Réponse des ostéoblastes aux revêtements microporeux dopés au cuivre sur du titane pour une meilleure intégration osseuse

Introduction

Un matériau d'implant médical en tissu dur doit avoir des propriétés mécaniques appropriées, telles que la résistance, le module d'élasticité, la résistance à l'usure et la résistance à la fatigue, afin que l'implant puisse supporter la charge physiologique de la zone implantée pendant une longue période. Dans le même temps, le matériau doit avoir une bonne biocompatibilité et même une bonne bioactivité afin que l'implant puisse former une bonne combinaison avec le tissu physiologique de la zone d'implantation sans provoquer de réactions indésirables dans le corps humain. Le titane pur et les alliages de titane ont de bonnes propriétés mécaniques et une bonne biocompatibilité et sont actuellement les matériaux d'implants métalliques les plus largement utilisés.

Une fois l'implant implanté, une série de réactions biochimiques se produisent d'abord à la surface du matériau, et les caractéristiques de surface jouent un rôle vital dans la réponse de l'implant à l'environnement interne. La microstructure et la composition chimique de la surface de l'implant peuvent modifier l'adsorption des protéines, et les protéines régulent l'adhésion cellulaire et déterminent finalement leur fonction [1]. Bien que le titane et les alliages de titane soient les matériaux d'implants orthopédiques les plus largement utilisés, le titane n'a aucune activité biologique. Après implantation dans le corps, il ne peut pas former de liaison chimique avec le tissu osseux de la zone d'implantation. Le titane et les alliages de titane reposent principalement sur un verrouillage mécanique pour obtenir la rétention [2] et ne sont pas propices à la fonction physique à long terme du corps.

Le revêtement de surface des implants en titane peut compléter les propriétés mécaniques du titane et pallier ses défauts liés à une faible activité biologique; c'est-à-dire que le titane en tant que substrat peut fournir des propriétés mécaniques, et des éléments avec une bonne structure de surface et une bonne activité biologique sont utilisés comme revêtement. Cette couche fournit une activité biologique, et la recherche dans ce domaine est devenue un point névralgique de la recherche.

À l'heure actuelle, les technologies utilisées pour la préparation de revêtements bioactifs sur des surfaces métalliques comprennent principalement la pulvérisation au plasma, le dépôt assisté par faisceau d'ions, le dépôt électrophorétique, le dépôt physique en phase vapeur par laser pulsé, l'oxydation par microarc, le dépôt par pulvérisation magnétron, le sol-gel, le revêtement laser direct et ablation laser [3,4,5,6,7,8,9,10]. Parmi elles, la technologie de pulvérisation plasma a des applications commerciales; cependant, la technologie de revêtement actuelle ne peut toujours pas répondre aux exigences cliniques, principalement en raison des problèmes suivants :la phase bioactive du revêtement a une faible cristallinité et une faible bioactivité; la force de liaison entre le revêtement et le substrat n'est pas bonne; le matériau interne du revêtement se dissout facilement, ce qui affecte la stabilité à long terme du revêtement dans le corps ; et le processus de préparation du revêtement est trop compliqué, les conditions du processus sont strictes, le coût est élevé et l'efficacité est faible [11].

L'oxydation par micro-arc, une technologie de modification de surface efficace qui est actuellement largement utilisée dans la modification de surface des implants métalliques, utilise l'effet de frittage instantané du plasma haute température et haute pression ; non seulement la surface du matériau génère une surface rugueuse et poreuse, mais des éléments biologiquement actifs peuvent également être introduits dans le revêtement. La surface du matériau modifié par la technologie d'oxydation par micro-arc peut améliorer considérablement la morphologie de surface, la rugosité, l'hydrophobie et l'énergie de surface du matériau de la matrice et d'autres propriétés physiques et chimiques de sorte que l'activité biologique et la biocompatibilité du matériau soient considérablement améliorées. L'ostéointégration entre le matériel importé et le tissu osseux est d'une grande importance [12].

Le cuivre (Cu) est un oligo-élément essentiel dans le corps humain qui a diverses fonctions, notamment la promotion de la croissance des ostéoblastes et la promotion de l'expression du facteur de croissance endothélial vasculaire dans les tissus intimaux, ce qui est bénéfique pour l'adhésion et la prolifération de l'endothélium vasculaire. cellules. Le Cu améliore également la réaction de peroxydation lipidique, inhibe la synthèse d'ADN actif bactérien et d'enzymes apparentées qui interfèrent avec le métabolisme énergétique bactérien et ne conduisent pas facilement à une résistance aux médicaments [13]; plus important encore, les ions cuivre dans une certaine plage de concentration sont reconnus comme ayant à la fois une activité biologique élevée et d'excellentes propriétés antibactériennes. Par conséquent, il a été prouvé que les ions de cuivre ont une bonne biocompatibilité lorsqu'ils sont utilisés dans la conception de biomatériaux [14].

L'interaction entre les cellules et l'implant est un facteur important pour induire la formation d'une interface d'ostéointégration. Cette interaction dépend principalement des propriétés matérielles de la surface de l'implant, telles que la composition chimique de la surface, l'énergie de surface, la charge de surface et la morphologie de la surface. Cette interaction entre les cellules et les implants peut affecter l'adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaires. Il a été prouvé qu'une surface poreuse améliore l'adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaires, et il a également été prouvé que les implants dopés avec des ions inorganiques (zinc, strontium, magnésium, etc.) favorisent l'ostéointégration [15, 16].

Le processus de l'équipement d'oxydation par microarc est simple et les propriétés du revêtement préparé peuvent être ajustées. Des revêtements dopés avec différents ions peuvent être préparés en modifiant la composition de l'électrolyte. Le cuivre joue un rôle important dans l'organisme. La quantité appropriée d'ions cuivre dans le revêtement peut favoriser la prolifération des ostéoblastes et inhiber l'adhésion des bactéries de surface. Par conséquent, dans cette étude, nous avons préparé un Cu–TiO₂ microporeux revêtement sur la surface de titane et utilisé des expériences cellulaires in vitro et des expérimentations animales pour observer et analyser l'effet du Cu–TiO₂ microporeux revêtement sur l'activité de surface et la biocompatibilité du titane. Nous avons également cherché à explorer la faisabilité de Cu–TiO₂ microporeux revêtement en tant que nouveau type de matériau de revêtement d'implant pour améliorer l'adhérence, la prolifération et la différenciation ostéogénique des cellules MC3T3-E1 et favoriser la formation et l'ostéointégration d'un nouvel os à l'interface implant-os pour établir une base théorique et expérimentale pour l'application clinique de Cu–TiO₂ microporeux revêtement sur la surface des implants en titane.

Matériaux et méthodes

Préparation et caractérisation des échantillons

Grâce à la découpe au fil, le titane a été transformé en un échantillon d'un diamètre de 12 mm et d'une épaisseur de 1 mm. Les implants ont été transformés en tiges de titane d'un diamètre de 3 mm et d'une longueur de 8 mm. Le papier de verre a été lissé et lavé avec de l'acétone et de l'eau désionisée pour préparer le revêtement. Dans cette étude, une alimentation électrique d'oxydation microarc à faible puissance maison a été utilisée ; la tension d'oxydation du micro-arc était de 450 V, le mode était à courant constant, le temps d'oxydation du micro-arc était de 5 min et la fréquence était de 1 000 Hz.

Le groupe témoin à blanc a été étiqueté Ti, et l'acétate de calcium et le glycérophosphate de calcium ont été utilisés comme solutions électrolytiques de base. Les échantillons de Ti après oxydation par microarc dans la solution d'électrolyte basique ont été marqués avec TCP, et les échantillons après oxydation par microarc avec différentes teneurs en oxyde de cuivre dans la solution d'électrolyte basique ont été marqués avec TCP Cu I et TCP Cu II (tableau 1).

La microscopie électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM) a été utilisée pour observer la morphologie de surface des échantillons, la spectroscopie à dispersion d'énergie (EDS) a été utilisée pour observer la distribution des éléments sur la surface du revêtement, et le profileur de rugosité de surface a été utilisé pour évaluer la rugosité de différents échantillons. La diffraction des rayons X (XRD) et la spectroscopie photoélectronique des rayons X (XPS) ont été utilisées pour observer la composition élémentaire et la microstructure de la phase de revêtement et de l'état chimique.

Culture cellulaire

Des cellules MC3T3-E1 (extraites de cellules de crâne de souris) ont été utilisées pour des tests cellulaires in vitro. Les cellules ont été incubées en MEM avec 10% de sérum bovin foetal à 37 ℃ dans 5% de CO₂ . Lorsque les cellules ont fusionné et se sont développées à une densité de 80 %, elles ont été digérées et passées avec 0,25 % de trypsine. Le troisième passage a été utilisé pour des expériences cellulaires.

Coloration vivante/morte

La cytotoxicité de chaque groupe a été évaluée par coloration de fluorescence vivant/mort. La densité d'ensemencement cellulaire était de 1,5 × 10 ⁴ cellules/cm ² . Après 3 jours de culture, les échantillons ont été rincés avec du PBS stérile et traités selon le kit de viabilité/cytotoxicité vivant/mort. La cytotoxicité du matériau a été observée par microscopie à fluorescence.

Adhésion et prolifération cellulaires

Les cellules ont été inoculées à la surface de chaque groupe à une densité de 1,5 × 10 ⁴ cellules/cm ² . Après incubation pendant 1 h, 2 h et 6 h, les cellules ont été rincées avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min. Après rinçage avec du PBS, 40 L d'agent de coloration DAPI ont été déposés sur la surface de l'échantillon pendant 10 min pour éviter une coloration légère, et les échantillons ont été observés et imagés avec un microscope confocal laser.

La densité d'ensemencement cellulaire et la méthode de culture étaient les mêmes que ci-dessus, et l'activité de prolifération des cellules a été mesurée avec le kit CCK-8 1, 3 et 10 jours après la culture cellulaire.

Expression de gènes liés à la différenciation ostéogénique

La densité d'inoculation cellulaire et la méthode de culture étaient les mêmes que ci-dessus. Les cellules ont été collectées 1, 3 et 10 jours après l'inoculation, et une PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour détecter les niveaux d'ARNm des gènes liés à la différenciation ostéogénique (y compris BMP , COL-I, ALP et OCN ). Les niveaux d'expression des gènes cibles ont été normalisés à ceux du gène domestique GAPDH . Les jeux d'amorces sont répertoriés dans le tableau 2.

Animaux et chirurgie

Les expérimentations animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux de l'hôpital populaire provincial de Guizhou. Seize lapins adultes, mâles et femelles, pesant 3,6 kg (3,2 à 3,9 kg) ont été achetés au Experimental Animal Center de l'Université de Soochow et ont été divisés en un groupe expérimental et un groupe témoin (8 lapins chacun). Une anesthésie intraveineuse a été réalisée avec du pentobarbital sodique à 3 % (0,1 mL par kilogramme de poids corporel). Après préparation de la peau, la peau a été fixée et systématiquement désinfectée. Une incision longitudinale a été pratiquée dans le condyle fémoral latéral pour exposer le condyle latéral. À l'aide d'une perceuse électrique chirurgicale, un trou d'un diamètre de 2,7 mm et d'une profondeur de 6 mm a été percé sur une surface plane. Deux séries de tiges de titane ont été implantées dans le défaut osseux (la gauche dans le groupe expérimental et la droite dans le groupe témoin), et la pénicilline a été administrée pendant 3 jours consécutifs après l'opération pour prévenir l'infection.

Dosage Micro-CT

Après l'opération, les lapins ont été gardés dans des cages séparées, et ils étaient libres de manger et de boire de l'eau. À 4 semaines et 8 semaines après l'opération, 8 lapins ont été euthanasiés par embolisation à l'air. Les condyles fémoraux des lapins contenant des tiges de titane dans le groupe expérimental et le groupe témoin ont été retirés, la taille de l'échantillon a été rognée, les échantillons ont été fixés au formol et un scanner micro-CT a été utilisé pour la reconstruction tridimensionnelle. La région d'intérêt (ROI) a été définie à l'aide du logiciel Micro-CT, et la fraction du volume osseux de la région d'intérêt (volume osseux/volume total, BV/TV %) a été mesurée.

Évaluation histologique par coloration au bleu de toluidine et à la fuchsine-bleu de méthylène

Les échantillons ont été déshydratés avec un gradient d'alcool (70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 100 %). Les échantillons déshydratés ont été enrobés de méthacrylate de méthyle. Après un enrobage réussi, les échantillons ont été coupés et rognés, fixés sur une trancheuse avec un adhésif pour la coupe, et enfin polis avec du papier de verre jusqu'à une épaisseur de tranche d'environ 20 à 30 μm. (1) Coloration au bleu de toluidine :un colorant bleu de toluidine a été ajouté à la surface de la tranche, et la tranche a été teinte dans un bain-marie. Le colorant de surface a été séché avec du papier filtre, rincé et séché naturellement à l'air. Le film a été scellé et observé au microscope optique. (2) Coloration au bleu de fuchsine-méthylène :la méthode était la même que la coloration au bleu de toluidine. Tout d'abord, une solution de coloration au bleu de méthylène a été ajoutée à la surface des tranches pour la teinture, séchée à l'air et rincée. Ensuite, les tranches ont été trempées dans une solution de coloration de fuchsine pour la teinture, séchées naturellement à l'air, scellées et observées.

Analyse statistique

Les données sont exprimées en tant que moyennes  ± écart type déterminé par le logiciel SPSS 16.0. L'ANOVA à un facteur et le test SNK ont été utilisés pour comparer les différences entre les groupes. P < 0,05 indique une différence significative.

Résultats

La morphologie de la surface, la phase et la composition des éléments chimiques de l'échantillon

La figure 1 montre les morphologies de surface SEM de différents échantillons. Les morphologies du groupe Ti et des autres groupes sont significativement différentes. Le groupe Ti n'a pas de trous sur la surface et la surface est relativement plate, ne laissant que quelques rayures. Le groupe TCP a une morphologie de surface d'oxydation microarc typique, et la surface est recouverte de micropores de différentes tailles. Ces micropores se coupent et ont une "structure tridimensionnelle" approximative. Les pores grands et petits sont imbriqués les uns dans les autres, et les pores n'ont pas de règles fixes. La forme est irrégulière. De plus, il y a des marques de brûlures dans les interstices entre les trous. Semblable à la morphologie de surface du groupe TCP, les surfaces des groupes TCP Cu I et TCP Cu II sont également couvertes de micropores de forme irrégulière, et il n'y a pas de différence évidente de morphologie de surface entre les groupes. Le dopage du cuivre n'affecte pas la structure et la morphologie des micropores.

Morphologies de surface de Ti, TCP, CP Cu I et TCP Cu II

La figure 2 montre la cartographie et le diagramme EDS du Cu–TiO₂ microporeux revêtement Comme le montre le diagramme EDS, le Cu–TiO₂ microporeux le revêtement est composé de Cu, Ti, Ca, P et O. La solution contenant Cu, Ca et P a été entièrement incorporée dans le revêtement. Plus important encore, nous n'avons pas trouvé d'autres éléments toxiques et nocifs. Les résultats de la cartographie du Cu–TiO₂ microporeux revêtement montrent que le cuivre, le calcium et le phosphore sont uniformément répartis dans le revêtement.

Cartographie et diagramme EDS du Cu–TiO₂ revêtement (TCP Cu II)

La figure 3 montre les modèles XRD de Ti, TCP, TCP Cu I et TCP Cu II. Tous les revêtements sont principalement Ti, rutile et anatase. Plus important encore, CuO est apparu dans le Cu–TiO₂ microporeux revêtement, qui indiquait que le cuivre existait sous forme de CuO.

Modèles XRD de Ti, TCP, TCP CuI et TCP CuII

La figure 4 est l'image XPS du Cu-TiO₂ microporeux enrobage. La figure 3a montre le spectre complet du Cu-TiO₂ microporeux revêtement déterminé par spectroscopie photoélectronique aux rayons X, qui est similaire au résultat EDS, sauf pour le titane, l'oxygène, le calcium et le phosphore. En plus des pics caractéristiques du cuivre, il existe également des pics caractéristiques du cuivre. Le pic du Ti2p le spectre correspond à TiO₂ , et le pic de Cu2p à 932,7 eV est considéré comme indicatif de CuO [17, 18].

Image XPS du Cu-TiO₂ microporeux enrobage. un Spectre XPS, b Ti2p , c Cu2p , d Ca2p , e P2p et f O1s spectres

La figure 5 montre la morphologie du profilomètre de différents échantillons. À l'exception des échantillons de Ti, la morphologie de surface du profilomètre de chaque groupe est similaire, ce qui montre une structure de cavité poreuse à plusieurs étages de type volcanique. Une analyse plus poussée de la rugosité Ra de chaque groupe a montré que la rugosité de TCP, TCP CuI et TCP CuII était supérieure à celle de Ti. La rugosité de TCP, TCP CuI et TCP CuII est similaire, et la différence n'est pas significative, ce qui indique que l'oxydation par microarc augmente la rugosité du Ti, mais le dopage au cuivre n'affecte pas la rugosité des échantillons.

Morphologie du profilomètre de différents échantillons

Adhésion et prolifération cellulaires

La figure 6a montre des images adhérentes aux cellules à 1, 2 et 6 h après la coloration au DAPI. Figure 6b le nombre de cellules MC3T3-E1 adhérant aux surfaces de différents échantillons à différents moments. Les nombres de cellules adhérentes dans différents groupes d'échantillons à différents instants sont disposés dans l'ordre suivant :TCP Cu II > TCP Cu I > TCP > Ti. Comparé aux groupes Ti et TCP, le nombre de cellules adhérentes dans les groupes TCP Cu I et TCP Cu II a augmenté de manière significative. Par conséquent, le Cu–TiO₂ microporeux le revêtement peut considérablement favoriser l'adhésion cellulaire.

Adhésion et prolifération des cellules MC3T3-E1 sur les surfaces de différents échantillons. un Images d'adhérence cellulaire à 1, 2 et 6 h après coloration au DAPI, b graphique à barres des cellules adhérentes et c graphique à barres de la prolifération cellulaire (les données sont présentées sous forme de moyenne  ± SD, n = 5. **p < 0,01 par rapport au groupe TCP)

La figure 6c montre la prolifération des cellules MC3T3-E1 à la surface de différents échantillons à différents moments. Semblable à la tendance d'adhésion des cellules ci-dessus, la prolifération cellulaire des groupes TCP Cu I et TCP Cu II était significativement plus élevée que celle des groupes Ti et TCP. La morphologie de surface du Cu–TiO₂ microporeux le revêtement et les ions de cuivre ont favorisé la prolifération cellulaire.

La figure 7 montre les résultats de la coloration EdU. Le rapport des noyaux EdU-positifs suivait cet ordre :TCP CuII > TCP CuI > TCP > Ti. En comparaison avec le groupe Ti, la prolifération des cellules dans le groupe TCP CuII différait significativement.

Coloration EdU mesurée après 3 jours de culture (les données sont présentées sous forme de moyenne  ± SD, n = 5. **p < 0,01 par rapport au groupe TCP)

Coloration vivante/morte

La cytocompatibilité est l'exigence de base des matériaux d'implant. La coloration fluorescente vivante/morte peut évaluer la cytotoxicité et la biocompatibilité des matériaux. La figure 8 montre les résultats de la coloration des cellules vivantes/mortes après que les cellules aient été cultivées à la surface de différents échantillons pendant 3 jours. Il n'y avait que quelques cellules mortes (rouges) à la surface de chaque groupe d'échantillons, indiquant aucune cytotoxicité évidente. Dopage au cuivre dans le Cu–TiO₂ microporeux le revêtement n'augmente évidemment pas la cytotoxicité, et il a une bonne compatibilité cellulaire.

Coloration des cellules vivantes/mortes sur les surfaces de différents échantillons (les données sont présentées sous forme de moyenne  ± SD, n = 5. **p < 0,01 par rapport au groupe TCP)

Expression des gènes de différenciation ostéogénique

La figure 9 montre les niveaux d'expression de l'ARNm des gènes de différenciation ostéogénique (BMP , OCN , ALP et COL-I ) sur les cellules de surface de chaque groupe d'échantillons à différents moments. Au fil du temps, l'expression des gènes de différenciation ostéogénique à la surface de chaque groupe d'échantillons a progressivement augmenté. Dans le même temps, l'expression de chaque groupe de gènes a montré la tendance suivante :TCP Cu II > TCP Cu I > TCP > Ti. Par rapport aux groupes Ti et TCP, l'expression des gènes de différenciation osseuse composés de TCP Cu I et TCP Cu II était significativement améliorée, indiquant que le Cu–TiO₂ microporeux le revêtement peut favoriser la différenciation ostéogénique.

L'expression de l'ARNm de BMP , OCN , ALP et COL-I après 1, 3 et 10 jours d'incubation (les données sont présentées sous forme de moyenne  ± SD, n = 5. *p < 0,05 par rapport au groupe TCP, ***i>p < 0,01 par rapport au groupe TCP)

Observation brute et analyse micro-CT

La figure 10 montre les résultats de l'observation macroscopique et de la reconstruction micro-CT du condyle fémoral. L'observation globale a montré que les implants dans les deux groupes étaient au milieu du condyle fémoral à 4 et 8 semaines avec un bon positionnement, aucune infection évidente et aucun descellement d'implant. La reconstruction tridimensionnelle par micro-CT montre qu'au fil du temps, le nouveau tissu osseux à la surface des deux groupes d'échantillons à 8 semaines était supérieur à celui à 4 semaines, et à différents moments, un nouveau tissu osseux s'est formé à la surface du Cu–TiO₂ microporeux -implant en titane revêtu, et la quantité était supérieure à celle du groupe témoin. En comparant la fraction volumique osseuse des deux groupes, la fraction volumique osseuse (BV/TV) du Cu–TiO₂ microporeux Le titane revêtu était significativement plus élevé que celui du groupe témoin à blanc. Cu–TiO₂ microporeux -le titane revêtu peut favoriser l'ostéointégration des implants en titane.

Une observation macroscopique et une reconstruction micro-CT du condyle fémoral ont été observées à 4 et 8 semaines après l'implantation

Évaluation histologique

La figure 11 montre les résultats de la coloration au bleu de toluidine et à la fuchsine-bleu de méthylène. Aucune enveloppe fibreuse n'a été observée à l'interface os-implant, indiquant que l'implant en titane n'a eu aucune réaction inflammatoire à l'interface avec l'os. Des lacunes blanches peuvent être observées au niveau des lacunes de l'interface implant-os en titane dans les deux groupes. La largeur des espaces blancs dans le groupe témoin était plus grande que celle du Cu-TiO₂ microporeux titane revêtu. Plus l'espace est large, plus l'induction de nouveau tissu osseux par les implants est faible. La coloration au bleu de toluidine montre la bande bleue au niveau de l'espace d'interface implant-os, qui est le nouvel os. Cu–TiO₂ microporeux le titane revêtu avait plus de tissu osseux que le groupe témoin, ce qui indique que le Cu-TiO₂ microporeux le revêtement peut mieux favoriser l'ostéogenèse et a un meilleur effet d'ostéointégration. La matrice osseuse autour du Cu–TiO₂ microporeux le titane revêtu était plus épais et continu, et le tissu osseux était significativement augmenté. En revanche, le groupe témoin avait moins d'os. Ce résultat montre que le Cu–TiO₂ microporeux le titane revêtu peut mieux favoriser l'ostéogenèse et a un meilleur effet d'ostéointégration.

Coloration au bleu de toluidine et au bleu de fuchsine-méthylène de la néoformation osseuse à 4 et 8 semaines après l'implantation

Discussion

Le titane métallique et ses alliages sont largement utilisés en dentisterie, en chirurgie plastique et dans d'autres domaines en raison de leurs excellentes propriétés mécaniques et de leur biocompatibilité ; cependant, le titane en tant qu'implant ne peut se combiner passivement avec le tissu osseux. Cette combinaison est souvent une combinaison mécanique, qui est sujette au descellement et à l'enfoncement de l'implant, conduisant à l'échec de l'implant. À l'heure actuelle, la méthode de modification de la surface de l'implant est principalement utilisée pour améliorer sa capacité d'ostéointégration [19]. La surface de l'implant idéal doit avoir à la fois une ostéoconductivité et une ostéoinductivité, une bonne biocompatibilité et favoriser la formation d'une ostéointégration entre l'implant et le tissu osseux [20]. Dans cette étude, nous avons préparé un Cu-TiO₂ microporeux innovant revêtement à la surface du titane, dans l'espoir d'améliorer l'activité biologique et la biocompatibilité du titane et de surmonter les lacunes des implants en titane dans les applications cliniques actuelles.

L'ion cuivre et le dioxyde de titane se sont avérés avoir une bonne activité biologique [21]. Dans cette étude, le Cu–TiO₂ microporeux Le revêtement préparé par oxydation au microarc sur la surface du titane a montré le plus grand avantage d'une liaison étroite entre le revêtement et le substrat de titane, ce qui a été confirmé dans la littérature [22]. La bonne force de liaison du revêtement d'oxydation microarc est étroitement liée au processus de formation. Dans le processus d'oxydation par microarc, l'oxydation chimique, l'oxydation électrochimique et l'oxydation plasma coexistent. Sous l'action de la haute température et de la haute pression instantanées générées par la décharge d'arc, la surface de titane croît à la surface du substrat de manière «croissance», principalement l'oxyde du substrat. Le revêtement en céramique, le revêtement et le substrat des dents canines sont décalés et ils ont une bonne force de liaison [23].

Les caractéristiques de surface des matériaux biologiques affectent directement les caractéristiques biologiques des matériaux. Le revêtement d'oxydation microarc présente une morphologie de surface rugueuse et poreuse au microscope électronique. La morphologie est principalement composée de micropores de différentes tailles qui s'interpénètrent les uns avec les autres. Ces petits pores sont formés au cours du processus d'oxydation du microarc, la surface métallique est décomposée sous haute tension et le frittage instantané à haute température dans la zone du microarc oxyde et fritte directement la matrice de titane en un film céramique avec une structure de phase céramique cristalline , où se produit une panne électrique. Les micropores observés au microscope électronique se forment. These rough and porous structures can not only increase the attachment area of tissue cells, but these interpenetrating micropores are also equivalent to a three-dimensional scaffold structure, which can induce bone tissue to grow into the pores and promote cell adhesion and extension. Pan et al. [24] prepared micro/nanohierarchical structured TiO₂ coatings on polished titanium by micro-arc oxidation and found that the coatings were favorable for the adhesion and extension of MG63 cells. Zhang et al. [25] prepared a Si–TiO₂ coating by micro-arc oxidation, and further study showed that the adhesion of MC3T3-E1 cells on this silicon-containing TiO₂ coating was significantly higher than that on a Si-free TiO₂ coating and pure Ti.

The greatest advantage of the microarc oxidation coating is that the ions in the electrolyte solution can be introduced into the coating during the microarc oxidation process. In this study, the EDS analysis results of the coating surface showed that the microporous Cu–TiO₂ coating is mainly composed of Cu, Ca, P, O and Ti elements, of which titanium comes from the matrix, calcium and phosphorus come from the basic electrolyte solution, and the copper ions in the electrolyte are deposited in the coating along with the formation of the ceramic film. The calcium and phosphorus components on the surface of the implant can not only improve the surface properties of the material but also induce bone formation. In addition to calcium and phosphorus, the copper ions in the microporous Cu–TiO₂ coating have good biocompatibility and biological activity. Copper-doped coatings on the surface of implants have also been reported in the literature. Astasov-Frauenhoffer et al. [26] deposited copper on Ti via a spark-assisted anodization method and confirmed that the viability of the bacterial cells was strongly inhibited. Zong et al. [27] combined anodization and magnetron sputtering to combine copper into TiO₂ nanotubes and prepare copper (Cu) into TiO₂ NTAs (Cu–Ti–O NTAs), and further study showed that Cu–Ti–O NTAs have excellent long-term antibacterial ability and favorable angiogenic activity.

Biocompatibility is the minimum requirement for measuring implants and is also the basic guarantee for implant safety. In this study, biologically active copper was introduced into the surface of titanium implants through microarc oxidation; however, copper ions, as heavy metal ions, have potential toxicity. Therefore, we must consider whether the microporous Cu–TiO₂ coating is cytotoxic. In this study, live/dead cell staining was used to evaluate the microporous Cu–TiO₂ coating. The results showed no obvious cytotoxicity on the surface of the microporous Cu–TiO₂ coating on the titanium surface, and good cell compatibility was observed. We speculate that this finding may be related to the low copper content of the coating. Huang et al. [28] fabricated gap-bridging chitosan–gelatin nanocomposite coatings incorporated with different amounts of copper (Cu; 0.01, 0.1, 1, and 10 mM for Cu I, II, III, and IV groups, respectively) on Ti and demonstrated that the activities of bone marrow stromal cells were not impaired on Cu-doped coatings except for the Cu IV group.

Cell adhesion and proliferation are the basis of implant osseointegration in the later stage. The more cells that adhere and proliferate on the surface of the implant, the better the effect of implant-bone interface osseointegration. The results of this study showed that on the first day after the material surface was inoculated, the amount of cell adhesion on the surface of the samples of each group differed, and the amount of adhesion on the surface of the microporous Cu–TiO₂ coating group increased significantly. The number of cells that adhered to the sample surface gradually increased, but the number of cells that adhered to the group with microporous Cu–TiO₂ coating was significantly greater than that of the other two groups. The difference was statistically significant, indicating that the microporous Cu–TiO₂ coating was doped with copper ions. A porous, rough surface is most conducive to cell adhesion. Similar to cell adhesion, cell proliferation on the surface of each group of materials also showed similar results. Our research results are similar to previous reports [29].

In addition to adhesion and proliferation, the degree of cell differentiation on the surface of the material can further reflect the performance of the implant's osseointegration. The osteogenic differentiation marker genes ALP , BMP , RUNX2 , OCN and COL-I can reflect cell differentiation. In this study, as time went by, the expression of BMP, OCN, ALP and COL-I on the surface of each group of samples increased, but the expression of the microporous Cu–TiO₂ coating group was significantly higher than that of the control group. This finding is closely related to the promotion of osteogenic differentiation by copper ions. Komarova et al. [30] prepared Zn- and Cu-containing CaP-based coatings by microarc oxidation on Ti and showed that low amounts of Cu and Zn in the coatings promoted high motility of human adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells and subsequent ability to differentiate into osteoblasts.

Osseointegration is the key to the success or failure of the implant. This means that there is no fibrous tissue between the implant and the bone tissue. There is direct contact between the implant and the bone tissue, and it can directly bear stress to realize the relationship between the implant and the bone tissue, establishing a functional connection. The osseointegration between orthopedic implants and bone tissue is affected by many factors, such as the initial stability of the implant and the mechanical properties of the implant material, implant surface properties, biocompatibility, biological activity and the condition of the surrounding bone tissue [31].

An ideal implant position and a stable biomechanical environment are the prerequisite and basis for the osseointegration of the implant-bone interface. In this study, the femoral condyle was chosen to be implanted with a copper-doped microporous coating because the abundant blood supply and sufficient bone volume at the femoral condyle can provide a good anatomical basis and a relatively stable mechanical environment for the implant. Moreover, the femoral condyle is mostly cancellous bone. After implantation, bone formation and the effect of implant-bone interface osseointegration can be more intuitively evaluated.

Micro-CT is currently a common method for observing the osteogenesis performance of implants and is also an effective method for evaluating the osseointegration between implants and bone tissue. Bone microstructure is visualized through three-dimensional reconstruction and the region of interest (ROI) analysis with the assistance of related software to obtain the relevant parameters of new bone tissue. Among all the parameters, BV/TV represents the total amount of bone formation and is an important indicator reflecting the osseointegration of the implant. In this study, we chose BV/TV as the detection index. Four weeks after implantation, the BV/TV of the microporous Cu–TiO₂ coating group was higher than that of the control group. Eight weeks after implantation, the BV/TV values of the microporous Cu–TiO₂ coating group and the control group were higher than those at 4 weeks, and the BV/TV of the microporous Cu–TiO₂ coating group was higher than that of the control group. On the basis of micro-CT detection, we performed histological observation and quantitative analysis of the bone tissue around the implant through hard tissue slices. The results of VG staining showed that the microporous Cu–TiO₂ coating group formed more new bone than the control group, and the new bone that formed around it was in direct contact with the internal implant without fibrous tissue infiltration. These results indicate that microporous Cu–TiO₂ coating on the titanium surface can promote the osseointegration of titanium implants. This finding is similar to previous in vitro studies. The rough, porous structure produced by microarc oxidation mimics the micro/nanostructure of normal bone tissue. More importantly, biologically active copper ions promote bone tissue regeneration. Under the action of these common factors, bone tissue regeneration on the surface of the implant is promoted. Our research results are consistent with literature reports. Milan et al. [32] designed a multifunctional Cu/a-C:H thin coating deposited on Ti–6Al–4 V alloy (TC4) via magnetron sputtering and found that the coating composition can stimulate angiogenesis and osteogenesis and control the host response, thereby increasing the success rate of implants.

Conclusion

In summary, we prepared a microporous Cu–TiO₂ coating on a titanium surface by microarc oxidation. The surface of the coating has a porous structure with pores of different sizes and interconnected pores. The coating increases the surface roughness of Ti and copper is evenly distributed on the surface of the coating. In vitro studies revealed that the coating has no obvious cytotoxicity and can promote the adhesion, proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. In vivo experiments further confirmed that the coating can induce the formation of new bone tissue and promote osseointegration at the titanium implant-bone interface. In view of the biological activity in vivo and in vitro, we believe that the microporous Cu–TiO₂ coating on the surface of titanium implants has potential clinical application value in orthopedics.

Disponibilité des données et des matériaux

Not applicable.

Abréviations

MAO:

micro-arc oxidation

Cu:

copper

Zn:

zinc

Cu–TiO₂ coating:

copper–titanium dioxide coating

ROI:

region of interest

ALP:

alkaline phosphatase