Biocapteur à transistor à effet de champ en graphène magnétique pour la détection d'ADN simple brin

Introduction

La détection de l'ADN est d'une grande importance pour l'étude de la biologie moléculaire et le diagnostic des maladies génétiques [1,2,3]. À ce jour, divers biocapteurs pour la détection de l'ADN ont été développés, notamment des biocapteurs fluorescents [4, 5], des biocapteurs électrochimiques [6,7,8,9] et des biocapteurs à transistors à effet de champ (FET) [10,11,12,13 ], ces derniers ayant attiré une large attention en raison de leur grande sensibilité et spécificité. Kaisti et al. [12] ont développé un biocapteur FET pour détecter l'ADN simple brin non marqué à l'aide de sondes d'acide nucléique peptidique. Kim et al. [13] ont fabriqué un capteur de charge ADN de type FET basé sur la technologie standard des semi-conducteurs à oxyde métallique complémentaire.

En raison de sa surface spécifique élevée, de sa conductivité électrique élevée et de son excellente mobilité électronique, le graphène a été annoncé comme un matériau idéal pour la fabrication de biocapteurs FET [14,15,16]. Cai et al. [15] ont développé un biocapteur au graphène FET (GFET) pour la détection ultrasensible de l'ADN via l'hybridation d'ADN d'acide nucléique peptidique. Notre groupe a également proposé un biocapteur GFET multicanaux pour déterminer la cinétique de liaison et l'affinité de l'hybridation de l'ADN et des mésappariements à base unique [16].

Dans un GFET conventionnel, un champ électrique d'électrode de grille externe génère une double couche conductrice à l'interface entre le film de graphène et l'électrolyte en solution [17,18,19]. Sur la base d'un modèle captif de GFET [16], l'électrode de grille charge et décharge la double couche conductrice à travers l'électrolyte, modulant ainsi la conductivité du GFET. Par conséquent, la conductivité d'un GFET est liée à l'intensité du champ électrique externe et à la concentration en ions dans l'électrolyte.

Au cours de la recherche, il a été constaté que la recherche sur la sensibilité des GFET a atteint le niveau fM. Par exemple, Ping et al. [20] et Zheng et al. [21] ont rapporté des biocapteurs GFET conventionnels avec une limite de détection au niveau fM. Cependant, la littérature ci-dessus atteint une sensibilité extrêmement élevée par détection d'analyseur de semi-conducteurs, ce qui est coûteux et peu pratique pour des applications pratiques. De plus, les électrodes Ag/AgCl sont couramment utilisées comme électrodes de grille externes, qui ne conviennent pas à la construction de biocapteurs intégrés en raison de leur taille et de leur réutilisation.

Ici, un biocapteur magnétique GFET (MGFET), dans lequel un champ magnétique plutôt qu'un champ électrique est utilisé pour moduler la conductivité du GFET, a été développé. Le canal conducteur a été réalisé à l'aide d'un film de graphène de dépôt chimique en phase vapeur (CVD) transféré sur un substrat de verre avec deux électrodes d'oxyde d'indium et d'étain (ITO). Le film de graphène a été fonctionnalisé avec de l'ester succinimidylique d'acide 1-pyrènebutanoïque (PBASE) pour permettre la liaison d'un aptamère sonde pour capturer et s'hybrider avec un ADN simple brin (ADNc) marqué magnétiquement. En appliquant un champ magnétique périodique à l'arrière des MGFET, une impédance électrique MGFET périodique a été obtenue. De plus, la fluctuation de l'impédance électrique des MGFET dans un champ magnétique périodique était liée à la concentration d'ADNc. Un dispositif de détection correspondant fabriqué en laboratoire a été construit pour détecter l'impédance MGFET en temps réel. Étant donné que le champ magnétique n'est pas en contact direct avec les MGFET, les MGFET préparés ici sont plus faciles à intégrer et à appliquer que les biocapteurs GFET conventionnels. La préparation des MGFET, la construction du système de détection fabriqué en laboratoire et le principe de détection ont tous été décrits en détail dans cet article.

Méthodes

Matériaux et instrument

Un substrat de verre avec des électrodes ITO a été acheté auprès de Hua Nan Xiang Cheng Ltd. (Chine). L'aptamère sonde, l'ADNc et l'ADN mésapparié ont été achetés auprès de Sangon Biotech Inc. (Shanghai, Chine). La séquence de l'aptamère sonde était (5′-NH₂ -TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3′), la séquence de l'ADN complémentaire était (5′-NH₂ -GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA-3′), la séquence de l'ADN complètement mésapparié était (5′-NH₂ -TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3′), et la séquence de l'ADN mésapparié à base unique était (5′-NH₂ -GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3′). Le PBASE et le diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (Shanghai, Chine). Des nanobilles magnétiques (MB) modifiées avec des groupes carboxyle (10 mg/mL) ont été obtenues auprès de Xianfeng Nano Material Technology Co., Ltd. (Nanjing, Chine). Le chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide, le N-hydroxysuccinimide, le dodécylbenzènesulfonate de sodium (SDS) et la solution saline tamponnée au phosphate de dodécyl sulfate de sodium (PBS, P5368-10PAK ; pH 7,4) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Shanghai , Chine).

Un système microscopique Raman (SPEX-1403, SPEX) a été utilisé pour caractériser la qualité du graphène ainsi que pour vérifier la fonctionnalisation des MGFET. Un photomètre à fluorescence (LS55, PerkinElmer) a été utilisé pour caractériser le couplage de nanoparticules magnétiques à l'ADNc. Un système d'acquisition de données fabriqué en laboratoire a été utilisé pour enregistrer l'impédance des MGFET en temps réel.

Couplage de l'ADNc aux MB

Après une dispersion uniforme par ultrasons pendant 20 min, une suspension de 20 μL de MB modifiés avec des groupes carboxyle a été mélangée avec 200 μL de chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (2 mg/mL) et 200 μL de N- hydroxysuccinimide (2 mg/mL) pendant 15 min pour obtenir des MB activés [22, 23]. Ensuite, 20 L de solution d'ADNc ont été ajoutés à la solution de MBs et incubés pendant 2 h à température ambiante avec une agitation douce continue. Un champ magnétique a ensuite été introduit pour enrichir les échantillons d'ADNc à travers les MB. Les conjugués nanobilles magnétiques/ADN (MB/ADNc) ont été lavés trois fois avec du PBS et dispersés dans du PBS pour une utilisation future.

Fabrication de MGFET

La préparation des MGFET est décrite en détail ci-dessous. Tout d'abord, un film de graphène CVD a été transféré sur une plaque de verre comme canal conducteur entre les deux électrodes ITO (Fig. 1a), comme décrit précédemment [18, 19]. Deuxièmement, du PBASE (10  mM) dissous dans du DMSO a été injecté dans les MGFET pendant 12  h à température ambiante et laissé réagir complètement avec le graphène par empilement π–π (Fig. 1b). Les MGFET ont ensuite été lavés successivement avec du DMSO et du PBS pour éliminer toute PBASE n'ayant pas réagi. Troisièmement, 2 M de l'aptamère de la sonde ont été introduits dans les MGFET et incubés avec PBASE pendant 4 h à température ambiante, permettant à l'aptamère de la sonde de réagir suffisamment avec PBASE (Fig. 1c). Les MGFET ont ensuite été respectivement lavés avec 0,2% de SDS trois fois pour éliminer tout aptamère de sonde non lié.

Principe de fonctionnalisation et de détection des MGFET. un Film de graphène développé par dépôt chimique en phase vapeur. b Fonctionnalisation du graphène par PBASE. c Immobilisation de la sonde aptamère via PBASE. d Hybridation de l'aptamère sonde avec l'ADNc. e Photographie du dispositif de détection

Résultats et discussion

Caractérisation des MGFET

Un film de graphène produit par la méthode CVD a été transféré sur un substrat de verre en tant que canal conducteur entre deux électrodes ITO (Fig. 1a). Le film de graphène transféré a été caractérisé avec le spectre Raman (Fig. 2). L'apparition des trois pics caractéristiques du graphène a démontré le transfert réussi du film de graphène sur le substrat de verre [24, 25]. Le rapport d'intensité entre la bande 2D et la bande G (I_2D /I_G ) a indiqué que le graphène transféré était un film multicouche [26]. De plus, le rapport d'intensité entre la bande D et la bande G (I_D /I_G ) était faible, indiquant une densité de défauts très faible.

Spectre Raman

En raison du manque de groupes fonctionnels, les chaînes d'aptamères étaient difficiles à modifier sur le film de graphène CVD. Par conséquent, sur la base de son groupe pyrényle aromatique, PBASE a été modifié sur les films de graphène via un empilement π–π en tant que lieur. À l'autre extrémité de PBASE, la partie succinimide de PBASE pourrait être couplée au 5′-NH₂ -sonde aptamère marquée basée sur la réaction de réticulation du N-hydroxysuccinimide (NHS) (Fig. 1c). Afin d'évaluer la liaison de l'aptamère sonde sur film de graphène, l'extrémité 3' de l'aptamère sonde a été marquée à l'aide du fluorophore FAM (séquence :5'-NH₂ -TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3′). Immédiatement après l'introduction de l'aptamère, l'intensité de la fluorescence était manifestement augmentée, indiquant sa modification réussie sur la surface du graphène (Fig. 3). L'augmentation de la concentration de l'aptamère de la sonde a conduit à une augmentation de l'intensité de fluorescence, atteignant une valeur constante, et indiquant donc une saturation de l'aptamère de la sonde sur les MGFET, à environ 2 M. Par conséquent, des expériences ultérieures ont été réalisées à une concentration d'aptamère de sonde de 2  μM.

Caractérisation de la modification des MGFET par aptamère sonde. La barre d'erreur représente l'écart type de 5 analyses indépendantes

Caractérisation de MB/ADNc

La morphologie des conjugués MBs et MB/ADNc a été caractérisée par microscopie électronique à transmission (MET) (Fig. 4a, b). La distribution granulométrique des MB a montré une taille de particule moyenne d'environ 7  nm (Fig. 4c). Afin d'assurer la sensibilité et la précision de la biodétection pour l'ADNc, les MB doivent être excessifs pour l'ADNc afin de capturer complètement l'ADNc. Les MB à une concentration de 4 mg/mL ont été activés pour assurer la liaison aux échantillons d'ADNc utilisés ici. Grâce au marquage de l'ADNc par FAM, l'intensité de fluorescence a été exploitée pour caractériser l'efficacité de couplage et optimiser la concentration en ADNc (Fig. 4d). En effet, l'intensité de fluorescence du surnageant a manifestement diminué suite à l'introduction de MB dans les solutions d'ADNc, indiquant que l'ADNc a été capturé et enrichi par les MB. La capture réussie de l'ADNc par les MB a été confirmée par l'observation qu'à une concentration d'ADNc de 10 nM, l'intensité de fluorescence du surnageant était équivalente à celle du PBS, indiquant que tout l'ADNc a été capturé et enrichi par les MB (Fig. 4d ).

Caractérisation du couplage MB/ADNc. un TEM de MB. b TEM des conjugués MB/ADNc. c Distribution granulométrique des MB. d Caractérisation du couplage MB/ADNc (FAM). La barre d'erreur représente l'écart type de 5 analyses indépendantes

Analyse de l'intensité du champ magnétique

Les conjugués MB/ADNc ont été ajoutés dans les MGFET pendant 10 min pour permettre une hybridation complète de l'ADNc avec l'aptamère sonde. Étant donné que l'aptamère sonde ne pouvait pas se coupler avec les MB sans les groupes amino modifiés, les MB en excès ont pu être éliminés par lavage des MGFET trois fois avec du PBS. Par conséquent, seuls les conjugués MB/ADNc ont été laissés sur les MGFET (Fig. 1d). Un aimant permanent a été monté sur un moteur rotatif pour appliquer un champ magnétique périodique aux MGFET (Fig. 1e). Un dispositif de détection fabriqué en laboratoire a été utilisé pour enregistrer la fluctuation d'impédance des MGFET.

Étant donné que l'impédance des MGFET était modulée par un champ magnétique en tant que porte arrière, la corrélation entre l'intensité du champ magnétique et l'impédance des MGFET a été étudiée pour optimiser les paramètres d'intensité du champ magnétique (Fig. 5). On pense généralement que la double couche conductrice formée entre le graphène et l'électrolyte est modulée par le champ électrique externe, modulant ainsi la conductivité des GFET [19, 27, 28]. Dans les MGFET, grâce à la force magnétique entre les MB et le champ magnétique, la distance entre les conjugués MB/ADNc et le film de graphène était contrôlée mécaniquement, modulant ainsi la double couche conductrice des MGFET [29, 30]. L'impédance des biocapteurs MGFET variait avec l'intensité croissante du champ magnétique en trois étapes, ce qui pourrait être expliqué en prenant la chaîne MB/ADNc comme une tige mince élastique [31]. La première étape s'est produite à une intensité de champ magnétique inférieure à 100 mT dans ce travail. Sur la base du modèle de tige mince élastique des chaînes d'ADN, car la force du champ magnétique est inférieure à la force de support radiale du brin d'ADN, la force du champ magnétique est difficile à faire plier le brin d'ADN ; par conséquent, les MGFET ne sont pas sensibles au champ magnétique. Dans la deuxième étape avec l'intensité du champ magnétique de 100 à 200 mT, l'intensité du champ magnétique est suffisante pour surmonter la force de support radiale de la tige mince élastique d'ADN, ce qui entraîne une flexion rapide du MB/ADNc, puis une réponse sensible de les MGFET au champ magnétique. Enfin, dans la troisième étape avec une intensité de champ magnétique supérieure à 220 mT, la flexion de la tige élastique d'ADN atteint sa limite ; par conséquent, les MGFET ne répondront pas au changement du champ magnétique, ce qui entraînera une impédance stable des MGFET, comme le montre la figure 5b.

Influence de l'intensité du champ magnétique sur l'impédance des MGFET. un Impédance des MGFET sous une intensité de champ magnétique variable dans le domaine temporel. b Relation entre l'impédance des MGFET et l'intensité du champ magnétique. La barre d'erreur représente l'écart type de 5 analyses indépendantes

Détection d'ADNc

Les changements d'impédance MGFET avec différentes concentrations de conjugué MB/ADNc ont été mesurés sous une intensité de champ magnétique fixe de 240 mT pour déterminer la faisabilité et la sensibilité de la détection d'ADNc.

L'impédance MGFET à chaque concentration d'ADNc a été enregistrée en temps réel (Fig. 6a). Lorsqu'un aimant permanent était chargé à l'arrière des MGFET, l'impédance augmentait rapidement. Inversement, lorsqu'un champ magnétique périodique était appliqué, un changement périodique d'impédance était observé. Sur la base de cette périodicité d'impédance, un algorithme d'intégration d'échantillons (SIA) a été utilisé pour augmenter le rapport signal/bruit des MGFET. Étant donné la période sans application de champ magnétique était T₀ et la période d'application du champ magnétique était T_M (Fig. 6a), le SIA pourrait être décrit avec les étapes suivantes :(1) pendant T₀ , tous les points de données, produits par le bruit, ont été normalisés à zéro, (2) les points de données obtenus au cours de chaque T_M période ont été échantillonnés et moyennés dans l'ordre. Après un traitement SIA sur quatre cycles, le changement d'impédance périodique dans les MGFET a été obtenu comme le montre la figure 6b. En théorie, le rapport signal sur bruit des MGFET pourrait être efficacement amélioré en utilisant des temps d'échantillonnage suffisamment longs.

un Domaine temporel des fluctuations d'impédance avec différentes concentrations d'ADNc. b Changements d'impédance des MGFET en fonction de la concentration d'ADNc

Les changements d'impédance dans les MGFET avaient une corrélation positive avec la concentration d'ADNc (Fig. 6b). La corrélation entre le changement d'impédance des MGFET et la concentration d'ADNc a été évaluée (Fig. 7). La haute sensibilité des biocapteurs MGFET dans ce travail est principalement basée sur les deux aspects suivants :d'une part, le mouvement mécanique des conjugués MB/ADNc pourrait renforcer l'effet de modulation sur la double couche conductrice par rapport au cas de l'ADN seul, et d'autre part, étant donné qu'un champ magnétique périodique pouvait être appliqué pour produire des changements d'impédance périodiques des MGFET, sur la base du principe d'intégration d'échantillonnage, seule l'impédance MGFET avec le champ magnétique a été échantillonnée et intégrée pour réduire le bruit. Par conséquent, le rapport signal/bruit du système pourrait être grandement optimisé en augmentant le nombre de périodes du champ magnétique externe.

Relation entre l'impédance des MGFET et la concentration de l'ADN cible. La barre d'erreur représente l'écart type de 5 analyses indépendantes

Sélectivité des MGFET

La spécificité des MGFET a été évaluée en détectant deux séquences d'ADN cibles différentes, y compris des chaînes d'ADN complètement mésappariées et des chaînes d'ADN mésappariées à base unique. Semblable à la procédure décrite ci-dessus, un ADN complètement incompatible (séquence :5′-NH₂ -TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3′) et ADN mésapparié à base unique (séquence :5′-NH₂ -GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3′) ont été couplés respectivement à des MB. Le MB/ADN mésapparié dissous dans une solution de PBS a été ajouté dans les biocapteurs MGFET pendant 10 min pour réagir suffisamment avec l'aptamère. Les MGFET ont été lavés avec du PBS trois fois pour éliminer l'ADN mésapparié. Pour les chaînes d'ADN complètement mésappariées, en raison du fait que le conjugué MB/ADN ne pouvait pas s'hybrider avec l'aptamère, presque tous les conjugués MB/ADN ont été retirés. Par conséquent, l'ajout de MB/ADN complètement incompatible n'a presque aucun effet sur la conductivité du graphène, comme le montre la figure 8, ce qui indique une sélectivité élevée du biocapteur. En outre, nous avons également étudié la sélectivité des biocapteurs à travers des chaînes d'ADN à base unique non appariées, comme le montre la Fig. 7. le brin cible non complémentaire sur chaque certaine concentration. Par conséquent, le brin mésapparié à base unique pourrait être détectable dans ce travail. Bien que l'aptamère et les chaînes d'ADN complémentaires soient tous des produits commerciaux qui déterminent principalement la sélectivité des biocapteurs, les MGFET et son système de détection ont également contribué à la haute sensibilité de la détection d'ADN.

Relation entre l'impédance des MGFET et la concentration d'ADN complètement incompatible. La barre d'erreur représente l'écart type de 5 analyses indépendantes

Conclusions

Ici, un biocapteur MGFET basé sur du graphène et des nanoparticules magnétiques a été présenté pour détecter l'ADNc. Dans les MGFET, des nanoparticules magnétiques ont été modifiées à l'extrémité de la séquence d'ADNc. Grâce à la force magnétique entre les MB et le champ magnétique, la distance entre les conjugués MB/ADNc et le film de graphène a été contrôlée mécaniquement, modulant ainsi la double couche conductrice des MGFET. En outre, nous pouvons également conclure que, pour un brin d'ADN particulier, l'impédance des MGFET reflétera le stress du brin d'ADN, qui à son tour reflète la flexion du brin d'ADN (encadré, Fig. 5b). Ainsi, les MGFET actuels ont le potentiel d'être utilisés dans l'étude des paramètres mécaniques des chaînes d'ADN. Par conséquent, les MGFET peuvent non seulement fonctionner comme un biocapteur pour la détection d'ADNc, mais peuvent également potentiellement détecter les paramètres mécaniques des chaînes d'ADN.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans l'article.

Abréviations

ADNc :

ADN simple brin complémentaire marqué magnétiquement

CVD :

Dépôt chimique en phase vapeur

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

FET :

Transistor à effet de champ

GFET :

Transistor à effet de champ au graphène

Mo :

Nanobilles magnétiques

MGFET :

Transistor magnétique à effet de champ au graphène

NHS :

N-Hydroxysuccinimide

PBASE :

Ester succinimidylique de l'acide 1-pyrènebutanoïque

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate de dodécyl sulfate de sodium

FDS :

Dodécylbenzènesulfonate de sodium

SIA :

Exemple d'algorithme d'intégration

TEM :

Microscopie électronique à transmission

ITO :

Oxyde d'indium-étain