Imagerie biologique multiplexée hyperspectrale de nanosondes émettant dans la région infrarouge à ondes courtes

Introduction

Les technologies d'imagerie biomédicale se développent rapidement au cours des dernières décennies, permettant une détection et une évaluation précoces de diverses maladies et pathologies. Parmi les différentes modalités d'imagerie, l'imagerie optique occupe une position unique en raison de sa haute résolution spatiale et temporelle et de son coût relativement faible. De multiples approches d'imagerie optique basées sur la photoluminescence (ou, plus précisément, la fluorescence) sont en cours de développement et en cours de traduction clinique. Par exemple, l'imagerie du système lymphatique et la chirurgie peropératoire guidée par imagerie par fluorescence ont montré des résultats prometteurs pour faire progresser les soins de santé [1, 2]. D'autre part, des sondes photoluminescentes exogènes ciblant des régions d'intérêt spécifiques (par exemple, une tumeur) sont activement développées pour l'imagerie in vivo et ex vivo. En plus des exigences habituelles pour les sondes de photoluminescence (PL) (c. Comme l'atténuation de la lumière par les tissus biologiques est connue pour être plus faible dans le domaine spectral du proche infrarouge (NIR) (~ 700-950 nm) que dans le visible, une existence de la fenêtre de transparence NIR pour les tissus biologiques (~ 700- 950 nm) a été introduite et beaucoup d'efforts sont consacrés au développement et aux applications des sondes émettrices NIR [3,4,5,6]. De plus, des progrès récents ont conduit à l'introduction des deuxième et troisième fenêtres NIR (NIR-II et NIR-III) dans la gamme spectrale ~ 1000-1700 nm, qui est souvent appelée infrarouge à ondes courtes (SWIR), en particulier par fabricants dans le domaine en développement rapide de l'imagerie infrarouge [7,8,9]. Malgré une absorption d'eau plus élevée dans la plage SWIR par rapport à la fenêtre NIR conventionnelle, une autofluorescence et une dispersion plus faibles des tissus biologiques permettent une résolution d'imagerie supérieure et une profondeur d'imagerie plus élevée dans la bio-imagerie SWIR PL [10,11,12]. Par exemple, dans l'imagerie SWIR PL du système vasculaire lymphatique et cérébral, en utilisant le nouveau colorant fluorescent SWIR CH1055-PEG, la résolution et le rapport signal/arrière-plan se sont avérés supérieurs par rapport à l'imagerie NIR PL conventionnelle avec le colorant fluorescent NIR-I, le vert d'indocyanine [13]. De plus, l'utilisation de nanosondes émettrices de SWIR (nanotubes de carbone à paroi unique) et d'une caméra d'imagerie SWIR a permis au groupe de Dai de visualiser des vaisseaux inférieurs à 10  μm à une profondeur de> 2   mm en imagerie non invasive (sans craniotomie) de la vascularisation cérébrale de souris, qui est inaccessible pour l'imagerie PL dans les plages visibles ou NIR-I [8].

Les colorants organiques et les complexes de colorants avec une absorption intense dans la première fenêtre NIR et une fluorescence dans la fenêtre NIR-II pourraient être considérés comme des sondes NIR-SWIR prometteuses ; ils se sont avérés servir d'agent de contraste exceptionnel pour l'imagerie vasculaire et des ganglions lymphatiques, la délimitation des tumeurs et la chirurgie guidée par l'image [13,14,15,16]. Il convient de noter que le colorant organique vert d'indocyanine (ICG) est le seul agent de contraste de fluorescence NIR actuellement approuvé par la Food and Drugs Administration des États-Unis pour une utilisation chez l'homme [17]. Parallèlement, les sondes d'imagerie moléculaire (c. modalités de ciblage. En revanche, les nanoparticules (NP) comprenant des centres PL peuvent avoir leur surface modifiée de manière covalente avec différentes fractions pour une meilleure dispersibilité et stabilité dans l'eau, une charge de surface contrôlée ou des objectifs de ciblage. De plus, l'introduction des nanoplateformes NIR-SWIR PL permet de combiner l'imagerie PL avec d'autres modalités d'imagerie, de diagnostic ou thérapeutiques. Des études récentes rapportent une imagerie des tissus profonds, du corps entier, des tumeurs ou transcrânienne avec des nanoformulations émettant des SWIR utilisées pour surveiller divers processus in vivo [14, 18, 19, 20, 21]. Parmi les diverses nanosondes émettrices NIR-SWIR signalées pour l'imagerie in vivo, deux types peuvent être distingués :avec la fluorescence NIR-SWIR provenant de fractions organiques (c'est-à-dire polymère conjugué) ou de nanocristaux céramiques (par exemple, fluorure) dopés avec des ions de terres rares. Les nanoparticules à base de polymère (PNP) sont parmi les nanomédicaments les plus réussis dans les traductions cliniques, en raison de la facilité relative de la synthèse et de la fonctionnalisation chimique, ainsi que de leur biocompatibilité et biodégradabilité supérieures [22]. Lorsqu'ils sont chargés de fluorophores NIR-SWIR, les PNP peuvent servir de sondes d'imagerie prometteuses ou de véhicules d'administration de médicaments guidés par imagerie [23, 24]. D'autre part, les nanoparticules dopées aux ions de terres rares (RENP) sont une classe bien connue de nanosondes, qui ont des propriétés de photoluminescence uniques accessibles à la fois par des processus de conversion ascendante (anti-Stokes-shifted) et de down-conversion (Stokes-shifted). [25,26,27,28,29,30]. Récemment, les RENPs ont été traduits pour être utilisés dans l'imagerie NIR-SWIR. Contrairement aux sondes NIR-SWIR basées sur des fragments organiques, elles possèdent un rendement quantique élevé, une photostabilité exceptionnelle et des bandes d'émission étroites dans toute la région spectrale NIR-SWIR, qui peuvent être réglées par dopage avec divers ions [20, 31, 32]. Les RENP ont été appliqués à l'imagerie du système vasculaire et des organes de petits animaux, à la détection des tumeurs, à l'imagerie multiplexée et multispectrale [3, 19, 20, 33, 34, 35].

Avec le développement émergent de la bio-imagerie PL, une capacité à suivre simultanément plusieurs fractions PL in vivo peut être requise à différentes fins (par exemple, l'imagerie ciblée des cellules ou des organes sélectionnés ainsi que l'administration de médicaments guidée par imagerie). Pour relever ce défi, des méthodes d'imagerie multiplexée ont été développées. L'imagerie multiplexée fait référence à la complémentarité des informations anatomiques et fonctionnelles dans le système biologique imagé; son application peut permettre la combinaison de biomarqueurs d'imagerie, de contrastes et de modalités pour augmenter l'utilité de l'imagerie dans la recherche et les applications cliniques [36]. L'imagerie PL multiplexée peut améliorer la dimension théranostique de la nanomédecine, offrant la possibilité d'introduire plusieurs contrastes d'imagerie PL ainsi qu'une modalité thérapeutique. Les méthodes d'imagerie multiplexe les plus couramment utilisées distinguent les sondes PL par la position spectrale de leur émission PL, en utilisant des filtres optiques appropriés [37,38,39]. Cependant, un multiplexage approprié dans une telle approche nécessite l'utilisation de nanosondes avec des spectres PL spectralement étroits et ne se chevauchant pas. À cet égard, l'imagerie hyperspectrale (HSI) combinée à des algorithmes d'analyse de mélange spectral est un outil prometteur pour le multiplexage PL. Cependant, les applications biomédicales du PL HSI sont principalement limitées à la microscopie à fluorescence, pour multiplexer différents types de nanosondes et éliminer le bruit de fond et l'autofluorescence [40, 41]. En ce qui concerne le HSI in vivo, il est le plus souvent utilisé en mode d'imagerie par réflexion via l'acquisition et l'analyse séquentielle des spectres de réflexion tissulaire [42], bien que l'imagerie HSI in vivo (également appelée imagerie multispectrale) ait également été rapportée pour le PL dans le visible. et plages NIR [3, 5]. Cependant, aucun rapport sur le HSI des nanosondes émettant des SWIR n'a pu être trouvé dans la littérature.

Récemment, nous avons rapporté le développement d'un système HSI séquentiel à bandes combiné à un logiciel de démixage spectral pour l'imagerie SWIR PL [43]. La procédure HSI séquentielle de bande était basée sur l'acquisition consécutive d'images 2D à travers un élément avec une transmittance variée spectralement (c'est-à-dire un filtre accordable à cristaux liquides, LCTF). Les données SWIR PL obtenues à partir de suspensions RENPs ont été présentées sous forme de cube de données spectrales tridimensionnel (hypercube) comprenant deux dimensions spatiales et une dimension spectrale. Une application supplémentaire de la procédure de démixage spectrale à chaque pixel spatial de l'hypercube acquis a permis de calculer les abondances dans un composant de mélange PL. Ici, nous avons appliqué HSI pour traiter le multiplexage de nanosondes pour la bio-imagerie SWIR PL in vivo. Nous avons utilisé deux types de nanoparticules émettrices de SWIR avec des émissions qui se chevauchent spectralement et ne peuvent pas être facilement distinguées dans une imagerie PL conventionnelle avec des filtres optiques, malgré leur profil spectral différent. La figure 1 illustre le problème du mélange spectral de PL à partir de ces nanoparticules et la manière de le surmonter en utilisant le démixage séquentiel des bandes avec HSI.

Schéma illustrant l'application de HSI pour le multiplexage de nanosondes photoluminescentes

Le HSI a été appliqué pour acquérir l'imagerie PL spectralement sélective et sensible pour les deux types de nanoparticules. Pour démixer les profils spectraux SWIR PL, le protocole de démixage a été développé, nous permettant d'obtenir une cartographie quantitative et spatiale des composants dans le mélange, avec détermination des distributions d'intensité en plus des abondances. Les techniques SWIR HSI et le protocole de démixage développé ont ensuite été appliqués à l'imagerie in vivo de souris injectées par voie sous-cutanée avec des nanoparticules pour démontrer l'applicabilité de HSI aux nanosondes SWIR PL multiplex dans l'imagerie in vivo.

Méthodes

Préparation et caractérisation de la nanoformulation

Synthèse de nanoparticules polymères cœur-enveloppe chargées de colorant organique fluorescent NIR-SWIR

Polystyrène (PS)-poly-N -isopropylacrylamide (PNIPAM) des nanoparticules core-shell ont été synthétisées par polymérisation en microémulsion, avec modification de la méthode décrite précédemment [44, 45]. Tout d'abord, des nanoparticules de noyau PS-co-PNIPAM (10 % en poids de PNIPAM) ont été préparées comme suit. NIPAM (0,1 g), dodécyl sulfate de sodium SDS (0,1 g) et 0,005 g de NaH₂ Bon de commande₄ × H₂ O ont été dissous dans 45 ml de H₂ O. Du styrène (1 pg) a été ajouté goutte à goutte sous agitation vigoureuse lorsque la température a été augmentée à 60°C. Au cours de l'étape suivante, Ar a été barboté dans le mélange pendant 30  min, la température a été augmentée à 70 °C et 0,08  g de K₂ S₂ O₈ dissous dans 1 ml de H₂ O a été injecté pour amorcer la polymérisation. Deuxièmement, la coque PNIPAM a été superposée sur le noyau PS-co-PNIPAM. A cet effet, le réacteur a été additionné d'une solution aqueuse de monomère NIPAM (1,8 g) et d'agent de réticulation N ,N ′-méthylènebisacrylamide (BIS) (0.18 g) dans 4 ml H₂ O à l'aide d'une seringue. On a laissé la réaction se poursuivre pendant 4 h à 70 °C. Le mélange a été refroidi à température ambiante et dialysé pendant 74 h en utilisant une membrane de cellulose avec MWCO 3500  Da. En conséquence, la suspension des nanoparticules PS-PNIPAM a été fabriquée; une structure cœur-coquille des nanoparticules est clairement révélée par les images de microscopie électronique à transmission (MET) (Fig. 3a). Afin d'obtenir des PNP fluorescents NIR-SWIR, le 2-butyl-6-[5-(2-butyl-1,3-diméthylcyclo-hepta[c]pyrrol-6(2H)-ylidène)penta-1,3-dien Le colorant fluorescent -1-yl]-1,3-diméthylcyclohepta[c]pyrrolium tétra-fluoroborate (étiqueté JB9-08) [46] a été post-chargé [47] sur des nanoparticules PS-PNIPAM. Huit microlitres de solution de colorant 1 mM JB9-08 dans du DMF ont été ajoutés à 2 mL de suspension aqueuse de PNP à 0,25 % en poids et conservés pendant 24 h avant utilisation.

Synthèse des RENP Core-Shell

Les RENPs ont été synthétisés suivant le protocole modifié rapporté ailleurs [48]. Premièrement, le α-NaYF₄  : 10 %Yb ³⁺ , 30 % Nd ³⁺ des nanoparticules de noyau ont été préparées par décomposition du trifluoroacétate de métal à haute température. Dans une procédure typique, 0,05  mmol Yb₂ O₃ , 0,15 mmol Nd₂ O_3, et 0,25 mmol Y₂ O₃ ont été chargés dans un flacon de 250 ml contenant 5 ml d'eau déminéralisée et 5 ml de TFA et chauffés à 90°C pendant 1 h pour donner une solution limpide. La solution claire résultante a été évaporée à cette température sous purge d'argon pour obtenir du RE(TFA)₃ en poudre boueux. . Par la suite, 8 ml d'OA, 8 ml d'OM, 12 ml d'ODE et 2 mmol de NaTFA ont été ajoutés dans le flacon. La solution a été chauffée à 120 °C et maintenue à cette température pendant 30 minutes, suivie d'un chauffage jusqu'à 300 °C pendant 30 minutes avant de refroidir naturellement à température ambiante. Un environnement d'argon a été appliqué pendant tout le processus de synthèse. Les nanoparticules résultantes ont été précipitées en ajoutant 20 mL d'éthanol au ballon de réaction refroidi. Après trois lavages centrifuges à l'éthanol, la poudre blanche collectée a finalement été dispersée dans 10  ml d'hexane pour d'autres utilisations.

Deuxièmement, le α-NaYF₄  : 10 %Yb ³⁺ , 30 % Nd ³⁺ @CaF₂ Les RENP core-shell ont été préparés via un processus de croissance épitaxiale à médiation par les semences, impliquant l'utilisation de α-NaYF₄  : 10 % Yb ³⁺ , x% Nd ³⁺ noyau comme germe et la croissance correspondante dans la solution de précurseur de coquille. Pour préparer le précurseur d'enveloppe, tout d'abord, 2 mmol de CaO avec 5 ml d'eau déminéralisée et 5 ml de TFA ont été ajoutés dans un flacon de 250 ml et chauffés à 90°C pendant 1 h pour produire une solution claire. Cette solution a ensuite été évaporée à cette température pour donner le précurseur d'enveloppe de trifluoroacétate de calcium (Ca(TFA)₂ ). Ensuite, 0,5 mmol de NaYF₄  : 10 % Yb ³⁺ , 30 % Nd ³⁺ des nanoparticules de noyau, 7 ml d'OA et 7 ml d'ODE ont toutes été ajoutées au flacon. La solution a ensuite été chauffée à 120°C pendant 30 min, suivie d'un chauffage jusqu'à 300 °C pendant 60 min avant de se refroidir naturellement. L'ensemble du processus a été réalisé sous un environnement d'argon. Les nanoparticules core-shell résultantes ont été précipitées en ajoutant 20 mL d'éthanol au ballon de réaction refroidi. Après trois lavages centrifuges avec de l'éthanol, les NP core-shell collectées ont finalement été dispersées dans 10 ml d'hexane pour d'autres utilisations. Pour la préparation de la dispersion aqueuse, le α-NaYF₄ préparé  : 10 %Yb ³⁺ , 30 % Nd ³⁺ @CaF₂ Les RENP core-shell (dispersion d'hexane 5 mL) ont d'abord été mélangés avec 5 mL de N ,N -Solution de diméthylformamide (DMF) de tétrafluoroborate de nitrosonium (NOBF₄ ) (0,1 M) à température ambiante. Une agitation douce a été appliquée au mélange jusqu'à une observation de la précipitation de RENP. Par la suite, du toluène et de l'hexane (1:1, volume) ont été ajoutés au mélange, qui a ensuite été centrifugé à 10 000 tr/min pendant 10 min. Le précipité a été récupéré et dispersé dans 5 mL de DMF. Deuxièmement, 250 mg de poly(acide acrylique) (PAA, MW = 18 000) ont été ajoutés à la solution de 5 mL de DMF de NOBF₄ -RENPs traités, qui ont été chauffés à 80 °C et maintenus à cette température pendant 30 min sous agitation vigoureuse. Après cela, les NP ont été précipitées en ajoutant de l'acétone, lavées à l'éthanol et finalement dispersées dans de l'eau distillée.

Microscopie électronique à transmission

Les morphologies des PNP et RENP ont été évaluées par microscopie électronique à transmission (MET). Pour être imagé avec TEM, 10 μL de suspension de nanoparticules ont été déposés sur les films de support de carbone stabilisés avec formvar. Afin de visualiser la structure noyau-enveloppe des PNP, ils ont été colorés négativement avec une solution aqueuse à 1 % d'acide phosphotungstique avant de les déposer sur les films de support. Les films de support de carbone ont été séchés à l'air et lavés avec 5 L d'eau pure. Les images ont été obtenues en opérant à une tension d'accélération de 100 kV sur TEM (JEM-1230, JEOL).

Spectroscopie de photoluminescence

Les spectres PL pour les deux types de nanoparticules ont été mesurés dans les gammes NIR et SWIR à l'aide d'un spectrofluoromètre Fluorolog-3 équipé d'un spectromètre iHR320 pour la gamme NIR-SWIR (Horiba) ; une diode laser couplée à la fibre émettant à 808  nm (QSP-808-4, QPhotonics) a été utilisée pour exciter la PL des PNP et RENP.

Système d'imagerie hyperspectrale

Le système SWIR HSI fait maison exploite la méthode d'acquisition séquentielle de bande (Fig. 2) et comprend une caméra NIR (Xeva-1.7-320, Xenics, Belgique), une optique de mise au point (TEC-M55MPW, Computar, USA) et un filtre à cristaux liquides accordable (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, USA) comme élément dispersif. Le système a une résolution de 340 × 258 pixels et fonctionne dans la plage spectrale de 900–1700 nm. Les sources d'éclairage du système comprennent une lampe à incandescence (pour l'alignement de l'image, la mise au point et l'imagerie en champ clair) et une diode laser couplée à la fibre 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics, USA), alimentée par une source d'alimentation laser (Laser Source 4308 , Arroyo Instruments, USA), pour l'excitation PL en imagerie PL. L'acquisition du cube de données spectrales a été réalisée par réglage séquentiel de la transmittance LCTF d'une largeur spectrale de 20 nm dans la plage de 900 à 1200 nm avec un pas de 10 nm et en capturant les images correspondantes. Le temps d'exposition de la caméra NIR pendant l'acquisition HSI a été réglé à 200 µms. La densité de puissance laser sur l'échantillon a été fixée à ~ 100 mW/cm ² . Pour l'acquisition d'images PL dans toute la gamme NIR-SWIR, le LCTF a été remplacé par un filtre passe-passe de 850 nm (Edmund Optics, USA).

Schéma de principe du système d'imagerie hyperspectrale NIR-SWIR

Logiciel de démixage spectral

Pour l'analyse du cube de données spectrales obtenu, nous avons développé un algorithme de démixage spectral à l'aide de l'environnement MATLAB. Le spectre de chaque pixel est considéré comme un mélange linéaire de membres d'extrémité connus :\( F\left(\lambda \right)=\sum \limits_i{a}_i{G}_i\left(\lambda \right) \), où F (λ ) :spectre de pixels, G _i — spectres endmembers, et a _je sont des abondances de membres finaux. Le but du logiciel de démixage est d'estimer les abondances d'extrémités connues en résolvant le problème d'analyse de mélange spectral linéaire (LSMA) dans chaque pixel du cube de données spectrales acquis. Supposons, L est le nombre de bandes spectrales, et p est le nombre d'extrémités présentes dans un mélange. Ensuite, le problème LSMA peut être énoncé comme F = Ga + n , où F est L × 1 vecteur d'intensités de pixels, G est L × p matrice contenant tous les vecteurs endmembers, a est p × 1 vecteur d'abondances inconnues, et n est L × 1 vecteur d'erreur. La méthode basée sur l'erreur des moindres carrés (LSE) pour résoudre le problème LSMA peut être formée comme la tâche d'optimisation suivante : min_a {(F − Ga ) ^T (F − Ga )}, et la solution classique est a (r ) = (G ^T G ) ⁻¹ G ^T F . Cependant, une telle solution peut contenir des valeurs négatives pour les abondances, qui n'ont aucune signification physique. Pour résoudre cet obstacle, la tâche d'optimisation LSE doit être modifiée :min_a {(F − Ga ) ^T (F − Ga )}, sous réserve de a 0. Pour résoudre cette tâche, nous utilisons un algorithme itératif, basé sur une analyse de mélange spectral linéaire avec contrainte de non-négativité (NC-LSMA) qui est décrite en détail dans [49, 50]. Après le calcul des abondances pour chaque composant, ils sont cartographiés sous forme de graphiques en couleurs 2D. Enfin, le logiciel de démixage fournit des images d'intensité des composants correspondants, en fonction des abondances obtenues :\( {I}_i\left(x,y\right)={a}_i\left(x,y\right)\sum \limits_ {\lambda }{G}_i\left(\lambda \right) \), où I _je (x , y )—intensité intégrale de i -e endmember en pixel, et a _i (x , y )—i -ème abondance.

Expériences animales

Les souris nude BALB/c (Source :The Jackson Laboratory, USA) ont été élevées dans des conditions d'obscurité et d'asepsie dans une petite animalerie. Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux critères de la réglementation nationale chinoise pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Avant l'imagerie, des souris nudes mâles (âgées de 6 semaines, 20 ± 2 g) ont été anesthésiées avec 5 % d'hydrate de chloral (0,06 ml par gramme de poids de souris) par injection intrapéritonéale. Pour l'imagerie SWIR PL in vivo, les nanoparticules ont été suspendues dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 10x et 100 μL de chaque suspension PBS de PNP, RENP ou leur mélange ont été injectés par voie sous-cutanée aux souris.

Résultats et discussion

Deux types de NP photoluminescentes SWIR ont été préparés pour une utilisation en HSI :(1) les PNP post-chargées avec le colorant JB9-08, qui est pratiquement non fluorescent dans les solutions aqueuses [46] mais, comme nous l'avons montré [51], restaure sa fluorescence dans l'eau par post-chargement dans une matrice polymère de PNP (Fig. 3a et b) et (2) NaYF enrobé de PAA₄ :10%Yb ³⁺ ,30%Nd ³⁺ @CaF₂ nanoparticules cœur-coquille dopées aux ions de terres rares (RENP, Fig. 3c et d). Nd ³⁺ les ions au cœur des RENP peuvent être excités avec une lumière ~ 808 nm ( ⁴ Je_9/2 →  ⁴ F_5/2 transition) et transférer l'énergie à Yb ³⁺ ions, qui émettent dans la plage 950–1100 nm avec un pic à ~ 975 nm ( ² F_5/2 →  ² F_7/2 transition). Le noyau RENPs a été recouvert de CaF₂ inerte coquille pour réduire les pertes non radiatives par les défauts de surface et l'interaction avec le milieu environnant [48]. Les deux nanoformulations présentent une photoluminescence dans la plage 900–1200 sous une excitation de 808  nm (Fig. 3e).

Caractérisation des PNP et RENP. Image TEM (a ) et la structure schématique (b ) de PNP chargés avec le colorant JB9-08. Image TEM (c ) et la structure schématique (d ) des RENP. e Spectres d'émission PL normalisés des suspensions PNPs-JB9-08 et RENPs sous excitation de 808 nm. Barres d'échelle, 100 nm

Il convient de noter que les spectres d'émission PL des nanoparticules obtenues avec un spectrofluoromètre ne peuvent pas être utilisés comme endmembers dans un logiciel de démixage spectral pour deux raisons. Premièrement, la sensibilité du système HSI n'est pas corrigée spectralement, contrairement au spectrofluoromètre conventionnel, de sorte que le profil spectral d'émission acquis est différent pour les deux méthodes d'acquisition. Deuxièmement, les trames HSI sont collectées avec un pas de 10 nm, bien que la bande passante spectrale de LCTF soit de 20 nm. Cela se traduit par un chevauchement du signal dans les trames voisines, provoquant une distorsion du profil spectral obtenu par rapport à celui mesuré avec le spectrofluoromètre. Pour surmonter ces obstacles, les endmembers (profils spectraux des échantillons PNPs et RENPs) ont été acquis avec le système HSI. Dans ce but, les deux types de nanosondes ont été suspendus dans du PBS et leurs suspensions de PBS ont été placées dans des tubes de microcentrifugation (Fig. 4a). Il est difficilement possible de différencier deux échantillons avec l'imagerie PL conventionnelle, car leurs spectres d'émission PL se chevauchent (Figs. 4b et 3e). En utilisant le système HSI, 31 images PL ont été collectées dans une gamme spectrale de 900 à 1200 nm avec un pas de 10 nm (Fig.4c). Les profils spectraux des PNP, RENP et fond (BG) ont été calculés à travers la dimension spectrale du cube de données spectrales en faisant la moyenne du signal dans les zones marquées par des carrés rouges, bleus et verts, de manière correspondante (Fig.4b). Les profils spectraux obtenus pour les PNP et les RENP (Fig. 4d) se sont avérés similaires à ceux mesurés par spectrofluoromètre et ont ensuite été utilisés comme éléments terminaux pour le démixage spectral. Par la suite, avec les profils spectraux PNP, RENP et BG en tant que membres terminaux, les abondances des composants correspondants sont calculées et cartographiées sous forme de tracés de carte de couleurs 2D (Fig. 4e). Les abondances ont été calculées pour chaque pixel spatial de l'hypercube et ont été représentées par une valeur de 0 à 1, 0 et 1 indiquant l'absence totale et l'abondance totale du composant, respectivement. La somme des abondances de tous les composants dans chaque pixel est égale à 1. Il est à noter qu'un logiciel de démixage a utilisé un seuillage par intensité du signal pour éliminer les erreurs causées par les pixels de faible intensité. Si l'intensité maximale d'un pixel le long de la dimension spectrale était inférieure à 5% du maximum de l'hypercube entier, un tel pixel était considéré comme pleinement abondant avec une composante de bruit. En outre, les images d'intensité intégrale des PNP et RENP ont été calculées en tenant compte des abondances correspondantes et en éliminant la composante de fond (Fig. 4f). Comme prévu, la cartographie de l'abondance et les images d'intensité intégrale démontrent l'abondance totale des PNP dans le tube droit et des RENP dans le tube gauche, avec une légère erreur causée par la diffusion d'émission PL et l'imperfection de l'algorithme de démixage.

HSI de tubes de microcentrifugation contenant des RENP et des PNP. un Image en champ clair de tubes de microcentrifugation avec PNP et RENP en suspension dans du PBS. b Image PL d'échantillons de PNP et RENP excités avec 808  nm (un filtre passe de 850 nm de long a été utilisé pour l'acquisition d'images). c Schéma illustrant l'hypercube composé de trames HSI. d Profils spectraux des PNP, RENP et bruit de fond (BG) moyennés à partir du ROI indiqué dans b comme des carrés rouges, bleus et verts, en conséquence. e Cartes en couleurs des abondances des composants. f Images d'intensité reconstruites des composants PL et image fusionnée PL/champ lumineux

Le démixage spectral est également capable de distinguer le mélange de PNPs, RENPs. Pour le démontrer, trois tubes de microcentrifugation ont été remplis de solutions de PNP, de RENP et de leur mélange. Après acquisition de l'hypercube et procédure de démixage spectral, la cartographie de l'abondance indique la présence complète de PNP dans le premier tube de microcentrifugation, de RENP dans le second et d'un mélange des deux dans le troisième (Fig. 5a). La reconstruction des images d'intensité a ensuite été réalisée pour révéler la distribution d'intensité des signaux PNP et RENP PL dans l'échantillon (Fig. 5b).

HSI de tubes de microcentrifugation contenant (de gauche à droite) des RENP, des PNP et un mélange des deux. un Abondance de PNPs, RENPs et background (BG). b Images d'intensité PL reconstruites et image fusionnée PL/champ lumineux

Nous avons en outre démontré l'applicabilité de notre méthode HIS pour multiplexer les nanosondes à chevauchement spectral dans l'imagerie SWIR PL in vivo. La souris nue a été anesthésiée et injectée par voie sous-cutanée avec des PNP, des RENP et un mélange des deux. L'imagerie NIR avec un filtre passe à 850 nm de long montre trois taches photoluminescentes indiscernables (Fig. 6a). Après avoir effectué le HSI et l'analyse, la cartographie des abondances montre les abondances complètes des PNP et RENP dans les sites d'injection supérieur et inférieur, respectivement, tandis qu'un mélange de deux a été identifié dans le site d'injection gauche (Fig. 6b). De plus, pour acquérir la distribution d'intensité PL, une reconstruction d'intensité a été réalisée (Fig. 6c). En ajustant la valeur de seuil dans le logiciel de démixage à 15 % (estimée empiriquement), il est devenu possible de supprimer le bruit dans les zones adjacentes aux spots d'émission (Fig. 6d). Ces résultats indiquent que contrairement à la modalité d'imagerie PL conventionnelle, qui utilise des filtres optiques longs ou passe-bande, HSI est non seulement capable de cartographier la distribution d'intensité dans l'échantillon, mais peut également multiplexer les composants présents dans le mélange en identifiant le profil spectral d'intensité dans chaque pixel de l'image.

HSI de souris injecté par voie sous-cutanée avec des PNP (site d'injection en haut à droite), des RENP (en bas à droite) et un mélange RENPs/PNP (à gauche). un Fond clair (SWIR), SWIR PL et images fusionnées acquises avec un filtre d'émission à passe long de 850 nm. b Abondance de PNPs, RENPs et background (BG). c Images d'intensité reconstruites correspondantes. d Images d'intensité PL reconstruites à partir d'abondances avec un seuil de 15 % et image fusionnée PL/champ lumineux.

Ainsi, la combinaison de l'acquisition HSI et du traitement de démixage spectral a été appliquée dans ce travail pour obtenir une imagerie multiplexée des nanosondes SWIR PL qui se chevauchent spectralement. Cependant, quelques problèmes doivent être pris en compte en ce qui concerne l'applicabilité de la modalité HSI. First, due to the spectrally narrow acquisition, every HSI frame deals with relatively low signal intensity (especially in the case of the spectrally broad PL emission form the organic moieties). In addition, an increase in the PL exciting laser power in biological imaging is limited by danger of tissue damage (or phototoxicity). This results in higher requirements for the brightness of the PL probes and their photostability, as HSI can require order of magnitude longer acquisition time in comparison with conventional PL imaging. It should also be noted that the linear mixture analysis and spectral unmixing algorithm can work satisfactorily for multiplexed PL imaging of biological tissues in the spectral range where tissue transmittance does not change much. In contrast, if tissue transmittance has distinctive features in the spectral range of HSI, linear spectral mixture model may be hardly applicable (especially in case of deeper tissues) and nonlinear models can be considered.

Conclusions

In conclusion, we developed a hyperspectral SWIR bioimaging technique and applied it for multiplexing of nanoparticles emitting in SWIR spectral range. Two types of nanoparticles with overlapping PL spectra, which are undistinguishable in conventional imaging, were successfully multiplexed by their PL spectral profiles using hyperspectral acquisition along with the linear spectral mixture analysis algorithm. The developed method was successfully employed for multiplexed imaging of SWIR PL nanoparticles both in sample suspensions and injected in small animals. With SWIR bioimaging having superior resolution at higher imaging depth, SWIR HSI approach holds a great potential for use in various applications requiring multiplexed imaging with NIR-SWIR PL nanoprobes. Furthermore, as SWIR bioimaging is at a very early stage, there is plenty of room for the development of biomedical applications of PL probes in a combination with HSI.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié.

Abréviations

BG:

Background

HSI:

Hyperspectral imaging

LCTF:

Liquid crystal tunable filter

NIR :

Proche infrarouge

NP :

Nanoparticules

PL :

Photoluminescence

PNIPAM:

Poly-N -isopropylacrylamide

PNPs:

Polymeric nanoparticles

PS :

Polystyrène

RENPs:

Rare-earth doped fluoride nanoparticles

SWIR:

Short-wave infrared

TEM :

Microscopie électronique à transmission