Dispositif microfluidique fabriqué directement sur des électrodes sérigraphiées pour la détection électrochimique ultrasensible du PSA

Contexte

Le système microfluidique est le processus de manipulation de fluides de petit volume (10 ⁻⁹ à 10 ⁻¹⁸ L) dans des canaux d'une dimension de dizaines à centaines de micromètres [1]. Cette technologie a montré un grand potentiel dans la biomédecine, la surveillance environnementale et l'analyse de la sécurité alimentaire. En particulier, les dispositifs microfluidiques (MFD) présentent généralement les avantages suivants, notamment un faible encombrement, une consommation réduite de réactifs, la détection de plusieurs échantillons en parallèle, une fiabilité et une sensibilité accrues et une intégration à grande et grande échelle [2,3,4].

Les capteurs électrochimiques ont été largement intégrés et coupés avec l'échantillonnage, la manipulation fluidique, la séparation et d'autres scénarios de détection technique [5]. L'application de capteurs électrochimiques pour la détection de biomolécules est prometteuse car les capteurs électrochimiques présentent de nombreux avantages tels qu'une sensibilité et une sélectivité élevées, une reproductibilité fiable, une utilisation simple pour une analyse continue sur site, une préparation d'échantillon minimale, un coût relativement faible et une réponse rapide. Le système électrochimique peut être facilement intégré dans un système microfluidique [6, 7], et cela offre des avantages par rapport à une plate-forme analytique conventionnelle [8,9,10], tels que la facilité de préparation des échantillons, une excellente sensibilité et polyvalence, et l'élimination des volumineux composants optiques [11, 12].

Dans cette étude, une stratégie simple, peu coûteuse et polyvalente a été utilisée pour la fabrication de MFD à détection électrochimique à l'aide d'électrodes sérigraphiées disponibles dans le commerce pour le diagnostic au point de service. Le dispositif développé a été défini comme CASPE-MFD (dispositifs microfluidiques à base d'électrodes sérigraphiés disponibles dans le commerce). Les canaux microfluidiques en polydiméthylsiloxane (PDMS) ont d'abord été modélisés à l'aide d'une photolithographie standard, et les CASPE-MFD ont été fabriqués en liant directement les canaux microfluidiques en PDMS sur une électrode sérigraphiée disponible dans le commerce (Fig. 1). L'électrode sérigraphiée a été directement utilisée et recouverte d'une fine couche de verre en utilisant une approche sol-gel [13]. Par la suite, des canaux microfluidiques PDMS ont été collés sur l'électrode après traitement plasma de leurs surfaces. Les CASPE-MFD sont capables de quantifier la concentration de divers analytes dans les fluides biologiques tels que la solution tampon phosphate (PBS) et les échantillons de sérum. Les CASPE-MFD ont été utilisés pour démontrer la détection et la quantification du biomarqueur de l'antigène spécifique de la prostate (PSA) dans des solutions tampons PBS et des échantillons de sérum humain à l'aide de la chronoampérométrie (CA) et de la voltamétrie à ondes carrées (SWV). La détection du PSA dans cet appareil a montré une sensibilité élevée et la limite de détection (LOD) du PSA est de 0,84  pg/mL (25,8 fM). La LOD est plus de 100 fois plus sensible que la limite clinique de détection de 0,1  ng/mL pour les tests commerciaux [14] et meilleure que les autres dispositifs [3, 15, 16]. Le CASPE-MFD est portable, simple à utiliser et a le potentiel d'intégrer d'autres composants tels que des systèmes de préparation et de séparation d'échantillons.

un Processus de fabrication des canaux microfluidiques PDMS modelés par photolithographie SU-8. b Processus de fabrication du dispositif microfluidique à base d'électrodes sérigraphié disponible dans le commerce. Le CASPE-MFD comprend des canaux microfluidiques PDMS, deux électrodes en or imprimées comme électrodes de travail et contre-électrodes, et une électrode en argent imprimée comme électrode de pseudo-référence. c Un dispositif microfluidique à base d'électrodes sérigraphié disponible dans le commerce

Matériaux et méthodes

Réactifs et matériaux chimiques

L'antigène prostatique spécifique (PSA) et l'anticorps multiclonal anti-PSA, la peroxydase de raifort (HRP) ont été achetés auprès de Petsec Energy Ltd. L'anticorps anti-PSA biotinylé, les billes magnétiques streptavidine, l'albumine de sérum bovin et l'hydroquinone provenaient de Fisher Scientific. Tween-20, peroxyde d'hydrogène (H₂ O₂; 30%) et l'acide ferrocènecarboxylique provenaient de Sigma-Aldrich. SU-8 2075 provenait de MicroChem Corp. Le prépolymère de polydiméthylsiloxane (PDMS) et l'agent de durcissement ont été achetés auprès de Dow Corning. Tous les immunoréactifs ont été dissous dans 1 x solutions tampon PBS pH 7,4 de KD Medical Solutions. Tous les réactifs chimiques ont été préparés avec de l'eau ultrapure provenant d'un système de purification d'eau Millipore Milli-Q.

Instrumentation

Le microscope à fluorescence a été réalisé sur un Olympus U-CMAD3 (Olympus, Japon). Les dispositifs μCSPE ont été fabriqués par un nettoyeur plasma PDC-32G (Harrick Plasma, USA). Toutes les mesures électrochimiques ont été effectuées par CHI 760B (CHI, Chine) avec un système conventionnel à trois électrodes, qui se compose de deux électrodes d'or imprimées comme électrode de travail et de contre-électrode, respectivement, et d'une électrode d'argent imprimée comme électrode de pseudo-référence (Fig. 1 ).

Fabrication de puces microfluidiques

Les canaux microfluidiques PDMS ont été modelés en utilisant la photolithographie standard. Brièvement, une plaquette de silicium, rincée avec une solution mixte (H₂ SO₄ /H₂ O₂ =7/3) suivi par de l'eau ultrapure propre, a été recouvert de résine photosensible SU-8 2075. La plaquette a ensuite été cuite à 65 °C pendant 7 min, puis à 95 °C pendant 40 min pour éliminer les solvants et photo-exposée à la lumière UV pendant 15 s à travers un photomasque. L'ensemble du système a été cuit à 65°C pendant 5 min suivi de 95°C pendant 15 min pour stabiliser la polymérisation. La résine photosensible non polymérisée a été éliminée en trempant la plaquette de silicium dans un révélateur SU-8 et en la lavant avec de l'isopropanol et de l'eau désionisée. Les mélanges de solution de prépolymère PDMS et d'agent de durcissement (10,1) ont été coulés sur la plaquette de silicium pré-décrite, durcis à 65 °C pendant 2 h et décollés [17].

L'électrode imprimée disponible dans le commerce a été recouverte d'une couche de verre en utilisant une approche sol-gel. En bref, le tétra éthoxy silane (TEOS), le MTES, l'éthanol et l'eau ont été complètement mélangés à une proportion de 1:1:1:1 et soniqués pendant 5 min. Les mélanges ont été placés dans un four à 65°C pendant une nuit. L'électrode a été placée sur une plaque chauffante pendant 5 min à 80°C avant revêtement de verre, puis enduite des mélanges précurseurs à l'aide d'une brosse pour éviter que les mélanges n'envahissent la surface de l'électrode. L'électrode a été séchée à température ambiante après l'étalement. La puce PDMS et l'électrode recouverte de verre ont ensuite été traitées avec O₂ plasma pendant 30 s et adhèrent les uns aux autres.

Expériences chronoampérozmétriques

Des expériences chronoampérométriques ont été réalisées dans 1 × pH 7,4 PBS contenant des solutions d'hydroquinone à 4,5 mM et de peroxyde d'hydrogène à 0,1 mM à un potentiel de - 2,0 mV (vs une électrode de pseudo-référence en argent) et ont généré la courbe d'étalonnage pour la concentration de PSA à partir de 0 à 10 ng mL ⁻¹ . Brièvement, nous avons injecté 50 μL de 0,2 mg mL ⁻¹ Anticorps anti-PSA conjugué à des billes magnétiques contre les dispositifs μCSPE à raison de 50 μL min ⁻¹ , et lavé abondamment avec 100 μL de PBS pH 7,4 à raison de 50 μL min ⁻¹ . De plus, 50 μL d'un tampon de blocage (0,05% (v /v ) Tween-20 et 2% (w /v ) de sérum albumine bovine (BSA) en PBS) a été injectée à raison de 10 μL min ⁻¹ et incubé pendant 30 min à 37 °C, lavé abondamment avec 100 μL de PBS pH 7,4 à raison de 50 μL min ⁻¹ . Ensuite, 50 μL de différentes concentrations de PSA ont été injectés à raison de 10 μL min ⁻¹ avec incubation pendant 30 min à 37 °C et lavé abondamment à l'aide de 100 μL pH 7,4 PBS à raison de 50 μL min ⁻¹ . De plus, 50 μL d'anticorps anti-PSA conjugué à la HRP (dilution 1:1000) ont été injectés à raison de 10 μL min ⁻¹ , incubé 30 min à 37 °C, et lavé abondamment avec 100 μL de PBS pH 7,4 à raison de 50 μL min ⁻¹ . Enfin, nous avons injecté 50 μL de solutions PBS 1× pH 7,4 contenant 4,5 mM d'hydroquinone et 0,1 mM de peroxyde d'hydrogène à raison de 50 μL min ⁻¹ . Une fois que le courant de crête est stable, nous avons fait la moyenne des trois mesures de courant et calculé l'écart type correspondant. Enfin, une chronoampérométrie a été mise en œuvre au potentiel constant de 4 mV, en huit répétitions pour chaque groupe. En veillant à ce que le CASPE-MFD soit toujours dans les meilleures conditions pendant l'expérience électrochimique, l'électrode de CASPE-MFD a d'abord été activée en balayant dans la plage de potentiel 0,5 à 1,5 V pendant 10 cycles dans 0,5 MH fraîchement préparé _{2 SO4 solutions par voltamétrie cyclique. Le voltamogramme caractéristique de l'or polycristallin propre a été présenté. Ensuite, le CASPE-MFD a été lavé avec de l'eau ultra pure et des solutions PBS.}

Résultats et discussion

Préparation des CASPE-MFD

Une distribution homogène a été utilisée pour étudier l'utilité du CASPE-MFD. Une solution de microbilles fluorescentes a été injectée dans les canaux d'un CASPE-MFD à un débit de 5 μL/min, et il est évident que chaque coin du CASPE-MFD était rempli de la solution de microbilles fluorescentes et aucune bulle ne s'est formée dans l'appareil (Fig. 2). Le débit a été augmenté à 100 μL/min afin de prouver la robustesse du CASPE-MFD, qui a montré que l'appareil est adapté à la détection d'analytes.

un Photoélectrode sérigraphiée utilisée pour prendre des images de fluorescence. b Image de fluorescence de CASPE-MFD. Nous utilisons une photoélectrode comme image de fluorescence modèle pour démontrer que la zone de travail est pleine de colorants et n'a pas de bulles dans le CASPE-MFD. c Dessin agrandi partiel de l'image de fluorescence

Le processus de fabrication a également été étudié par des voltamogrammes cycliques, comme le montre la figure 3. L'acide ferrocènecarboxylique a été utilisé comme composé modèle redox-actif, et la figure 3a montre la relation entre les courants de pointe redox avec différentes vitesses de balayage potentielles. Le pic redox des courbes CV présente une réaction électrochimique réversible typique dans laquelle la vitesse de réaction est régie par la diffusion des espèces électroactives à la surface de l'électrode. La séparation de potentiel entre le potentiel cathodique de pointe (E _ordinateur ) et le potentiel anodique de crête (E _pa ) est de 62 mV, ce qui est proche de la valeur théorique de 59 mV pour le couple redox ferrocène. De plus, la position des potentiels de crête ne change pas en fonction des taux de balayage des potentiels, et du courant de crête anodique (i _pa ) est approximativement égal au courant de crête cathodique (i _ordinateur ) dans la plage de 10 à 350 mV/s. Le comportement réversible correspond au signal en solution en vrac (Fichier supplémentaire 1 :Fig. S1A), qui indique qu'aucune réaction secondaire n'a lieu et que, comme prévu, la cinétique de transfert d'électrons est suffisamment rapide pour maintenir les concentrations de surface en redox. -espèces actives aux valeurs requises par l'équation de Nernst. La figure 3b montre que le courant de crête anodique (i _pa ) et le courant de crête cathodique (i _ordinateur ) étaient proportionnelles à la racine carrée des taux de balayage, impliquant un processus typique contrôlé par la diffusion [18]. De plus, le courant mesuré dans les CASPE-MFD est assez proche de la valeur du courant en solution en vrac (Fichier supplémentaire 1 :Fig. S1B), ce qui indique qu'une analyse dans l'appareil ne sacrifie pas sa sensibilité.

un Voltammogrammes cycliques d'acide ferrocène carboxylique 0,5 m dans une solution aqueuse de KCl 0,1 M (pH 7,0) dans CASPE-MFD à différentes vitesses de balayage (croissant le long du y -axe) :10, 25, 50, 80, 100, 150, 200, 250, 300 et 350 mV/s. b Tracés d'étalonnage de l'anode (i _pa ) et le courant de crête cathodique (i _ordinateur ) par rapport au taux de balayage carré. Les deux lignes représentent une courbe linéaire avec une équation de régression, respectivement :Y (i _pa ) = 0.9932X − 0.2563 (R ² = 0.9996, n = 8) ; Oui (i _ordinateur ) = − 0.9384X − 0.1774 (R ² = 0.9996, n = 8)

Performance des CASPE-MFD sur la détection PSA

Des rapports récents ont indiqué que la concentration d'antigène prostatique spécifique (PSA) comprise entre 4 et 10 ng/mL indique généralement une forte probabilité de présence d'un carcinome de la prostate [19]. Par conséquent, le PSA a été choisi comme cible pour évaluer les performances du CASPE-MFD préparé (Fig. 4). La figure 4a montre que le CASPE-MFD préparé peut être directement branché sur un poste de travail électrochimique portable. Comme le montre la figure 4c, l'anticorps anti-PSA conjugué à des billes magnétiques a été immobilisé sur la surface de l'électrode en or (électrode de travail) à l'aide d'un aimant. L'antigène PSA a ensuite été injecté dans les canaux microfluidiques du CASPE-MFD préparé et conjugué à l'anticorps anti-PSA qui s'est immobilisé sur l'électrode de travail. Ensuite, l'anticorps anti-PSA modifié par HRP a été conjugué avec l'antigène PSA. La chronoampérométrie a été utilisée pour détecter les signaux électrochimiques produits par l'hydroquinone et le peroxyde d'hydrogène.

un L'ensemble du dispositif de détection. La pompe à seringue a été utilisée pour injecter la solution dans le CASPE-MFD, et le poste de travail électrochimique a été utilisé pour détecter les signaux électrochimiques. b Le CASPE-MFD utilisé pour détecter le PSA. Un anticorps anti-PSA conjugué à des billes immunomagnétiques a été injecté avec des solutions par l'injecteur, et un aimant a été utilisé pour capturer les billes magnétiques. c Schéma du CASPE-MFD dans la détection de l'antigène PSA. Un anticorps anti-PSA conjugué à des billes immunomagnétiques a été immobilisé sur l'électrode de travail à l'aide d'un aimant. L'antigène PSA a été injecté dans le CASPE-MFD et conjugué à l'anticorps anti-PSA. L'anticorps anti-PSA modifié par HRP a ensuite été conjugué avec l'antigène PSA. La chronoampérométrie a été utilisée pour détecter les signaux électrochimiques produits par l'hydroquinone et le peroxyde d'hydrogène

La chronoampérométrie donne un meilleur rapport signal/bruit par rapport aux autres techniques ampérométriques [20,21,22,23,24], et l'utilisation d'une mince plaque de fluides fixée mécaniquement aux électrodes est plus résistante aux vibrations que l'analyse en un plus grand volume de solution. Pour les courants faradiques à diffusion limitée, la réponse en temps courant est décrite par l'équation de Cottrell.

où n est le nombre d'électrons, F est la constante de Faraday (96 485 C/mol), A est la surface de l'électrode (cm ² ), D est le coefficient de diffusion (cm ² /s) et C est la concentration (mol/cm ³ ).

Le CASPE-MFD préparé a été utilisé pour détecter le PSA dans une série de solutions d'analyte, concentration de 0 à 10 ng mL ⁻¹ . Les réponses chronoampérométriques de la détection du PSA dans les CASPE-MFD ont été présentées sur la figure 5a. Les courants de pointe ont augmenté avec l'augmentation de la concentration de PSA dans du PBS à pH 7,4 contenant 4,5 mM d'hydroquinone et 0,1  mM de peroxyde d'hydrogène. Comme le montre la Fig. 5b (ligne bleue), les courants de crête étaient proportionnels à la valeur logarithmique des concentrations de PSA sur la plage de 0,001 à 10  ng/mL et l'équation de régression linéaire est I (μA) = 14,87 + 3,927 × log C _PSA (ng/mL) (R ² = 0.9985, n = 8). La faible limite de détection (0,84  pg/mL) et la bonne relation linéaire suggèrent que le CASPE-MFD préparé pourrait être utilisé pour détecter le PSA dans la pratique. En outre, nous avons également détecté différentes concentrations de PSA dans les CASPE-MFD à l'aide de la voltamétrie à ondes carrées (SWV) sur la figure 5c. Les réponses SWV étaient également cohérentes avec les résultats chronoampérométriques.

un Courbes chronoampérométriques pour différentes concentrations d'antigène PSA (croissant le long du y -axis):0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 et 10 ng/mL dans un tampon PBS pH 7,4 contenant 4,5 mM d'hydroquinone et 0,1 mM H₂ O₂ solution dans CASPE-MFD à − 2.0 mV vs électrode de pseudo-référence d'argent. b La relation linéaire entre le courant de pointe et la concentration en antigène PSA dans les CASPE-MFD dans un tampon PBS pH 7,4 (ligne bleue) et dans le sérum humain (ligne rouge). L'équation de régression linéaire de la ligne bleue est Y = 14,87 + 3,927 × X (R ² = 0.9985, n = 8), et l'équation de régression linéaire de la ligne rouge est Y = 14,15 + 3,622 × X (R ² = 0.9986, n = 8). c Voltammogrammes à onde carrée pour diverses concentrations d'antigène PSA dans un tampon PBS pH 7,4 contenant 4,5 mM d'hydroquinone et 0,1 mM de H₂ O₂ solution dans CASPE-MFD (en ascendant le long du y -axe) : 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 et 10 ng/mL, respectivement. d La relation linéaire correspondante de différentes concentrations d'antigène PSA. L'équation de régression linéaire est Y = 34,53 + 9.246 × X (R ² = 0.9884, n = 8)

Détection sélective de PSA avec les CASPE-MFD

Pour vérifier l'application possible dans notre appareil pour des échantillons réels, nous avons analysé différentes concentrations de PSA dans des échantillons de sérum humain en utilisant la chronoampérométrie. Les résultats obtenus dans le fichier supplémentaire 1 :Fig. S2 ont démontré que les courants de crête du PSA augmentaient également avec l'augmentation de la concentration de PSA dans le sérum humain contenant 4,5 µM d'hydroquinone et 0,1 µM de peroxyde d'hydrogène. De plus, la courbe d'étalonnage correspondante a été montrée sur la Fig. 5b (ligne rouge), et l'équation de régression linéaire est I (μA) = 14,15 + 3,622 × log C _PSA (ng/mL) (R ² = 0.9986, n = 8). Il est évident qu'il n'y avait presque pas de différences statistiques entre les deux groupes, indiquant que le CASPE-MFD préparé était capable de fonctionner dans des échantillons réels. De plus, il a été démontré que le CASPE-MFD a une grande sélectivité pour cibler le PSA et pourrait être utilisé dans une application clinique pour diagnostiquer le carcinome de la prostate.

Conclusions

Nous avons développé une détection électrochimique microfluidique commerciale simple, peu coûteuse et portable à base d'électrodes sérigraphiées. De plus, nous avons démontré l'application de nos CASPE-MFD pour l'analyse quantitative du PSA dans du tampon PBS et dans des échantillons de sérum humain. La mesure a montré une bonne sensibilité et reproductibilité car le dispositif a été directement fabriqué sur les électrodes sérigraphiées du commerce. Les CASPE-MFD présentent cinq avantages :(i) ils sont légers, portables, multi-usages; (ii) il est standardisé; (iii) il a une excellente reproductibilité avec une sensibilité et une précision élevées ; (iv) il est facile à utiliser et ne nécessite pas de personnel médical professionnel ou d'instruments compliqués; et (v) il permet l'intégration de systèmes de détection à haute densité dans un petit appareil. En outre, l'utilisation d'un potentiostat miniaturisé pourrait rendre les CASPE-MFD capables de diagnostic sur le terrain ou à domicile. De plus, les électrodes commerciales et la fabrication facile pourraient permettre la standardisation et l'industrialisation des CASPE-MFD. Par conséquent, nous pensons que cette plate-forme sera largement utilisée pour le diagnostic au point de service tels que les petites molécules (sodium, potassium, chlorure, glucose), les marqueurs du cancer (peptide natriurétique de type B ou BNP, troponine I), les cellules (CD4 ), et les acides nucléiques (ADN, ARN).

Abréviations

MFD :

Appareils microfluidiques

CASPE-MFD :

Dispositifs microfluidiques à base d'électrodes sérigraphiés

PDMS :

Polydiméthylsiloxane

PSA :

Antigène spécifique de la prostate

CA :

Chronoampérométrie

SWV :

Voltamétrie carrée

LOD :

Limite de détection

HRP :

Peroxydase de raifort

TEOS :

Tétra éthoxy silane

MTES :

Spectroscopie d'émission par transfert métastable

BNP :

Peptide natriurétique de type B