroxyde de fer recouvertes de chitosane. Par rapport à d'autres nanosondes, les nanosondes conçues dans cette étude contenant deux anticorps sont plus précises pour la détection des vaisseaux lymphatiques et les cellules endothéliales lymphatiques isolées sont donc plus pures.

Dans cette étude, pour l'enrichissement et l'isolement rapides des LEC des cellules cancéreuses humaines, un ligand avec une spécificité relativement élevée pour l'anticorps anti-LYVE-1 et l'anticorps anti-podplanine ont été utilisés pour faciliter la liaison aux nanoparticules superparamagnétiques recouvertes de chitosane pour préparer magnétique billes pour la sélection des LEC. Il a également été vérifié que la sonde était capable de diagnostic bimodal des tumeurs solides.

Matériaux et méthode

Lignée cellulaire et conditions de culture cellulaire

La lignée cellulaire du cancer du côlon (HT29), qui a été achetée à la banque de cellules ATCC, a été cultivée à 37 °C dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, USA) qui contient 10 % de sérum bovin fœtal ( Gibco, Grand Island, NY, États-Unis), 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine, sous 5 % de CO₂ .

Modèle animal expérimental

Quarante souris femelles NOD/SCID (âgées de 4 à 6 semaines) ont été achetées auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Pékin, Chine). Les cellules HT29 cultivées en phase logarithmique ont été lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Après les avoir digérées avec de la trypsine, les cellules ont été centrifugées à 1000 tr/min pendant 5 min. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans du PBS et la concentration cellulaire a été ajustée à 2 × 10 ⁷ /mL. Chaque souris a reçu une injection de 200 μL de la suspension cellulaire. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité d'éthique animale de l'Université médicale du Guangxi (Guangxi, Chine).

Préparation et caractérisation de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Nanosondes magnétiques à double anticorps

Le chitosan (Xi'an Ruixi Biotechnology) a été carboxylé avec de l'acide -cétoglutarique pour obtenir du α-cétoglutarate carboxyméthyl Chitosan (KCTS) riche en groupes CO à sa surface [19]. Fe₃ O₄ (Xi'an Ruixi Biotechnology) a été utilisé comme noyau et KCTS a été défini comme structure de base du squelette. Après avoir activé Fe₃ O₄ nanoparticules avec carbodiimide, Fe₃ O₄ @KCTS a été formé en combinant la liaison covalente de KCTS-COOH et de surface-OH. Les anticorps LEC sélectionnés étaient spécifiquement dirigés contre l'anticorps humain conjugué à l'APC LYVE-1 (R&D Systems®, réf. FAB20892A) et l'anticorps anti-podoplanine (FITC) (Abcam, réf. ab205333). Ces anticorps ont été réticulés de manière covalente à Fe₃ carboxylé O₄ @KCTS utilisant EDC/NHS activé. Par conséquent, des nanosondes magnétiques modifiées avec des LEC doubles anticorps, référencées Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Une nanosonde magnétique à double anticorps (0,1 mg/mL) a été obtenue. Les nanoparticules conjuguées à un double anticorps ont été conservées dans l'obscurité à 4 °C.

La morphologie et la distribution des tailles de Fe₃ préparé O₄ @KCTS-LECs-Des nanoparticules magnétiques à double anticorps ont été évaluées à l'aide d'un microscope électronique à transmission (TEM; H-7650, Japon). La taille des particules (taille), le potentiel Zeta et l'indice de dispersion des particules (PDI) du Fe₃ O₄ Les anticorps @KCTS-Double ont été mesurés à l'aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS ; PRO3000, Japon) et leur photoluminescence a été mesurée avec un spectrophotomètre à fluorescence (FL-7000, Perkin Elmer, États-Unis).

Immunohistochimie et immunofluorescence

Des coupes de tissus congelés ont été préparées et placées dans de l'acétone glacée pendant 10 min, puis immergées dans une solution de PBS pendant 10 min. Après blocage dans 1% de BSA et lavage trois fois avec du PBS, les coupes ont été incubées avec un anticorps humain conjugué LYVE-1 APC et un anticorps anti-podoplanine (FITC) à 4 °C pendant 30 min. Après incubation, les coupes ont été immergées trois fois dans une solution de PBS, après quoi une solution de coloration au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) a été ajoutée au tissu tumoral pour recouvrir complètement les tissus. Les coupes ont été à nouveau incubées pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, elles ont été lavées trois fois avec du PBS, suivi par l'ajout d'un agent de trempe anti-fluorescence lorsque les sections étaient complètement sèches. Enfin, les coupes ont été montées sur une lamelle et observées au microscope confocal (Nikon DS-Ri1; Nikon, Tokyo, Japon).

Les tissus du cancer du côlon conservés dans le formol ont été inclus en paraffine pour cette étude. Des sections déparaffinées de xénogreffes cancéreuses HT29 ont été bloquées avec du peroxyde d'hydrogène à 3 %, bloquées dans du sérum normal à 5 ​​% et incubées avec un anticorps anti-LYVE-1 (Abcam, ab10278, UK) pendant une nuit à 4 °C. Ensuite, l'anticorps secondaire de chèvre anti-lapin IgG H&L (HRP) (ab205718) marqué à la biotine dans le réactif de marquage de la superstreptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort a été incubé pendant 30 min. La couleur a été mesurée à l'aide d'une solution de 3,3′-diaminobenzidine (DAB).

Purification cellulaire

Le volume moyen des tumeurs était d'environ 1,5 × 1 × 1 cm ³ . Avant de retirer les tumeurs, les souris ont été désinfectées en les immergeant dans de l'éthanol à 75 % pendant 3 à 5 min. La peau de souris désinfectée a été coupée avec des ciseaux stériles et des pinces stériles sur un banc propre. Le tissu tumoral a été soigneusement excisé et placé dans une boîte de Pétri contenant du PBS. Le tissu tumoral imbibé a ensuite été coupé avec des ciseaux ophtalmiques et placé dans une plaque stérile. Le tissu déchiqueté a été pipeté dans un tube à centrifuger de 50 ml à l'aide d'un tube pasteurisé. Trois fois le volume de collagénase I a ensuite été ajouté dans le tube et vortexé pendant 10 min pour obtenir un mélange de collagénase I-tissu tumoral. Le mélange a ensuite été placé dans un bain-marie à 37°C pendant 20 minutes et ceci a été répété cinq fois. En fin de digestion, la collagénase I a été arrêtée par ajout d'un milieu complet et le mélange a été laissé au repos pendant 2 min. Après centrifugation à 300 g pendant 10 min, les tumeurs ont été lavées deux fois avec du PBS, puis remises en suspension dans 10 mL de PBS et filtrées lentement à travers un tamis avec une taille de pores de 75 μm (200 mesh). Les cellules filtrées ont été comptées, moyennées dans deux tubes à centrifuger de 15 mL, remises en suspension dans du PBS, puis centrifugées à 300 g pendant 10 min, puis lavées trois fois. (1) Méthode de tri par billes magnétiques MACS :les cellules lavées ont été remises en suspension dans 100 μL de tampon. Une solution contenant du PBS pH 7,2, 0,5 % de BSA et 2 mM d'EDTA a été préparée en diluant la solution mère MACS BSA (Cat. No. 130-091-376) à 1:20 avec la solution de rinçage auto MACS™ (Cat. No. 130 -091-222). Ensuite, 10 μL d'anticorps conjugué à l'APC LYVE-1 humain ont été ajoutés puis incubés à 4 °C pendant 15 min dans l'obscurité. Enfin, il a été lavé trois fois avec 2 mL de solution tampon. Après centrifugation, 80 μL de solution tampon ont été ajoutés pour remettre les cellules en suspension et 20 μL de solution de billes magnétiques de fluorescéine anti-APC ont été ajoutés. Le mélange a été incubé pendant 15 min, lavé trois fois, puis centrifugé et bien mélangé avec 300 μL de solution tampon. Enfin, les cellules positives de la colonne ont été rapidement éliminées avec 3 mL de solution tampon. Les cellules résultantes ont été cultivées dans une plaque à six puits. (2) Fe₃ O₄ Méthode de tri des nanoparticules magnétiques @KCTS-LECs-double anticorps :les cellules lavées ont été remises en suspension dans 200 μL de tampon, mélangées à du Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-nanoparticules magnétiques à double anticorps, incubées à 4 °C pendant 20 min dans l'obscurité, puis lavées trois fois avec 4 mL de tampon, centrifugées et remises en suspension dans 160 μL de tampon. Enfin, les cellules ont été éluées à l'aide d'un aimant et cultivées dans une plaque à 6 puits.

Immunofluorescence de cellules triées par différentes méthodes

Les cellules triées par différentes méthodes de tri ont été ajustées à une concentration cellulaire de 5 × 10 ⁴ /mL avec du PBS et répartis uniformément dans une plaque à 12 puits. Un millilitre de la suspension cellulaire a été ajouté à chaque puits puis cultivé à 37 °C pendant 24 h dans 5% de CO₂ alentours. L'ancien milieu a ensuite été jeté et les cellules ont été lavées trois fois avec une solution de PBS. Ensuite, 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % ont été ajoutés à chaque puits et les cellules ont été maintenues à température ambiante pendant 10 min. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec une solution de PBS, un anticorps conjugué à l'APC LYVE-1 humain et un anticorps anti-podoplanine (FITC) ont été ajoutés. Après incubation dans l'obscurité à 4 °C pendant 2 h, les cellules ont été lavées trois fois. De plus, 50 μL de DAPI ont été ajoutés à chaque puits et incubés à température ambiante pendant 10 min pour colorer les noyaux en bleu, suivi d'un lavage trois fois avec du PBS. Enfin, l'extincteur anti-fluorescence a été déposé au centre de la lame et le côté recouvert de cellules a été placé sur une lame de verre et observé à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser.

Cytométrie en flux de cellules triées par différentes méthodes

Les cellules triées par différentes méthodes ont été remises en suspension avec un anticorps humain conjugué à l'APC LYVE-1 et un anticorps anti-podoplanine (FITC) dans 200 μL de tampon de liaison (10 mM HEPES/NaOH pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl) , et incubé à 4 °C pendant 1 h dans l'obscurité, puis lavé trois fois avec du PBS. Les cellules ont été détectées et analysées par cytométrie en flux (BD Accury6; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) puis analysées par le logiciel FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA).

Détection de l'activité des LEC

Les cellules en phase de croissance logarithmique triées par différentes méthodes ont été collectées, digérées et comptées. La concentration cellulaire a été ajustée à 2 × 10 ⁵ cellules/mL et 50 μL de ces cellules ont été ajoutés dans chaque puits d'une plaque -lame revêtue de Matrigel et incubés dans une solution à 5 % de CO₂ incubateur à 37 °C pendant 6 h. Le milieu a été séparé et jeté avec un compte-gouttes pasteurisé suivi par l'ajout d'une solution de PBS contenant 1 μg/mL de calcéine AM (Invitrogen, Cat. No. c3099). Les cellules ont ensuite été incubées à température ambiante pendant 1 h dans l'obscurité, lavées avec du PBS et photographiées au microscope (Nikon, Japon). Ensuite, 1 × 10 ⁵ les cellules ont été mélangées avec 500 μL de milieu complet contenant 20 μg/mL de DiI-ac-LDL (Molecular Probes, Invitrogen), puis ensemencées dans une plaque 24 puits à 37 °C pendant 4 h. L'ancienne solution de culture a été retirée et les cellules ont été lavées trois fois dans du PBS. Ensuite, 50 μL de solution de DAPI ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 10 min à température ambiante pour colorer les noyaux en bleu. Après avoir été lavés trois fois avec du PBS, ils ont finalement été imagés au microscope.

IRM et imagerie de fluorescence in vivo

Les étapes suivantes ont été suivies pour déterminer si la tumeur était ciblée par Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double nanoparticules magnétiques d'anticorps chez les animaux. Le modèle de xénogreffe sous-cutanée de souris NOD/SCID du cancer du côlon a été utilisé pour le balayage par résonance magnétique ou par fluorescence. L'imagerie pondérée en T2 a été réalisée dans des conditions spécifiques comprenant le champ de vision (80 × 80 mm), le temps d'écho (69 ms) et l'épaisseur de la couche (2,0 mm) à l'aide d'un scanner IRM 3.0T (Discovery 750, gE, allemagne) , ayant une bobine de volume de souris de 40 mm de diamètre. Les souris NOD/SCID ont été divisées en deux groupes (n = 3) ; le groupe expérimental et le groupe bloquant les récepteurs. Toutes les souris ont reçu une injection de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double anticorps (0,5 mmol/kg) nanoparticules magnétiques via la veine caudale. Chaque souris a été scannée à quatre moments précis :avant l'injection, 0,5  h, 12 h et 24 h après l'injection. Dans le groupe de blocage des récepteurs, chaque souris a reçu une injection d'anticorps Anti-LYVE-1 (Abeam, ab10278, UK) et d'anticorps anti-podoplanine (Abcam, ab10288, UK) avant l'injection de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double anticorps. Des IRM ont été réalisées aux quatre mêmes moments. Des images de fluorescence ont été prises en utilisant le système d'imagerie in vivo pour petits animaux (Bruker, USA). Les points temporels pour le regroupement, l'injection de drogue et la numérisation étaient tels que mentionnés ci-dessus.

Toxicité de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Nanosonde magnétique à double anticorps

Toxicité de Fe₃ O₄ La nanosonde magnétique @KCTS-LECs-double anticorps contre les LEC a été évaluée par le test CCK-8. Cellules (100 μL de milieu, 2 × 10 ⁵ /mL) ont été cultivés pendant la nuit dans des plaques 96 puits à 37 °C en atmosphère humanisée contenant 5% de CO₂ , puis traité avec Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-nanosonde magnétique à double anticorps (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg/mL) pendant 24 ou 48 h dans les mêmes conditions. Après incubation, 10 μL de solution de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits, suivis d'une autre incubation pendant 2 h. La densité optique (DO) a été mesurée à 450 nm par un lecteur de microplaques ELISA (Thermo Scientific, USA).

Évaluer la toxicité de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-nanosonde magnétique à double anticorps in vivo, des souris femelles NOD/SCID ont reçu une injection unique dans la veine caudale de 200 μL de PBS (groupe témoin) ou de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-nanosonde magnétique à double anticorps (2 mg/mL) (n = 3 animaux par groupe). Après 1 semaine, les souris ont été sacrifiées, des sections des principaux tissus (cœur, poumon, foie, rate, rein) ont été obtenues et immergées dans une solution de formaldéhyde à 10 %, déshydratées et incluses en paraffine. Des coupes paraffinées (4 μm d'épaisseur) ont été coupées et colorées à l'hématoxyline-éosine.

Analyse des dates

Le logiciel statistique SPSS 16.0 a été utilisé pour l'analyse des données. Les données de mesure ont été exprimées en x ± s, la comparaison entre les groupes a été effectuée par analyse de variance et la comparaison des données de comptage a été effectuée par un test du chi carré. P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultat

Principe d'une nanoparticule magnétique à double ciblage pour la détection du cancer humain

Dans cette étude, comme le montre le schéma 1, Fe₃ O₄ @KCTS, un type de noyau-coque de nanoparticules magnétiques, a été préparé en activant Fe₃ O₄ avec du carbodiimide et en le réticulant avec du chitosane -cétoglutarate (KCTS). Les anticorps LYVE-1 et podoplanine ont ensuite été ajoutés à la surface de ces nanoparticules magnétiques, formant ainsi des nanosondes magnétiques à double ciblage. Ces sondes ont été injectées dans des modèles de souris par la veine caudale pour diagnostiquer la tumeur par IRM pondérée en T2 et imagerie par fluorescence. Après excision, la tumeur a été écrasée en une seule cellule, puis incubée avec la sonde pour identifier les cellules endothéliales lymphocytaires avec une pureté plus élevée par un aimant pour explorer le mécanisme de la métastase tumorale. Les résultats ont démontré qu'une nanosonde magnétique à double ciblage qui fournit des LEC de haute pureté à partir de tissus tumoraux a été développée avec succès, fournissant une base pour l'application clinique des LEC dans le cancer colorectal ainsi que dans le diagnostic clinique précoce par imagerie bimode du cancer colorectal.

Illustration schématique de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-nanoparticules magnétiques à double anticorps

Caractérisation de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Nanoparticules magnétiques à double anticorps

Les images MET (Fig. 1a) ont montré que Fe₃ nu O₄ est irrégulier avec sphérique et a des agglomérats entre les particules. Quand Fe₃ O₄ a été modifié par KCTS (Fig. 1b), les particules étaient sphériques ou ovales régulières et les particules étaient uniformément dispersées. Comme le montre la figure 1c, Fe₃ O₄ Les nanoparticules magnétiques @KCTS-LECs-double anticorps ont été modifiées avec l'anticorps chargé négativement à la surface de Fe₃ O₄ @KCTS qui conférait des charges négatives, augmentant ainsi la répulsion électrostatique entre les nanoparticules. Fe₃ O₄ Les nanoparticules magnétiques à double anticorps @KCTS-LECs étaient sphériques, uniformes, exemptes d'agrégation de particules et n'étaient pas endommagées. Le diamètre moyen était de 91,28 ± 2,31 nm et le PDI était de 0,207 ± 0,015 (Fig. 1d). La figure montre que la distribution de taille des nanoparticules était étroite et présentait une bonne dispersion dans l'eau. La surface chargée négativement avait un potentiel zêta de − 32,8 ± 1,51 mV, avec une valeur absolue supérieure à − 30, indiquant que le matériau avait une bonne stabilité (Fig. 1e).

Caractérisation de nanosonde magnétique. un Image de micrographie électronique à transmission de Fe₃ O₄ nanosonde (barre d'échelle, 100 nm). b Image de micrographie électronique à transmission de Fe₃ O₄ @KCTS nanoprobe (barre d'échelle, 100 nm). c Image de micrographie électronique à transmission de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-nanosonde magnétique à double anticorps (barre d'échelle, 100 nm). d La taille des particules a été détectée par analyse de taille, et la taille moyenne de la sonde était de 91,28  nm. e Le potentiel zêta était d'environ − 32,8 mv. f Le Fe₃ O₄ La nanosonde à double anticorps @KCTS-LECs a des pics d'émission sous une lumière d'excitation de 488 et 545

Les résultats du spectromètre à fluorescence sont présentés sur la figure 1f. Un pic d'émission distinct a été observé dans l'anticorps anti-podoplanine (FITC) sous une lumière d'excitation 488, et dans l'anticorps anti-LYVE-1 (APC) sous une lumière d'excitation 545. La présence de pics d'émission dans le Fe₃ O₄ Le complexe @KCTS-LECs-double anticorps sous excitation 488 et 545 indique que les matériaux ont été couplés avec succès.

Immunohistochimie et immunofluorescence

Comme le montrent les figures 2a, b, l'expression de LYVE-1 dans les tissus cancéreux du côlon et de LYVE-1 et d'anticorps podoplanine dans les tissus tumoraux congelés a été observée. Cela a démontré qu'une petite quantité de cellules endothéliales lymphatiques était présente dans les tissus du cancer du côlon.

Expression des vaisseaux lymphatiques dans les tissus cancéreux colorectaux. un Les vaisseaux dilatés dans les coupes de tissus étaient positifs pour LYVE-1 sur la membrane des cellules endothéliales par immunohistochimie (barre d'échelle, 100 μm). A droite, une image agrandie. b Les vaisseaux dilatés dans les coupes de tissus étaient positifs pour le LYVE-1 et la podoplanine sur la membrane des cellules endothéliales comme révélé par immunofluorescence (barre d'échelle, 50 μm)

Isolement et enrichissement des LEC

Une coloration par immunofluorescence a été réalisée sur les cellules obtenues par deux méthodes de tri différentes. Il a été constaté que les cellules triées par les billes magnétiques LYVE-1 MicroBeads exprimaient la protéine LYVE-1, mais pas la podoplanine, alors que les cellules obtenues par Fe₃ O₄ Les nanoparticules magnétiques à double anticorps @KCTS-LECs ont exprimé la protéine LYVE-1 et la protéine podoplanine (Fig. 3a). De plus, les résultats de cytométrie en flux des cellules triées par différentes méthodes ont été analysés. Comme le montre la Fig. 3b, le taux de co-expression de la protéine LYVE-1 et de la protéine podoplanine par les billes magnétiques LYVE-1 MicroBeads était de 71,2%, alors que le taux de co-expression des deux marqueurs obtenu par tri avec Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double nanoparticules magnétiques d'anticorps était de 88,9%. Deux échantillons indépendants t les tests ont montré qu'il y avait des différences statistiquement significatives entre les deux groupes (P < 0,05) (Fig. 3c).

Analyse de la pureté des cellules endothéliales lymphatiques. un Micrographies à fluorescence imagerie bicolore de LYVE-1 (rouge) et de podoplanine (vert)/noyaux [4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, bleu) dans les LEC isolées du cancer colorectal humain triées à l'aide de LYVE-1 Microbeads et Fe ₃ O₄ @KCTS-LECs-double anticorps (barre d'échelle, 100 μm). b La co-expression de LYVE-1 (APC) et de podoplanine (FITC) révélée par la détection par cytométrie en flux. c Résultats de cytométrie en flux, *P < 0,05

Comparaison des fonctions biologiques des LEC obtenues par les deux méthodes de tri différentes

Nous avons ensuite comparé les caractéristiques biologiques des cellules endothéliales lymphatiques obtenues par deux méthodes de tri différentes. Les résultats du test du tube de colle Matrigel sont illustrés à la Fig. 4a. Les cellules obtenues par tri avec Fe₃ O₄ Les nanoparticules magnétiques à double anticorps @KCTS-LECs avaient une capacité de formation de tube plus forte. Le résultat du test d'absorption des cellules endothéliales Dil-ac-LDL illustré à la Fig. 4b révèle qu'une fluorescence rouge a été observée dans les cellules triées par des billes magnétiques LYVE-1 MicroBeads, mais une fluorescence rouge plus forte a été observée dans les cellules triées par Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double nanoparticules magnétiques d'anticorps. Ces résultats indiquent que les cellules obtenues par le Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-les nanoparticules magnétiques à double anticorps avaient une pureté plus élevée, une meilleure capacité de formation de tubes et une phagocytose des cellules endothéliales, indiquant qu'elles sont plus adaptées à la recherche sur les cellules endothéliales lymphatiques dans les tumeurs.

Comparaison des fonctions biologiques des LEC. un Détermination de la capacité de formation de tubes LECs in vitro par Calcein AM (vert) in vitro (barre d'échelle, 50 μm). b Dosage de la phagocytose des cellules endothéliales (marquées DiI, rouge ; DAPI, bleu) de la fonction des cellules endothéliales à l'aide de LEC isolées par des microbilles LYVE-1 et Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Double anticorps (barre d'échelle, 100 μm)

Analyse d'imagerie bimodale in vivo

Les résultats de l'imagerie in vivo sont présentés sur la figure 5a. Il a été constaté qu'il n'y avait pas de fluorescence de la tumeur avant l'injection de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double nanoparticules magnétiques d'anticorps. Après l'injection, la fluorescence de la tumeur a augmenté, atteignant le pic à 12 h. Par la suite, la fluorescence diminue progressivement avec le temps. Dans le groupe témoin fermé, il n'y avait presque pas de fluorescence de la tumeur tout au long de l'expérience. Après 24 h, il a été observé que le matériel avait été complètement métabolisé à partir du corps des souris des deux groupes. De même, l'imagerie par résonance magnétique illustrée à la figure 5b a révélé que l'imagerie tumorale s'est progressivement affaiblie, atteignant son niveau le plus faible après 12 h, suivi d'une récupération progressive avec le temps. Cependant, la puissance d'imagerie de la tumeur dans le groupe témoin fermé était presque inchangée. On peut en déduire que le Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-les nanoparticules magnétiques à double anticorps présentaient des propriétés élevées de ciblage des tumeurs in vivo.

Imagerie par fluorescence et IRM de modèles tumoraux de xénogreffe sous-cutanée de cancer colorectal de souris NOD/SCID. un Des souris NOD/SCID ont été anesthésiées et imagées avec un système d'imagerie par fluorescence avant et après l'injection 0,5 h, 12 h et 24 h. b Des souris NOD/SCID ont été anesthésiées et imagées avec un scanner IRM 3.0T avant et après l'injection 0,5 h, 12 h et 24 h

Toxicité in vitro et in vivo des nanoparticules magnétiques

La cytotoxicité in vitro des nanosondes magnétiques a été évaluée dans les LEC qui ont été triées par Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double nanoparticules magnétiques d'anticorps. Les résultats du test CCK-8 ont montré que la viabilité de la cellule était élevée après incubation avec diverses concentrations de nanosonde magnétique (Fig. 6a). Cela suggère que Fe₃ O₄ Les nanoparticules magnétiques à double anticorps @KCTS-LECs ont une cytotoxicité minimale. Nous avons en outre évalué la toxicité des nanoparticules magnétiques in vivo. Des souris femelles NOD/SCID ont été traitées avec une nanosonde magnétique, puis des coupes de tissus des principaux organes après coloration à l'hématoxyline-éosine ont été examinées. Comme le montre la figure 6b, aucun signe évident de nécrose ou d'inflammation n'a été observé. Ces résultats suggèrent que la nanosonde magnétique ne produit pas d'effets toxiques in vivo. Ces résultats indiquent que la nanosonde magnétique conçue dans cette étude est adaptée à une application en tant que sonde de détection dans les investigations animales et humaines.

Toxicité de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-nanosonde magnétique à double anticorps. un Les LEC ont été incubées avec diverses concentrations de nanosonde magnétique et la viabilité cellulaire a été mesurée à 24 h et 48 h. b Des souris NOD/SCID ont été traitées avec du PBS ou une nanosonde magnétique, et des coupes des principaux organes ont été colorées avec de l'hématoxyline-éosine et examinées par microscopie optique (barre d'échelle, 100 μm)

Discussion

It has long been know that transportation through the lymphatic system is an important pathway for tumor cell proliferation. However, compared with vascular endothelial cells (BECs) in blood vessels, LECs, as major components of lymphatic vessels, have not been fully studied. Identification of LECs markers will promote investigations on LECs and make it easier to distinguish them from BECs. LYVE-1 is a type I intact transmembrane glycoprotein receptor composed of 322 amino acid residues [20, 21], and it is presently considered to be the most specific lymphatic endothelial cells marker [22, 23]. Podoplanin is a type I transmembrane salivary mucin-like glycoprotein with a molecular weight of 38 kDa. Current research shows that podoplanin can distinguish lymphatic vessels and blood vessels very well [24, 25]. Therefore, it can be combined with other lymphatic markers to identify LECs. In this study, two antibodies were used to sort LECs, and the purity of the sorted cells was verified by immunofluorescence co-localization, flow double staining, and co-expression. The cells sorted by Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles displayed similar biological characteristics with LECs, and had stronger tube-forming ability and better phagocytic ability.

Recently, immunomagnetic-based purification methods have been used to separate different cells from mixed cultures, while magnetic beads coated with LYVE-1 or podoplanin antibodies have been used to separate specific subpopulations from crude cells populations [10, 26]. These methods only purify the target subgroups from mixed cultures. It is likely that this not only leads to incomplete isolation of LECs, but also causes contamination of heterogeneous cells such as vascular endothelial cells. Furthermore, these methods are time-consuming and are costly. Previously, several specific lymphoid markers were reported, e.g., LECs were isolated from different tissues primarily by the means of collagenase treatment. However, during primary culture, collagenase treatment may produce a mixture of cells, including vascular endothelial cells and interstitial cells.

In this study, the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-diabody magnetic nano-double targeting probe was constructed using chitosan-coated ferroferric oxide which binds to highly specific target molecules LYVE-1 and podoplanin expressed on lymphatic endothelial cells. The electron microscope analysis showed that the probe had uniform appearance and good dispersibility. Zeta potential reflects the stability of a molecular probe. Highly positive or negative zeta potential values reflect high stability and low capacity to aggregate. It is generally believed that molecules with zeta potential greater than + 30 mV or less than − 30 mV have good stability. In this experiment, the probe had a zeta potential of − 32.8 ± 1.51 mV, which indicates that the probe had good stability.

Fe₃ O₄ is a magnetic nanoparticle oxide which has been widely used in modern medicine and biology because of its unique physical properties. It is particularly used in diagnosis systems based on magnetic resonance imaging and magnetic hyperthermia as well as in cell separation applications. The contrast agents used in MR imaging can be divided into paramagnetic iron oxide nanoparticles (T2-negative contrast agent) and Gd compounds (T1-positive contrast agent). Fe₃ O₄ nanoparticle resonance contrast agent is considered to be a R2-weighted, and its performance is often affected by some factors, such as (a) composition, (b) NP size, (c) surface coating, and (d) synergistic magnetic effect produced by multiple superparamagnetic Fe₃ O₄ NP centers in a small volume [27]. In addition, it can be used in sorting of target cells under the magnetic field effect, that is, after the target cells are combined with specific probes, the target cells are sorted by magnet adsorption. For example, the lymphatic endothelial cells sorted using the probe designed in this study had better tube forming ability and endothelial cell phagocytosis. The relaxation parameter R1 or R2 is typically used to measure the quality of the MRI contrast agent, which describes the ability of the contrast agent T1 or T2 relaxation time [28]. The current NP-based T1 contrast agents are associated with cell toxicity, generating the need for better alternatives. Fe₃ O₄ provides good biocompatibility compared to the above-described cerium-based materials [29]. In this study, we studied the in vitro and in vivo toxicity of the nano-probes modified by chitosan on the surface of Fe₃ O₄ . Our results showed that the probe was suitable for sorting of specific cells, and had low toxicity. It is therefore an ideal material that can be used for culturing of the sorted cells and further research on tumor metastasis through lymphatic vessels.

Here, specific target molecules such as peptides, antibodies, aptamers, etc. were attached to the surface of magnetic nanomaterials, thereby facilitating tumor diagnosis and treatment [30, 31]. This study successfully constructed the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nano-double targeting probe. This probe could bind to specific target molecules, and hence can be used to separate lymphatic endothelial cells and MR/fluorescence imaging.

Conclusions

In summary, a dual targeting magnetic nanoparticle that can detect human cancer is presented in this study. The magnetic nanoparticle probe displays high biosafety and stability. The probe could bind to specific target molecules, thereby enabling sorting of lymphatic endothelial cells. The double antibody coating customized by incorporating self-made magnetic beads produced enabled separation of pure LECs, which reduced sorting time, improved cell activity, and reduced cost. These findings indicate that the magnetic nanoprobe designed in this study is suitable for application as a detection probe in animal and human investigations. This study provides a platform for studying the mechanisms of lymphatic metastasis and role of lymphatic endothelial cells in tumors. Moreover, the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles can be applied in fluorescence/MR molecular imaging in vivo, enabling clinical diagnosis of cancer.

Abréviations

DAPI :

4′,6-Diamidino-2-phénylindole

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

EDC :

Chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide

FBS :

Containing no fetal bovine serum

Fe₃ O₄ :

Magnetic ferroferric oxide

HT29:

Human colon cancer cell

KCT:

α-Ketoglutarate carboxymethyl chitosan

LECs:

Lymphatic endothelial cells

LYVE-1:

Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1

MR:

Magnetic resonance

NHS :

N-hydroxysuccinimide

T2:

Transverse (spin-spin) relaxation time

TEM :

Microscopie électronique à transmission

VEGFR-3:

Vascular endothelial growth factor receptor 3