Stent gastro-intestinal à élution de piperlongumine utilisant des tapis de nanofibres sensibles aux espèces d'oxygène réactif pour l'inhibition des cellules de cholangiocarcinome

Contexte

Le cholangiocarcinome (ACC), qui est normalement dérivé de la région des voies biliaires, est considéré comme l'un des cancers les plus agressifs [1,2,3]. La raison de la cancérogenèse et de l'augmentation du taux d'incidence est encore incertaine même si son taux d'incidence augmente dans le monde [1]. Étant donné que la plupart des patients atteints de CCA sont fréquemment diagnostiqués à un stade avancé, très peu de cas de patients CCA se prêtent à une résection chirurgicale [2]. Diverses options de traitement telles que la radiothérapie, la chimiothérapie, le déplacement du stent métallique et la thérapie immuno-adjuvante ont été essayées pour traiter les patients atteints d'ACC [3,4,5,6,7,8,9]. Étant donné que les voies biliaires sont bloquées par la croissance tumorale ou l'inflammation, le déplacement du stent est fréquemment utilisé pour empêcher l'occlusion des voies biliaires et pour prolonger la survie du patient parmi les traitements susmentionnés [10, 11]. Cependant, le stent métallique n'a pas de fonction curative, et la prolifération tumorale à l'intérieur du stent induit normalement une obstruction biliaire. Pour résoudre ces problèmes, de nombreux scientifiques ont étudié le stent à élution médicamenteuse (DES) [12,13,14,15]. Par exemple, le groupe Lee a étudié le stent gastro-intestinal (GI) à élution de paclitaxel au cours de la dernière décennie [12,13,14,15]. Bien que le stent à élution de paclitaxel présente peu de différences dans la perméabilité du stent et la capacité de survie du patient par rapport à un stent métallique recouvert, ils ont observé l'acceptabilité du stent à élution de paclitaxel dans une étude de faisabilité et de sécurité porcine [13,14,15]. Kim et al. ont étudié le DES à l'aide de sorafenib, un inhibiteur de tyrosine protéine kinase, contre des cellules HuCC-T1 CCA en utilisant des modèles de xénogreffe de tumeur animale, et le stent à élution de sorafénib a l'efficacité d'inhiber la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe de tumeur animale [16]. Kwak et al. ont rapporté que le stent à élution d'inhibiteur d'histone désacétylase (HDAC) (vorinostat) inhibe efficacement l'expression de HDAC, induit l'histone acétylée (Ac-histone), puis inhibe la croissance tumorale dans le modèle de souris porteuses de cellules CCA [17]. Le DES avec un nouvel agent anticancéreux ou un agent cible moléculaire reste une option intéressante pour prolonger la survie des patients. De plus, des tapis de nanofibres ou des nanomatériaux sensibles aux stimuli ont également été spécifiquement étudiés pour délivrer l'agent anticancéreux [18,19,20]. Nanofibres à base de polymères thermosensibles tels que le poly(di(éthylène glycol) méthyl éther méthacrylate) (PDEGMA) ou poly(N -isopropylacrylamide) poly(NIPAM) copolymères peuvent être applicables dans la libération de médicaments sensibles à la température dans le site local de la maladie [18, 19]. Bellat et al. ont rapporté que les nanofibres peptidiques auto-assemblées présentaient un excellent ciblage des tumeurs avec une capture RES réduite [20].

Le déséquilibre entre la production de ROS et le système de défense antioxydant cellulaire dans la maladie a été largement étudié dans le domaine biomédical [21,22,23,24]. En particulier, le stress oxydatif dans les cancers a également été largement étudié et appliqué dans un système d'administration de médicaments sensible à l'oxydoréduction [23,24,25]. Par exemple, les groupes thioéther dans le squelette polymère des nanoparticules peuvent être modifiés d'hydrophobe à hydrophile, lorsqu'il a été exposé aux ROS, et les nanoparticules commutables par ROS peuvent être applicables dans les maladies avec un environnement riche en ROS [25, 26]. Yu et al. ont rapporté que la livraison endosomale spécifique dans les cellules cancéreuses peut être réalisée par des micelles polymères sensibles aux ROS, c'est-à-dire que le copolymère peut être converti d'hydrophobe à hydrophile dans un environnement riche en ROS, et ce phénomène a induit une libération rapide de médicament anticancéreux après une activité anticancéreuse plus élevée [27] . Nous avons également signalé précédemment que les nanophotosensibilisateurs sensibles à l'oxydoréduction libèrent spécifiquement un photosensibilisateur avec une sensibilité au glutathion (GSH), puis induisent une génération de ROS plus élevée que le photosensibilisateur lui-même [28]. Dans des études récentes, les micelles polymères ayant une liaison diséléniure sont connues pour avoir une libération de médicament déclenchée par ROS via la désintégration des liaisons disélénium et pour montrer une activité anticancéreuse spécifique à ROS [29]. Les nanoparticules déclenchées par ROS sont considérées comme une plate-forme prometteuse pour la chimiothérapie anticancéreuse.

Piperlongumine (PL), un produit chimique naturel provenant de Piper longum , a des activités anticancéreuses prometteuses avec une faible cytotoxicité contre les cellules normales [30]. Raj et al. ont rapporté que la toxicité sélective des cellules cancéreuses de la PL est due au fait que la PL produit sélectivement des ROS dans les cellules cancéreuses par rapport à la cellule normale ; La PL induit des dommages à l'ADN et des altérations de la morphologie/fonction des mitochondries dans les cellules cancéreuses [30]. L'activité anticancéreuse de la PL contre diverses cellules cancéreuses a été étudiée [31,32,33,34,35]. Xiong et al. ont rapporté que la PL augmentait considérablement les ROS puis inhibait efficacement les cellules de leucémie myéloïde primaire par induction de protéines apoptotiques [35]. Même si la PL a une faible toxicité contre les cellules et les organes normaux, elle a des effets indésirables sur les reins [36, 37]. De plus, la courte demi-vie de la PL dans le sang doit également être améliorée [38].

Dans cette étude, nous avons fabriqué un stent revêtu de nanofibres réactif redox et PL a été chargé dans les tapis de nanofibres. Pour la réactivité redox, le copolymère séquencé LEse ayant une liaison diséléniure a été synthétisé et utilisé pour fabriquer des tapis de nanofibres pour le DES. L'augmentation du contenu en ROS dans la région tumorale peut accélérer le taux de libération du médicament et favoriser la mort des cellules cancéreuses induite par les ROS.

Matériaux et méthodes

Matériaux

PL a été acheté auprès de LKT Labs. Co., (Minnesota, États-Unis). Le poly(L-lactide) (PLA, PLA-0005, M.W.  = 5000  g/mol d'après les données du fabricant) a été acheté auprès de Wako Pure Chem. Co. Ltd. (Osaka, Japon). Le méthoxy poly(éthylène lycol)-succinimidylglutarate (MePEG-NHS, P.M. =~ 5000 ug/mol) a été acheté auprès de Sunbio Co. Ltd. (Séoul, Corée). Le stent recouvert d'une membrane de silicium pour les voies biliaires a été obtenu auprès de M.I. Technologie. (Pyeongtaek, Corée). Poly(ε-caprolactone) (PCL, MW moyen en nombre = 80 000 g/mol), N-hydroxysuccinimide (NHS), N-(3-diméthylaminopropyl)-N′-éthylcarbodiimide chlorhydrate (EDAC), tétrahydrofurane (THF), chloroforme , le diméthylsulfoxyde (DMSO), le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) et le dichlorhydrate de sélénocystamine ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Chemical Co., (St. Louis, MO , ETATS-UNIS). La membrane de dialyse ou le dispositif de dialyse (taille de coupure M.W. (MWCO) 1000 ug/mol et 8000 ug/mol) a été acheté auprès de Spectrum/Por Lab., Inc. (CA, USA). Tous les solvants organiques et autres produits chimiques ont été utilisés comme qualité extra-pure. Les fournitures de culture cellulaire telles que le milieu RPMI1640 et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été achetées auprès de Life Tech. Inc. (Grand Island, NY, États-Unis). Tous les réactifs et solvants organiques utilisés étaient de qualité HPLC.

Synthèse du copolymère bloc LEse

Conjugués MePEG-sélénocystamine

Le MePEG-NHS (500 mg) a été dissous dans 20 mL de DMSO. Plus de cinq équivalents de sélénocystamine ont été dissous séparément dans 15 mL d'eau déminéralisée et mélangés avec 5 mL de DMSO. Après cela, la solution de sélénocystamine a été lentement versée dans une solution de MePEG-NHS, puis agitée magnétiquement pendant 24 heures. Suite à cela, les réactifs ont été introduits dans un tube de dialyse (MWCO 1000  g/mol) puis dialysés contre beaucoup d'eau pendant 2 jours. La solution dialysée a été lyophilisée pendant 2 jours. Un solide lyophilisé a été utilisé pour synthétiser un copolymère séquencé.

Synthèse de copolymère bloc

Le PLA (500 mg) a été dissous dans 20 mL de DMSO avec une quantité équivalente d'EDAC et de NHS. Cette solution a été agitée magnétiquement pendant 12 h. A cette solution, du mPEG-sélénocystamine solide (530 mg) a été ajouté et encore agité pendant 2 jours. Suite à cela, les réactifs ont été introduits dans un tube de dialyse (MWCO :8000  g/mol) puis dialysés contre beaucoup d'eau pendant 2 jours. La solution dialysée a été lyophilisée pendant 2 jours. Les produits lyophilisés ont été précipités dans du méthanol pour éliminer une fois de plus le mPEG-sélénocystamine n'ayant pas réagi. Le rendement final était supérieur à 94 %. Rendement = [(poids de solide lyophilisé)/(poids de PLA + poids de mPEG-sélénocystamine)] × 100.

Caractérisation des polymères

Pour surveiller la synthèse des polymères, ¹ La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire H (RMN) a été utilisée. Les polymères ont été dissous sous forme de DMSO-d et mesurés avec ¹ Spectroscopie H-RMN (spectromètre FT-NMR supraconducteur 500 MHz, UnityInova 500, Varian Inc. Agilent Tech., CA, USA).

Le poids moléculaire des polymères a été mesuré par chromatographie par perméation de gel (GPC, système Waters GPC, MA 01757, États-Unis) :pompe à solvant Waters 1515 HPLC, un détecteur d'indice de réfraction Waters 2414 et trois colonnes Waters Styragel haute résolution (HR4, HR2, HR1 ). Les polymères ont été dissous dans du THF de qualité extra pure contenant 0,1 N de LiBr comme éluant (débit 1,0 mL/min). Des polystyrènes ont été utilisés pour faire une courbe d'étalonnage.

Tapis en nanofibres chargés PL et enduits sur le stent GI

Tapis en nanofibres chargés PL

Le vorinostat (100 mg) a été dissous dans 10 mL de solution d'acétone. A cette solution, LEse (100 ~ 400 mg) et PCL (600 ~ 900  mg) ont ensuite été ajoutés et agités magnétiquement pendant 2  h. Cette solution a été utilisée pour fabriquer des tapis de nanofibres et pour enrober le stent recouvert d'une membrane de silicone à l'aide d'une machine d'électrofilage (EBS ES-Biocoater; Nano NC, Séoul, Corée du Sud). La machine d'électrofilage est composée d'une alimentation haute tension, d'une pompe à seringue, d'un système robotique X-Y et d'un collecteur de rouleaux de tambour. La solution polymère/médicament dans une seringue (NanoNC, 24G) a été pulvérisée sur le stent métallique recouvert d'une membrane en silicone (diamètre 1 cm, longueur 10 cm, vitesse de roulement 500 rpm, débit de pulvérisation 100 μL/minute, tension 15 kV) qui est placé sur le collecteur roulant. Une membrane en nanofibres chargée de PL a été appliquée sur le stent. Pour éliminer le solvant restant, le stent revêtu de nanofibres chargé de PL a été séché dans une étuve de séchage sous vide pendant 24 h. Les stents revêtus de nanofibres chargées de PL ont été conservés à 4 °C jusqu'à l'étude suivante.

Les tapis de nanofibres chargés de PL ont été soigneusement séparés du stent pour la libération du médicament et l'étude sur les animaux. Une membrane de nanofibres vide a été préparée en l'absence de PL avec une procédure similaire.

Les teneurs en médicament ont été mesurées comme suit :5 mg de tapis de nanofibres incorporés au PL ont été dissous dans du DMSO pendant 2 h. Un spectrophotomètre UV (UV-1601, Shimadzu Co. Ltd. Osaka, Japon) a été utilisé pour mesurer la concentration de médicament à 325  nm. Des tapis de nanofibres vides ont également été dissous dans du DMSO et utilisés pour le test à blanc.

L'étude de libération du médicament a été réalisée avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 0,01 M, pH   7,4) in vitro. Des tapis de nanofibres ont été découpés en disques, et 10 mg de disques ont été immergés dans 40 mL de PBS (0,01 M, pH   7,4) dans un tube conique de 50  mL. Celui-ci a été placé dans un incubateur secouant à 100 tr/min (37 °C). Des milieux entiers ont été prélevés pour mesurer la concentration de PL libérée à partir de tapis de nanofibres à des intervalles de temps spécifiques. La concentration de PL dans le milieu a été mesurée avec un spectrophotomètre UV (325 nm). Des tapis de nanofibres vides ont également été utilisés comme test à blanc. Dans l'étude de libération, du peroxyde d'hydrogène a été ajouté au milieu de libération pour étudier l'effet des ROS sur le taux de libération du médicament.

Morphologie

La morphologie des tapis de nanofibres a été observée avec un microscope électronique à balayage à émission de champ (S-4800 ; Hitachi, Tokyo, Japon) à 25  kV.

Culture cellulaire

Des lignées cellulaires CCA humaines telles que SNU478, SNU245 et SNU 1196 CCA ont été obtenues auprès de la Korean Cell Line Bank (Séoul, Corée). La lignée cellulaire humaine HuCC-T1 CCA a été obtenue auprès de la Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japon). Toutes les cellules ont été cultivées dans du RPMI1640 additionné de 10% de FBS inactivé par la chaleur et de 1% de pénicilline/streptomycine à 37°C dans un 5% de CO₂ incubateur.

Étude sur l'activité anticancéreuse

Diverses cellules CCA (1 × 10 ⁴ ) ensemencées dans des plaques à 96 puits ont été utilisées pour évaluer l'activité anticancéreuse de la PL elle-même, des nattes de nanofibres incorporées à la PL ou de la PL libérée des nattes de nanofibres. Les cellules ont été maintenues pendant la nuit dans un 5% de CO₂ incubateur à 37°C. Pour le traitement par PL, les PL dissous dans du DMSO (10 mg de PL/mL de DMSO) ont été dilués avec du milieu RPMI1640. La concentration finale de DMSO était inférieure à 0,5 %. Pour le traitement du PL libéré des tapis de nanofibres, des tapis de nanofibres incorporés au PL ont été immergés dans 40 mL de PBS dans un tube conique de 50  mL. Au jour 5 et au jour 15, la concentration de PL a été mesurée avec un spectrophotomètre UV comme décrit ci-dessus et utilisée pour traiter les cellules. La nanofibre vide a également été adaptée à l'expérience de libération à des fins de comparaison. Les cellules ont été exposées à la PL elle-même ou à la PL libérée des tapis de nanofibres pendant 2 jours. La viabilité des cellules CCA a été évaluée avec le test de prolifération MTT. Une solution de 30 microlitres de MTT (5 mg/mL de PBS, pH 7,4) a été ajoutée aux puits, puis les cellules ont été incubées pendant 4 h dans un CO₂ à 5 % incubateur à 37°C. Le milieu a été jeté et additionné de 100 µl de DMSO. La viabilité cellulaire a été analysée avec un lecteur de microplaques à 570 nm (lecteur de microplaques Infinite M200 Pro, Tecan, Mannedorf, Suisse). La viabilité cellulaire a été exprimée en moyenne ± écart type de huit puits.

Mesure ROS

La génération de ROS dans les cellules CCA a été dosée par la méthode DCFH-DA. Cellules CCA (1 × 10 ⁴ cellules) ensemencées dans une plaque à 96 puits ont été traitées avec diverses concentrations de PL lui-même ou de PL libérée à partir de tapis de nanofibres dans un milieu RPMI sans rouge de phénol avec du DCFH-DA (concentration finale 20 µM). Six heures ou 12 h plus tard, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et remplacées par 100 pi de milieu RPMI frais sans rouge de phénol. Le contenu des ROS dans les cellules a été analysé par des changements d'intensité de fluorescence à l'aide du lecteur de microplaques Infinite M200 pro (longueur d'onde d'excitation 485  nm, longueur d'onde d'émission 535  nm).

Western Blot

Le Western blot des cellules CCA a été réalisé comme décrit précédemment [31]. Les cellules ont été exposées au PL lui-même ou au PL libéré des tapis de nanofibres pendant 24h. Après cela, les cellules ont été récoltées par trypsinisation, lavées avec du PBS froid et collectées par centrifugation. Les pastilles ont été lysées dans un tampon de lyse contenant 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 1 % de NP-40, 0,5 % d'acide désoxycholique, 0,1 % de dodécyl sulfate de sodium (SDS) avec du fluorure de phénylméthylsulfonyle et un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Roche Diagnostics, Bâle, Suisse ). Cette solution a été centrifugée pendant 30 min à 4 °C (14 000×g ); les lysats cellulaires (surnageant) ont ensuite été utilisés pour mesurer la concentration en protéines à l'aide du kit BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, USA). La protéine (50  μg) a été chargée dans une électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE), transférée sur une membrane de difluorure de polyvinyle (PVDF), bloquée avec du lait écrémé à 5 % dans du TBS-T, sondée avec un anticorps primaire approprié, puis traitée avec un anticorps secondaire conjugué à HRP pendant 1 h. Les immunoblots ont été détectés par chimiluminescence puis quantifiés par des analyses numériques à l'aide du logiciel ImageJ.

Étude in vivo utilisant un modèle de xénogreffe tumorale

Des souris porteuses de HuCC-T1 (souris nude BALB/c, 5 semaines, mâle, poids de 18 à 23  g ; Orient, Seongnam, Corée du Sud) ont été utilisées pour évaluer l'activité antitumorale in vivo du stent en nanofibres incorporé dans le PL. 1 × 10 ⁶ Des cellules HuCC-T1 dans 100 L de PBS ont été administrées par voie sous-cutanée (s.c.) sur le dos de souris nude. Des disques de nanofibres incorporées au PL et de nanofibres vides ont été implantés sous la tumeur solide lorsque la tumeur solide a atteint un diamètre d'environ 4 à 5 µm. La dose de PL était de 10 mg de PL/kg. A titre de comparaison, le PL a été dissous dans une solution de mélange Cremophor EL®/éthanol (0,5% v /v Cremophor EL® et 0,5% v /v éthanol dans du PBS (pH 7,4, 0,01 µM)). Les groupes témoins ont reçu une injection sous-cutanée de PBS à côté du tissu tumoral. Pour les nanofibres incorporées au PL et le groupe de nanofibres vides, les disques de nanofibres ont été préparés comme suit ; des plaquettes de nanofibres de même poids ont été découpées en disques ronds, puis le dos de la peau de la souris a été soigneusement excisé (0,5 cm de longueur). Suite à cela, des plaquettes de nanofibres ont été soigneusement implantées sous le tissu tumoral solide. Pour faire une condition égale, les souris avec un traitement témoin et une injection de PL ont également excisé la peau à côté de la tumeur (0,5 cm de longueur). Chaque groupe était composé de cinq souris. Le volume tumoral a été mesuré à des intervalles de 5 jours et le premier jour d'implantation des nanofibres a été fixé au jour 0. Le volume tumoral a été calculé par l'équation suivante :V = (un × [b ] ² )/2. un :plus grand diamètre; b :plus petit diamètre.

Toutes les études sur les animaux ont été soigneusement réalisées selon les directives du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université nationale de Pusan ​​(PNUIACUC). Le protocole animal utilisé dans cette étude a été strictement examiné par le PNUIACUC sur ses procédures éthiques et ses soins scientifiques, et il a été approuvé (Numéro d'approbation :PNU-2017-1608).

Immunohistochimie

Les tissus tumoraux ont été isolés 30 jours plus tard. Ensuite, les tissus tumoraux ont été fixés dans du formaldéhyde à 4 %, inclus en paraffine et tranchés pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). La coloration immunohistochimique a été réalisée avec des protéines liées à l'apoptose telles que les anticorps caspase-3 et caspase-9. Les anticorps ont été utilisés à une dilution de 1:100 ou 1:200, puis la coloration a été réalisée à l'aide d'un kit Envision (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) selon le protocole du fabricant.

Analyse statistique

Les analyses statistiques des données des cellules traitées et non traitées ont été effectuées à l'aide du t de Student. test. Un p la valeur < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Caractérisation des polymères

Pour fabriquer le stent GI à élution PL, le copolymère séquencé LEse a été synthétisé comme le montre la figure 1. Le MePEG-NHS a été mis à réagir avec de la sélénocystamine, puis le groupe amine terminal a été conjugué avec le groupe terminal carboxyle du PLA. La sélénocystamine n'ayant pas réagi des conjugués MePEG-sélénocystamine a été éliminée par une procédure de dialyse. En outre, les conjugués MePEG-sélénocystamine n'ayant pas réagi du copolymère séquencé synthétisé ont également été éliminés par une procédure de dialyse et une précipitation dans du méthanol. Des pics spécifiques de sélénocystamine ont été confirmés à 1,7 ppm et 2,9 ppm, respectivement, tandis que le pic spécifique de MePEG a également été confirmé à 3,5~3,7 ppm. Lorsque le PLA a été conjugué, le groupe méthyle du PLA a été confirmé à 1,4 ppm. Un mélange d'homopolymère PCL et de copolymère séquencé LEse a été mélangé pour fabriquer des tapis de nanofibres. Le PM et la composition du copolymère séquencé LEse et de l'homopolymère PCL ont été mesurés avec ¹ Spectroscopie H-RMN et GPC. Les résultats de l'estimation du PM ont été présentés dans le tableau 1. Comme indiqué dans le tableau 1, le PM du copolymère séquencé LEse a été estimé sur la base du PM du PEG en utilisant ¹ Spectroscopie H-RMN à 9760 g/mol. La mesure GPC a montré que le copolymère séquencé LEse a 8210 g/mol de Mn, 9530 g/mol de Mw et 1,16, respectivement.

Schéma de synthèse du copolymère à blocs LEse

Caractérisation du stent GI recouvert de nanofibres incorporées à la piperlongumine

Comme le montrent la figure 2 et le tableau 2, divers rapports de copolymère séquencé PCL et LEse ont été utilisés pour fabriquer des nanofibres et pour enrober le stent GI. L'homopolymère PCL a donné des nattes de nanofibres fines et minces avec une forme agrégée minimisée. Lorsque le copolymère séquencé LEse a été ajouté, une partie de la forme agrégée telle que les granules et les particules a été observée, comme le montre la figure 2. À un rapport LEse plus élevé (75/25 et 60/40), les nattes de nanofibres présentaient une forme plus épaisse et irrégulière de fibres structure. Lorsqu'ils étaient constitués de plus de 50 % de ratio de LEse dans leur contenu, les polymères étaient significativement agrégés et les tapis présentaient de graves irrégularités (données non présentées). La structure nanofibreuse a été difficilement obtenue à partir du copolymère séquencé LEse seul. Par conséquent, la structure nanofibreuse peut être obtenue en mélangeant avec un homopolymère PCL. Le contenu des médicaments dans les tapis de nanofibres incorporés dans le PL était presque similaire à la valeur théorique indiquée dans le tableau 2. Ces résultats ont indiqué que les tapis en nanofibres incorporés dans le PL ont été fabriqués avec succès à partir de mélanges d'homopolymère PCL et de copolymère séquencé LEse, puis enduits sur le stent GI.

un Stent GI recouvert de nanofibres incorporées dans le PL. b Photo FE-SEM d'une nanofibre incorporée au PL

La figure 3 montre la cinétique de libération du médicament à partir de tapis de nanofibres. Comme le montre la figure 3a, le PL a été libéré en continu des tapis de nanofibres pendant 25 jours. La libération en rafale de PL des tapis de nanofibres a été observée jusqu'à 4 jours, puis le PL a été libéré en continu des tapis de nanofibres jusqu'au jour 25. Des teneurs plus élevées en copolymère séquencé LEse dans les tapis de nanofibres ont entraîné une libération plus rapide de PL des tapis de nanofibres. Étant donné que le copolymère séquencé LEse est moins hydrophobe que l'homopolymère PCL, les nattes de nanofibres PCL/LEse avec une teneur plus élevée en copolymère séquencé LEse doivent être plus gonflées que celles de l'homopolymère PCL. Ensuite, des tapis de nanofibres avec une teneur plus élevée en copolymère séquencé LEse ont entraîné une libération plus rapide du médicament. De plus, la vitesse de libération de PL peut être accélérée en présence de ROS puisque la liaison diséléniure dans le copolymère séquencé LEse peut être désintégrée par des ROS tels que H₂ O₂ , puis ces facteurs induisent une désintégration réactive redox des tapis de nanofibres (Fig. 3c~e). Les nattes de nanofibres d'homopolymère PCL n'étaient pas significativement sensibles à l'ajout de H₂ O₂ , c'est-à-dire que PCL n'est pas largement affecté par H₂ O₂ une addition; d'autre part, lorsque le copolymère séquencé LEse a été mélangé, la libération de PL des tapis de nanofibres a été considérablement accélérée sous forme de H₂ O₂ était ajouté . En particulier, un rapport de copolymère séquencé LEse plus élevé dans les tapis de nanofibres a induit une cinétique de libération de médicament plus rapide, comme le montrent les figures 3c, d et e. Ces résultats ont indiqué que les tapis de nanofibres incorporés dans le PL ont un potentiel de libération de médicaments réactifs à l'oxydoréduction dans l'environnement biologique. Des nattes de nanofibres incorporées dans du PL préparées avec un copolymère séquencé PCL/LEse (60/40) ont été utilisées après une culture cellulaire in vitro et une étude animale in vivo.

un Libération de PL à partir de nanofibres ayant diverses compositions. Le rapport pondéral PCL/Lese était respectivement de 100/0, 90/10, 75/25 et 60/40. b L'effet du peroxyde d'hydrogène sur la libération de PL des nattes de nanofibres (le rapport pondéral PCL/Lese était de 100/0). c L'effet du peroxyde d'hydrogène sur la libération de PL des nattes de nanofibres (le rapport pondéral PCL/Lese était de 90/10). d L'effet du peroxyde d'hydrogène sur la libération de PL des nattes de nanofibres (le rapport pondéral PCL/Lese était de 75/25). e L'effet du peroxyde d'hydrogène sur la libération de PL des tapis de nanofibres (le rapport pondéral PCL/Lese était de 60/40)

Activité anticancéreuse in vitro

Les propriétés anticancéreuses du stent recouvert de nanofibres incorporées dans le PL ont été évaluées avec diverses cellules CCA. À titre de comparaison, le PL libéré des tapis de nanofibres a été extrait au jour 5 et au jour 15 au cours de l'expérience de libération et a été comparé au PL intact. Comme le montre la figure 4, l'activité anticancéreuse de la PL libérée à partir des jours 5 et 15 n'a pas changé de manière significative par rapport à la PL elle-même dans toutes les cellules HuCC-T1 (Fig. 4a), les cellules SNU1196 (Fig. 4b), les cellules SNU478 ( Fig. 4c) et les cellules SNU245 (Fig. 4d). Ils ont un potentiel d'inhibition presque similaire de la viabilité cellulaire, même si la PL elle-même a entraîné une activité anticancéreuse plus élevée à une concentration supérieure à 10 g/mL. Le tableau 3 montre l'IC₅₀ valeur du PL lui-même et a libéré le PL des nattes de nanofibres. En plus de la PL elle-même, la PL libérée à partir des jours 5 et 15 a maintenu une activité anticancéreuse jusqu'à 15 jours d'expérience de libération du médicament et a montré une IC raisonnable₅₀ valeur à toutes les lignées cellulaires CCA bien que ces valeurs aient été progressivement augmentées au PL à partir du jour 5 et du jour 15 par rapport au PL lui-même. PL libéré à partir du jour 4 et du jour 15 en présence de H₂ O₂ a également maintenu une activité anticancéreuse ainsi que la PL elle-même. Ces résultats ont indiqué que l'activité anticancéreuse de la PL s'est maintenue pendant le processus de fabrication des nanofibres et la période de libération du médicament dans l'environnement biologique. De plus, la PL libérée à partir de tapis de nanofibres a produit une capacité de génération de ROS jusqu'à 15 jours de la période de libération du médicament, similaire à la PL elle-même (Fig. 5). Comme le montrent les figures 5a et b, la PL elle-même a produit des ROS significativement plus à un taux supérieur à 5 g/mL. La PL libérée à partir du jour 5 et du jour 15 a également produit des ROS bien que la production de ROS ait été légèrement diminuée par la PL libérée à partir du jour 15, indiquant que les tapis de nanofibres incorporés dans la PL maintenaient la propriété anticancéreuse intrinsèque de la PL pendant la période de libération du médicament.

L'effet du PL et du PL libéré des tapis de nanofibres sur la viabilité de diverses cellules CCA. un HuCC-T1, b SNU1196, c SNU478, et d Cellules de cholangiocarcinome SNU245. 2 × 10 ⁴ les cellules dans des plaques à 96 puits ont été exposées au PL ou libérées du PL à partir de nanofibres pendant 2 jours. Pour le traitement du PL libéré, des disques de nanofibres incorporés au PL ont été immergés dans du PBS, puis l'expérience de libération a été réalisée pendant 5 et 15 jours avec ou sans 10 mM H₂ O₂ . Le milieu a été échangé jusqu'à 3 jours et de manière similaire à l'étude de libération du médicament. Après cela, le milieu a été récolté entre 5 et 15 jours d'expérience de libération. Cette solution a été utilisée pour étudier la comparaison de l'activité anticancéreuse de la PL elle-même et de la PL libérée

L'effet du PL et du PL libéré des tapis de nanofibres sur la génération de ROS des cellules HuCC-T1 (a ) et les cellules SNU245 (b ). Le PL lui-même et le PL libéré ont été traités comme décrit dans la figure 3

La figure 6 a montré l'expression de la protéine d'apoptose dans les cellules HuCC-T1 CCA. La PL libérée (5 jours) a une activité similaire dans l'induction de l'apoptose des cellules HuCC-T1 par rapport à la PL elle-même, c'est-à-dire que l'expression de BAX, des caspases-3, 7 et 9, et le clivage PARP clivé a été progressivement augmenté par le traitement de a publié le PL (5 jours) ainsi que le PL lui-même. Ces résultats ont également indiqué que la PL libérée a une activité anticancéreuse raisonnable contre les cellules CCA ainsi que la PL elle-même.

Analyse Western blot de l'apoptose des cellules HuCC-T1. Les cellules ont été traitées par la PL elle-même ou libérée de la PL à partir de nanofibres pendant 1 jour, puis ont été analysées par western blot

In Vivo Anticancer Activity Against HuCC-T1 Tumor Xenograft Model

HuCC-T1-bearing nude mice were prepared to assess in vivo anticancer activity of PL-incorporated nanofiber-coated stent as shown in Figs. 7 and 8. As shown in Fig. 7, the volume of HuCC-T1 tumor was gradually increased over 1 month. Growth of tumor volume in the treatment of empty nanofiber was almost similar with control treatment. PL injection properly inhibited tumor growth, compared to control treatment or empty nanofiber treatment. Especially, tumor growth was significantly inhibited by the treatment of PL-incorporated nanofiber, i.e., tumor mass in the treatment of PL-incorporated nanofiber was one third of control treatment. These results indicate that PL-incorporated nanofiber mats have superior potential in inhibition of tumor growth of CCA cells. Furthermore, the expression of caspase-3 and 9 was also increased in tumor tissues as shown in Fig. 8, indicating that released PL from nanofiber mats properly inhibited the growth of the tumor and induced apoptosis of tumor cells. Also, PL-incorporated nanofiber-coated stent has potential to inhibit CCA cells in vitro and in vivo.

The effect of PL solution, empty nanofiber mats or PL-incorporated nanofiber mats on the growth of HuCC-T1 tumor (a ) and the body weight changes (b ). HuCC-T1 (1 × 10 ⁶ cells) cells were implanted to the back of mice. PL dose was adjusted to 10 mg/kg. One hundred microliters of PBS or PL solution was s.c. injected beside the tumor tissue for control treatment and PL solution treatment, respectively. For empty nanofiber and vorinostat nanofiber implantation, wafers of the same weight were cut and then implanted under the tumor tissue. *p < 0,001 ; **p  < 0.01

Immunohistochemical staining (× 400) of HuCC-T1 tumor tissues. Each tumor tissues were stained with BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP-1

Discussion

Abnormal accumulation of ROS in tumor epithelial cells induces carcinogenesis and affects surrounding cells or tissues which constitute tumor microenvironment [39]. Then, abnormal tumor microenvironment is the key player in proliferation, migration, angiogenesis, and metastasis of cancer cells [39,40,41]. An elevated level of ROS in tumor microenvironment induces oxidative stress and causes DNA damage [39]. Also, ROS is also correlated with cholangiocellular proliferation and oncogenic transformation [42]. Paradoxically, increased accumulation of intracellular ROS over toxic level induces apoptosis of cancer cells and tumor suppression [39,40,41,42]. For example, Thanee et al. reported that sulfasalazine as a cystine-glutamate transporter-target drug increased intracellular ROS level and then induced cell death [43]. They also argued that therapeutic efficacy of anticancer drug can be improved by blocking the mechanism of the cell’s ROS defensive system. Also, many research groups investigated ROS-producing small molecules such as melatonin, luteolin, chloroqine, and PL to suppress CCA growth rate by increasing intracellular ROS [44,45,46,47]. Thongsom et al. reported that PL stimulates ROS accumulation in CCA cells and induces cell death by activation of caspase-3 and PARP [47]. We also observed that PL increases the accumulation of intracellular ROS in various CCA cells as shown in Fig. 5. Increased ROS level induced apoptosis signals such as BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP (Fig. 6). The ROS-producing capability of piperlongumine was slightly decreased on day 5 and 15 as shown in Fig. 5. These results might be due to that piperlongumine is unstable in physiological solution, and then ROS-producing capability might have been slightly decreased. Additionally, physicochemical properties of piperlongumine may be affected during the fabrication process of the nanofiber. However, our results showed that ROS-producing capacity of piperlongumine was still maintained during the 15 days of drug release experiment.

Local treatment can be applied for patients with an advanced stage or unresectable stage of CCA [48]. Among various treatment options, DES is a promising candidate for unresectable CCA patients. However, conventional DES for GI tract has no tumor-targetable drug release function, and cytotoxic agent can be eluted in all areas of polymer membrane on the stent. Chemical, physical, or biological stimuli have been applied to induce altered drug delivery in the local region [49,50,51,52]. For example, Wang et al. used a magnitude of applied tensile strain to control drug release rate on the esophageal stent, i.e., increased drug release in a specific region was observed by propagating patterned crack of multilayered coating on the stent [49]. Thin film or nanoporous devices having stimuli-responsiveness such as pH and ionic strength were also investigated for application in DES [50, 51]. Chen and Huang reported that chitosan/poly(vinyl alcohol) hybrid nanofiber membrane was crosslinked with ally disulfide to endow reductant-responsiveness, and then hybrid nanofiber membrane showed favorable biological/material features [52]. We synthesized LEse deblock copolymer and fabricate redox-responsive nanofiber mats for local application in CCA tumors. PCL/LEse-blended nanofiber mats showed increased drug release behavior with responsiveness against H₂ O₂ , indicating that drug release kinetics can be controlled by ROS level in cancer cells or tumor tissues. Furthermore, ROS-dependent drug release from nanofiber mats can be accelerated in tumor since PL is a ROS-producing agent. PL in the tumor may synergistically increase ROS level and then accelerate drug release from nanofiber mats. After all, ROS-dependent release of PL from nanofiber-coated stent synergistically inhibits CCA cells in vitro and in vivo.

Conclusion

We fabricated ROS-sensitive nanofiber mats-coated GI stent using PCL/LEse block copolymer blend. PL was incorporated in nanofiber mats by electrospinning technique. PL release from nanofiber mats was accelerated by addition of H₂ O₂ , indicating that PL-incorporated nanofiber membranes have ROS-responsiveness. PL released from nanofiber mats at 5 days and 15 days showed appropriate anticancer activity even though its anticancer activity was slightly decreased compared to PL itself. As well as PL itself, PL released from nanofiber mats induced ROS generation and apoptosis of CCA cells. Furthermore, PL-incorporated nanofiber mats properly inhibited the growth of HuCC-T1 tumor in mice. We suggest PL-incorporated nanofiber mats prepared by PCL/LEse block copolymer blend as a promising candidate for local treatment of CCA cells.