Détection à base de nanoparticules d'or des AGE de faible poids moléculaire à partir d'échantillons in vitro d'hémoglobine glyquée A0

Contexte

Le diabète sucré de type II (DT2) est un trouble métabolique complexe caractérisé par la présence d'une glycémie élevée. L'hyperglycémie persistante dans le corps initie une série de réactions chimiques et biochimiques et la réaction la plus importante qui se produit au cours de l'hyperglycémie est connue sous le nom de réaction de Maillard qui implique une réaction non enzymatique entre les sucres et les protéines pour former une aldimine réversible (base de Schiff) lien. La base de Schiff relativement instable se tautomérise en sa forme céto plus stable, autrement connue sous le nom de « produit Amadori » [1]. Les produits Amadori, également appelés produits intermédiaires de glycation ou produits de glycation précoce, subissent des réarrangements de groupes, des réactions de cyclisation, de déshydratation, de dégradation pour former une gamme de composés chimiques. Ces composés sont connus pour être des agents de réticulation potentiels de protéines et d'agents de glycosylation [2]. Ils sont susceptibles de subir une dégradation supplémentaire conduisant à la formation de produits finaux de glycation avancée (AGE) [3]. À des concentrations endogènes élevées, les AGE contribuent aux complications du diabète [4] soit en induisant des liaisons croisées protéiques, soit via la transduction du signal intracellulaire (RAGE) médiée par les récepteurs, entraînant un stress oxydatif et une inflammation [5, 6]. Elle est également connue pour être associée aux maladies cardiovasculaires [7, 8], aux néphropathies [9, 10], aux rétinopathies [11, 12], au vieillissement [13, 14], à l'arthrite, au cancer [15,16,17], aux maladies neurodégénératives. comme la maladie d'Alzheimer [15] et le développement de la dépression [18]. Outre la réaction de Maillard, plusieurs autres voies, notamment l'oxydation du glucose, la peroxydation lipidique et la voie des polyols, conduisent également à la formation d'AGE [19, 20] in vivo. En plus de cela, l'apport alimentaire de certains aliments connus pour être riches en AGE contribue également aux AGE totaux à l'intérieur du corps [6].

Bien que la plupart des produits AGE aient un élément structurel commun [21], les structures chimiques exactes de centaines d'AGE restent à identifier [22]. Malgré leur hétérogénéité, la formation de liaisons croisées covalentes avec la protéine et « l'effet de brunissement » sont typiques pour tous les AGE connus [23]. Les adduits impliquant le sucre et les protéines qui se forment au stade précoce de la glycation sont appelés adduits de glycation précoce. La fructosyllysine et la fructosamine sont des exemples de telles structures et sont des agents de réticulation potentiels [24,25,26]. Certains des AGE largement étudiés incluent N -carboxyméthyl-lysine (CML), N -carboxyéthyl-lysine (CEL) [27], pentosidine [28], glucosepane [29], pyrraline, Argpyramidine, Crossline et Vesperlysine C [30].

Les études sur le rôle des AGE dans la progression du diabète, du vieillissement et des complications associées sont en augmentation et il a été rapporté qu'elles sont un bon biomarqueur pour les études respectives [https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224][https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224][https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224][ 31,32,33,34]. Cependant, la complexité et l'hétérogénéité de la structure des AGE constituent un obstacle majeur au développement d'un système de détection universel [35]. L'analyse qualitative des AGE est généralement réalisée par des techniques spectroscopiques et colorimétriques [36] dans lesquelles l'évolution des produits de réaction de Maillard est suivie soit en mesurant l'augmentation de l'absorption lumineuse à 280 nm qui correspond aux premiers produits de la réaction de Maillard [37] soit en mesurant l'émission de fluorescence à 450 nm [38,39,40,41,42]. Des études pour l'identification de produits AGE distincts sont toujours en cours; cependant, quelques tentatives ont été faites pour la quantification de la pentosidine [43] et de la carboxyméthyl lysine [44]. La plupart des AGEs ont été étudiés au niveau tissulaire par immunohistochimie et quantification ELISA en utilisant une gamme d'anticorps poly- et monoclonaux [21, 45]. La meilleure technique analytique disponible à ce jour pour la détection des AGE est la chromatographie liquide ou gazeuse suivie d'une détection spectrophotométrique ou spectrométrique de masse [12, 46, 47, 48, 49]. L'analyse quantitative des AGEs est toujours un défi technique majeur et les quelques techniques disponibles pour celles-ci sont coûteuses et limitent ainsi son utilisation dans les applications de point de service. Le développement de nouvelles stratégies pour l'évaluation qualitative et quantitative des AGEs est le besoin de l'heure en raison de leurs implications dans les maladies potentiellement mortelles.

De gros efforts ont été consacrés au développement de capteurs colorimétriques en raison de leur simplicité de détection, de leur temps de réponse rapide et de leur rentabilité, en particulier pour les applications biologiques [50]. Parmi eux, les capteurs basés sur la résonance plasmonique de surface (SPR) présentent un intérêt particulier en raison de leur haute sensibilité de détection [51]. Dans la présente étude, nous avons exploré les propriétés optiques des nanoparticules d'or (PNB) pour l'identification qualitative des produits AGE. Les GNP sont connus pour leur SPR unique et réglable et ont donc évolué en tant que rapporteur colorimétrique pour la détection de diverses biomolécules. Les capteurs optiques basés sur les PNB incluent ceux pour les petits analytes chimiques [52], les sucres [53], différentes protéines [54], les agrégats de protéines [55] et les variantes conformationnelles d'une protéine [56]. Auparavant, nous avons montré que les PNB ensemencés sur une matrice protéique glyquée pouvaient répondre à l'avancement de la glycation [57]. Ici, nous avons étendu ce concept pour la détection qualitative de différents produits de glycation par colorimétrie en utilisant la propriété réductrice présentée par les AGE. En bref, l'HbA0 a été glyquée in vitro, en utilisant du fructose comme sucre réducteur, la formation d'AGE et les changements structurels associés dans le squelette protéique ont été confirmés par spectroscopie. L'Hb glyquée a été fractionnée en utilisant une chromatographie de filtration sur gel pour séparer les produits en fonction de leur poids moléculaire et les PNB ont été synthétisés en utilisant les fractions obtenues. Seuls les produits AGE non protéiniques ont dirigé la synthèse de nanostructures d'or permettant ainsi leur identification.

De plus en plus de preuves soutiennent l'implication de différents produits de glycation dans des maladies telles que le diabète, le vieillissement, la maladie d'Alzheimer, les maladies rénales, l'athérosclérose et différents types de cancers. Nos résultats accentuent l'utilisation des PNB en tant que plate-forme de détection colorimétrique simple et très sensible pour l'identification de différents produits AGE qui pourraient être impliqués dans le pronostic des complications de santé associées au diabète.

Méthodes

Matériaux

L'hémoglobine A0 (HbA0) et le Sephadex (G25) ont été obtenus auprès de Sigma Aldrich India Pvt. Ltd. Hydrogène tétrachloroaurate (III) trihydraté (HAuCl₄ .3H₂ O) a été acheté chez Loba Chemie. Fructose, dihydrogéno-orthophosphate de potassium, hydrogéno-orthophosphate dipotassique, dihydrogéno-orthophosphate de sodium, hydrogéno-orthophosphate disodique, ferricyanure de potassium, acide trichloracétique, chlorure ferrique, acide nitrique (HNO₃ ), acide chlorhydrique (HCl), acrylamide, bis acrylamide, persulfate d'ammonium, TEMED, dodécyl sulfate de sodium, bleu brillant de Coomassie, glycérol, dithiothréitol, base TRIS et autres produits chimiques utilisés étaient de qualité analytique et utilisés sans autre purification. De l'eau ultrapure MilliQ (>18 MΩ) a été utilisée pour toutes les expériences.

Méthodes

Glycation de l'HbA0

Des solutions mères d'HbA0 et de fructose ont été préparées dans un tampon de phosphate de potassium autoclavé (0,1 M, pH 7,4) et filtrées à l'aide de filtres seringues de 0,2 m avant utilisation. Des échantillons d'HbA0 ont été incubés avec différentes concentrations de fructose pendant différentes périodes (1 à 10 jours) dans un incubateur à 37 °C. Les concentrations finales de fructose et d'HbA0 étaient de 0,1 M et 1 mg mL ⁻¹ respectivement. Des contrôles d'HbA0 et de fructose ont également été conservés qui étaient aux mêmes concentrations. Les échantillons qui ont été glyqués pendant 10 jours sont étiquetés avec le préfixe « Day 10 » et les échantillons témoins qui n'ont pas été incubés sont étiquetés avec le préfixe « Day 0 ». Toutes les expériences ont été réalisées dans des conditions stériles dans une hotte à flux d'air laminaire.

Réduction des propriétés d'analyse

Les propriétés réductrices des échantillons glyqués ont été déterminées par la méthode décrite par Gu. et al. [37] avec des modifications mineures. Ensuite, 100 L des échantillons glyqués et leurs contrôles respectifs de protéines et de sucres ont été mélangés avec 1 ml de tampon phosphate de sodium 0,2 M et 1 ml de ferricyanure de potassium à 1 %. Les mélanges ont été incubés à 50 °C dans un bain-marie pendant 20 minutes. Après refroidissement du mélange à température ambiante, 1 ml d'acide trichloracétique à 10 % a été ajouté. A 1 mL de ce mélange, 1 mL d'eau MilliQ et 200 L de chlorure ferrique à 0,1% ont été ajoutés. L'absorbance du mélange résultant a été mesurée à 700 nm. Un contrôle négatif a été conservé dans lequel du tampon phosphate 0,1 M a été ajouté à la place de l'échantillon glycosylé et cela a servi de blanc pour les mesures d'absorbance. Plus l'absorbance à 700 nm est élevée, plus sa propriété réductrice est élevée.

Chromatographie par filtration sur gel de Fruc-Hb Jour 0 et Fruc-Hb Jour 10 utilisant Sephadex (G25)

Brièvement, des billes de Sephadex (G25) ont été trempées dans de l'eau MilliQ pendant une nuit, puis emballées dans une colonne de verre de 15 cm de longueur, 1 cm de diamètre et 15 ml de volume interne. Au début, la colonne a été lavée avec une quantité abondante d'eau MilliQ suivie d'un tampon phosphate de potassium (0,1 M, pH 7,4). Environ 600 L de l'échantillon de Fruc-Hb ont été chargés dans la colonne après l'avoir équilibrée avec du tampon phosphate. L'élution a été réalisée avec le même tampon à un débit de 7,5 mL par heure. Des fractions ont été recueillies une fois que l'échantillon chargé a traversé une distance d'environ 10 cm de la colonne. Environ 30 fractions ont été recueillies dans chacun des échantillons et ont été caractérisées par la suite. Ici, la Fruc-Hb du jour 0 et les fractions qui en sont dérivées ont servi de contrôle par rapport à l'échantillon de Fruc-Hb du jour 10 et leurs fractions respectives.

Synthèse de nanoparticules d'or

Toutes les verreries utilisées pour la synthèse du PNB ont été lavées à l'Aqua Regia (HCl:HNO₃ dans un rapport 3:1 en volume) et rincé à l'éthanol et à l'eau ultrapure avant utilisation (Attention ! Aqua Regia est un agent oxydant très corrosif qui doit être manipulé avec beaucoup de précautions ). La synthèse de PNB a été réalisée en exploitant la propriété réductrice des produits de glycation de l'Hb. Dans une expérience typique réalisée à température ambiante (RT), 32 L de solution aqueuse de HAuCl₄ (1% w /v ) a été ajouté à 3,868 mL d'eau MilliQ sous agitation constante. Après dissolution complète du sel d'or, la solution devient jaune pâle. Ensuite, 50 L de l'échantillon de Fruc-Hb requis ou 100 L de la fraction ont été ajoutés à la solution de sel d'or. Une fois que tous les réactifs ont été soigneusement mélangés, l'agitation a été arrêtée et le mélange réactionnel a été laissé au repos pour permettre la croissance des GNP. Dans le mélange réactionnel final, la concentration de l'échantillon de Fruc-Hb était de 12,5 ng μL ⁻¹ (12,5 μg mL ⁻¹ ) et celle de la fraction était de 1 ng μL ⁻¹ (1 μg mL ⁻¹ ) (Les calculs détaillés sont donnés en S6). Des couleurs allant du rose au violet se sont développées dans les mélanges réactionnels en fonction de l'échantillon ajouté. Tous les échantillons ont été conservés jusqu'à ce que la couleur du mélange réactionnel se soit stabilisée et qu'aucun autre changement n'ait été observé.

Bradford Assay

Les fractions recueillies à partir d'échantillons de Fruc-Hb ont été analysées pour la présence ou l'absence de protéine en utilisant le test de Bradford. Brièvement, à chacun des 20 L de fractions non diluées, environ 200 L de réactif de Bradford ont été ajoutés, et l'absorbance a été mesurée à 595 nm et 450 nm [58]. Le rapport de DO à 595 nm à 450 nm a été tracé en fonction du nombre de fractions et un rapport plus élevé indiquait un pourcentage relativement plus élevé de la protéine.

Spectroscopie

Spectroscopie UV-Visible

Les spectres UV-Visible de tous les échantillons de Fruc-Hb, leurs contrôles respectifs et les fractions chromatographiques des échantillons glyqués ont été enregistrés dans un spectromètre Perkin Elmer, Lambda 25 UV-Visible. Les spectres ont été pris en exécutant un balayage de 800 à 200 nm avec une vitesse de balayage de 240 nm/min et une largeur de fente de 1 nm. Toutes les mesures ont été prises à l'aide de cuvettes de quartz de 1 cm de longueur de trajet et de 1 ml. Les spectres UV-Visible des PNB ont également été enregistrés de manière similaire.

Spectroscopie de fluorescence

Pour identifier les altérations structurelles des protéines et la formation d'AGE, les profils d'émission de fluorescence des échantillons de Fruc-Hb et les fractions du jour 0 Fruc-Hb et du jour 10 Fruc-Hb ont été réalisés à l'aide du spectrophotomètre à fluorescence Agilent Technologies Cary Eclipse. Les largeurs des fentes d'excitation et d'émission ont été fixées à 5 nm et les spectres ont été pris en utilisant une cuvette en quartz d'une longueur de trajet de 1 cm. Les échantillons ont été excités à 280 nm et 350 nm pour vérifier respectivement la fluorescence du tryptophane/la fluorescence de la protéine intrinsèque et la fluorescence de l'AGE [34,35,36,37,38].

Spectroscopie de dichroïsme circulaire

Les altérations de la structure secondaire dans les échantillons de Fruc-Hb ont été identifiées par spectroscopie de dichroïsme circulaire. Les mesures ont été effectuées à l'aide d'un spectromètre à dichroïsme circulaire (CD) avec Stop Flow, Applied PhotoPhysics Chirascan (Applied Photophysics Limited, Royaume-Uni). Les spectres ont été pris dans l'UV lointain, allant de 190 à 260 nm.

Pour toutes les mesures de spectroscopie, des échantillons de Fruc-Hb de 0,1 mg mL ⁻¹ ont été utilisées et les fractions du jour 0 Fruc-Hb et du jour 10 Fruc-Hb ont été analysées sans aucune dilution. Un tampon phosphate de potassium (pH 7,4, 10 mM) a servi de blanc dans toutes les expériences. Toutes les lectures ont été prises en triple à température ambiante.

Microscopie électronique à transmission

Pour identifier la taille et la structure des PNB synthétisés à partir des échantillons de Fruc-Hb et de leurs contrôles respectifs, une analyse par microscopie électronique a été réalisée à l'aide d'un microscope électronique à transmission (MET)–JEOL 2100F. Les PNB ont été concentrés par centrifugation à 6000 tr/min et ont été coulés par goutte sur des grilles de carbone recouvertes de cuivre d'une taille de maille 300. Les échantillons ont été laissés à sécher pendant une nuit à température ambiante avant l'analyse.

Profil d'intensité de couleur des PNB

Afin d'exprimer la couleur des PNB en valeurs mesurables, (RB)/G ((intensité rouge-intensité bleue)/intensité verte) a été calculé en extrayant les plans de couleur rouge, bleu et vert de chacun des colloïdes d'or à l'aide d'une couleur numérique mètre.

SDS électrophorèse sur gel de polyacrylamide

Une électrophorèse sur gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide (SDS PAGE) a été réalisée afin de voir les différences de poids moléculaire de l'HbA0, post glycation. Les contrôles HbA0 du jour 0, du jour 10 et du Fruc-Hb du jour 0 et du jour 10 ont été mélangés avec du SDS à 10 % contenant du tampon de charge 6X et bouillis pendant 5 min, après quoi 30 L des échantillons ont été chargés sur le gel coulé (Stacking gel- 5% Gel résolvant − 12%). Les échantillons ont été analysés avec l'échelle protéique pré-colorée PiNK Plus 10-175 kDa (Cat No. PM005 0500) à 100 V en utilisant le système Mini PROTEAN Tetrad de Bio-Rad. Les gels ont été visualisés sous la source de lumière blanche d'un illuminateur Bio-Rad Trans.

Résultats

Synthèse du PNB à partir de Fructose, d'Hémoglobine A0 et d'Hémoglobine Glycosylée A0

Il est connu que le sucre réducteur glucose réagit avec l'HbA0 in vivo pour produire de l'HbA1c, l'adduit de glycation précoce bien connu qui est un biomarqueur majeur des taux hyperglycémiques associés au diabète [59]. Pour obtenir une cinétique de glycation plus rapide et une accumulation élevée d'AGE in vitro, le fructose est utilisé à la place du glucose qui est un agent de glycation puissant par rapport à ce dernier [55,56,57,58,59,60]. Dans notre étude, nous avons effectué la glycation de l'hémoglobine A0 en utilisant du fructose comme sucre réducteur et la glycation a été surveillée jusqu'à 10 jours, ce qui est considéré comme suffisamment bon pour une formation substantielle d'AGE [57]. La figure 1 illustre la formation d'AGE dans les échantillons d'HbA0 après 10 jours d'incubation avec du fructose in vitro. La formation d'AGE a été évaluée en mesurant qualitativement l'émission de fluorescence à 450 nm lors d'une excitation à 350 nm [38,39,40,41,42]. Une augmentation de plus de dix fois de l'émission de fluorescence à 450 nm a confirmé la formation de produits AGE dans l'HbA0 glycosylée (jour 10 Fruc-Hb) par rapport à l'HbA0 non glycosylée (jour 0 Fruc-Hb-Mélange physique d'HbA0 et de fructose sans incubation). La caractérisation biophysique détaillée des échantillons est discutée dans le fichier supplémentaire 1 (S1 &S2).

Formation d'AGE mesurée par génération de fluorescence à 450 nm lorsque l'hémoglobine est incubée avec du fructose pendant 10 jours. Comparaison de l'émission de fluorescence à 450 nm au jour 0 Fruc-Hb et au jour 10 Fruc-Hb

Afin d'utiliser les PNB comme capteur colorimétrique des AGE dérivés de la glycation des protéines, il était indispensable d'étudier la cinétique de formation des PNB à partir des réactifs sucres et protéines. Le fructose et l'hémoglobine A0 dirigent déjà la synthèse de nanostructures d'or [53, 61, 62, 63] lorsqu'ils sont utilisés seuls ou en combinaison avec un agent réducteur puissant. Cependant, pour comprendre la différence de cinétique de formation, nous avons comparé les PNB synthétisés à partir de Fruc-Hb, fructose et HbA0 incubés respectivement 0 et 10 jours en l'absence d'agent réducteur supplémentaire. La propriété réductrice de ces modèles a été mesurée biochimiquement selon le protocole décrit dans la section méthodes. Dans l'ensemble, les échantillons du jour 10 ont montré une propriété réductrice plus élevée que les échantillons du jour 0, et Fruc-Hb présentait la propriété réductrice maximale suivie du fructose et de l'HbA0 dans les deux cas, ce qui pourrait être attribué à la présence d'AGE dans les échantillons de Fruc-Hb ( 2a). Sur ces échantillons, à une concentration typique, seul le jour 10 Fruc-Hb a contribué à la synthèse de PNB stables (Fig. 2b) au bout de 4 jours, alors que le reste des échantillons n'a pu le faire que lorsqu'ils ont été autorisés à le faire. être conservés pendant une période prolongée (généralement plus de 10 jours) et les résultats sont conformes aux propriétés réductrices obtenues des échantillons (données non présentées). Le spectre d'absorption de la lumière visible du jour 10 Fruc-Hb_GNPs a généré un pic autour de 530 nm (Fig. 2c) et les particules ont également été caractérisées par microscopie électronique à transmission (MET), pour étudier la taille et la morphologie (Fig. 2d). La micrographie électronique a montré la présence de particules sphériques d'un diamètre moyen de 21,930 ± 2,4 nm (Fig. 2e). De plus, les particules étaient de nature polycristalline avec des points de réseau correspondant à 111, 200, 220, 311 plans d'un réseau fcc (Fig. 2f). Une analyse cinétique détaillée de la formation de GNP à partir d'échantillons glyqués différentiellement est donnée dans S3.

Caractérisation de la formation d'AGE et de la synthèse de GNP à partir d'échantillons d'HbA0, de fructose et de Fruc-Hb. un Propriétés réductrices de l'HbA0, du fructose, du Fruc-Hb de 0 et 10 jours d'incubation respectivement mesurées par le test de réduction des ions ferriques. b Photographies des PNB synthétisés à partir des échantillons respectifs. c Spectre d'absorption UV-Visible pour le jour10 Fruc-Hb_PNB. d Micrographie électronique à transmission du jour10 Fruc-Hb_GNPs (barre d'échelle :20 nm). e Distribution granulométrique des particules et f SAED pour les particules

Ici, Fruc-Hb agit à la fois comme modèle et comme stabilisateur pour diriger la synthèse de nanostructures d'or de forme sphérique. Étant donné que seul le jour 10 Fruc-Hb permet la synthèse des particules dans un délai déterminé par rapport aux homologues de sucre et de protéines, ce mécanisme peut être utilisé pour différencier un modèle de protéine glyquée et non glyquée.

Le fractionnement de Fruc-Hb résout deux classes distinctes de produits de glycosylation

Il était intéressant de voir si les AGE ou les altérations du squelette protéique sont responsables de la réponse SPR différentielle observée dans les GNP ensemencés au jour 10 de la matrice Fruc-Hb. Pour approfondir nos recherches, nous avons fractionné le jour 10 Fruc-Hb et le jour 0 Fruc-Hb en utilisant la chromatographie par filtration sur gel comme décrit dans la section méthodes. Les fractions dérivées de la Fruc-Hb du jour 0 ont servi de contrôle par rapport aux fractions de la Fruc-Hb du jour 10. La figure 3 résume la caractérisation spectroscopique des fractions. La figure 3a montre les profils d'élution des fractions collectées à partir du jour 0 Fruc-Hb (rouge) et du jour 10 Fruc-Hb (noir). Le profil d'élution caractéristique obtenu pour le fractionnement de Fruc-Hb est cohérent avec les rapports antérieurs [37].

Profil d'élution des fractions Fruc-Hb du jour 0 (rouge) et du jour 10 Fruc-Hb (noire). Profil d'absorbance UV mesuré à 280 nm (a ) et test de Bradford pour la présence de protéines (b ) des fractions du jour 0 Fruc-Hb et du jour 10 Fruc-Hb

La présence de protéine dans les fractions du jour 0 et du jour 10 a été confirmée par l'absorption de la lumière UV à 280 nm par les acides aminés aromatiques présents dans la protéine. Le profil d'élution de la Fruc-Hb au jour 10 mesuré par absorption lumineuse à 280 nm montre la présence de deux populations de produits notées I et II. La population I, constituée de produits de haut poids moléculaire, va de la fraction no. 5 à 12 et fraction no. 15 et plus correspondant aux produits de bas poids moléculaire tombent dans la population II. Une petite plage couvrant 2 à 3 fractions a été observée entre I et II, où aucune absorption UV n'a été observée. D'autre part, une seule population de fractions du jour 0 Fruc-Hb a montré une absorption de la lumière UV (population I), confirmant que l'absorption dans la région II dans les fractions du jour 10 est par les produits générés au jour 10 Fruc-Hb en conséquence de glycation. Il est déjà rapporté que les intermédiaires de la réaction de Maillard absorbent la lumière dans le proche UV [64] ce qui supporte l'observation. L'absorption accrue de la lumière UV à 280 nm par les fractions du jour 10 par rapport aux fractions du jour 0 pourrait être due au déploiement important des protéines à la suite de la glycation, entraînant l'exposition d'acides aminés aromatiques (Fig. 3a).

La glycation altère considérablement les structures secondaires et quaternaires de la protéine comme discuté dans S1. Pour confirmer l'état structurel de la protéine dans les fractions, nous avons effectué une électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS des fractions et avons constaté qu'à la place des bandes monomères et dimères, des bandes fusionnées ont été observées confirmant la réticulation de la protéine dans l'échantillon de Fruc-Hb au jour 10 (Fichier supplémentaire 1 :Figure S4).

En comparant les profils d'élution de la Fruc-Hb du jour 0 et de la Fruc-Hb du jour 10, nous discernons que les fractions entrant dans la population I sont de nature protéique et la deuxième population qui était complètement absente dans les fractions du jour 0 (non glyquées) est constituée de produits de glycation non protéiniques. Ces résultats sont corroborés par l'estimation des protéines par le test de Bradford où la nature protéique des fractions de la population I du jour 0 et du jour 10 Fruc-Hb a été confirmée (Fig. 3b). De manière concise, le fractionnement de la Fruc-Hb du jour 10 par chromatographie par filtration sur gel a donné deux populations différentes de fractions, les deux absorbant la lumière à 280 nm, l'une étant de nature protéique et l'autre non protéinée.

Les produits de glycation protéinique et les produits de glycation non protéinique sont de nature fluorescente

Ayant compris l'élution des produits de glycation de nature protéique et non protéinique, l'émission de fluorescence de ces fractions a été mesurée à 450 nm pour caractériser la présence de produits d'AGE. Semblable au profil d'élution UV, deux populations d'émission de fluorescence sont observées pour les fractions du jour 10, mais aucune des fractions du jour 0 n'a présenté d'émission de fluorescence à 450 nm car aucune formation d'AGE ne s'est produite au jour 0 Fruc-Hb (Fig. 4). L'intensité de la fluorescence variait significativement parmi les fractions du jour 10, indiquant la nature chimique différentielle des produits de glycation. Dans le profil d'élution de fluorescence, les élues initiaux appartenant à la population I étaient constitués de produits de glycation d'intensité de fluorescence élevée. Ceci, associé à l'estimation des protéines représentée sur la figure 3, suggère l'élution de produits de glycation hautement fluorescents qui comprennent des structures protéiques dans ces fractions. La deuxième population présentait une émission de fluorescence de moindre intensité par rapport aux fractions initiales. Ils se sont avérés être de nature non protéinique (Fig. 3b) mais capables d'absorber la lumière UV à 280 nm (Fig. 3a).

Comparaison de la fluorescence de l'AGE dans les fractions Fruc-Hb du jour 0 et Fruc-Hb du jour 10 exprimées en intensité d'émission de fluorescence à 450 nm

Compte tenu de l'absorption UV (Fig. 3) et de l'émission de fluorescence des fractions du jour 10 (Fig. 4), il est évident que le fractionnement différencie deux classes différentes de produits de glycation de l'HbA0. La population de fractions qui est éluée de la colonne G25 initialement est de haut poids moléculaire, de nature protéique et émet une forte fluorescence à 450 nm. La deuxième classe de produits est constituée de structures non protéiniques de faible poids moléculaire, émettant une fluorescence à 450 nm mais d'intensité comparativement plus faible. Étant donné que les deux produits présentent une fluorescence « AGE », les structures protéiques pourraient être les produits AGE liés au squelette protéique qui se forment initialement au cours de la réaction de Maillard et les fractions de la deuxième population pourraient être les produits tardifs de la glycation qui se forment en conséquence de la dégradation des liaisons croisées des protéines AGE.

Le PNB ensemencé sur des fractions d'un échantillon de Fruc-Hb permet une différenciation entre les produits de glycation

Il est évident que la synthèse des GNP peut être utilisée pour différencier une matrice glyquée et non glyquée (Fig. 2). Maintenant, pour déterminer si les PNB peuvent différencier les élues protéiques et non protéiniques du jour 10 Fruc-Hb, nous avons synthétisé les PNB en utilisant les fractions obtenues à partir du jour 10 Fruc-Hb comme décrit dans les méthodes. La couleur des PNB formés a été surveillée jusqu'à ce que tous les échantillons soient devenus stables.

Comme le montre la figure 5, aucune des fractions constituées de structures protéiques (population I) n'a présenté de formation notable de GNP, tandis que les fractions contenant des produits AGE non protéiniques (population II) ont produit des GNP stables présentant une gamme de couleurs en solution colloïdale. La formation de PNB a été caractérisée en utilisant la spectroscopie UV-Visible et les maxima d'absorbance ont été tracés en fonction des nombres de fractions. Les données de spectroscopie sont bien à l'appui du profil de couleur PNB visualisé. Ces données concluent que la différenciation du modèle de protéine glyquée du modèle de protéine non glyquée basée sur le mécanisme de détection basé sur le GNP est médiée par les produits AGE de faible poids moléculaire et le même mécanisme peut être utilisé pour distinguer entre les protéines non protéiniques et de faible poids moléculaire. -des produits de glycation protéinique.

Synthèse du PNB à partir des fractions Fruc-Hb du jour 10. Le profil colorimétrique des PNB synthétisés à partir des fractions du jour 10 et leurs maxima d'absorption tracés en fonction du nombre de fractions

La cinétique de la détection colorimétrique basée sur le PNB peut être améliorée à plus grande échelle en augmentant simplement les concentrations de Fruc-Hb et de sel d'or, réduisant ainsi le temps de réponse. When the concentrations of the Fruc-Hb and gold salt was increased four times than the concentrations used initially in this study, GNP formation was completed within 1 day, substantiating the use of the proposed colorimetric sensor for point-of-care applications (Additional file 1:Figure S5).

The linearity of detection for this colorimetric sensor was also confirmed using different concentrations of the day 10 glycosylated HbA0 (day 10 Fruc-Hb) (Fig. 6). Colour formation was not prominent enough for the lower concentrations of day 10 Fruc-Hb used, and as the concentration was increased from 20 to 40 ng/μL, the colour intensity increased linearly. This confirms that the colour intensity profile extracted from the GNPs obtained from differentially glycated haemoglobin samples can be used for qualitative measurement of AGEs in respective samples.

Linearity of detection. The red colour intensity as quantified by (R-G)/B intensity of GNP colloids plotted against the concentration of day 10 Fruc-Hb used for the synthesis. The concentration was varied from 8 to 40 ng/μL

Discussion

The study presented here provides a detailed mechanism of GNP formation from a glycosylated HbA0 template and also discusses how this technique can be expanded for highly sensitive detection of AGE products in a simple manner. Our primary objective for this work was to establish a colorimetric sensing mechanism based on GNPs for the differentiation of glycated and non-glycated samples. The glycated HbA0 was found to be having high reducing property in comparison to the protein and sugar counterparts, enabling formation of stable and mono dispersed GNPs (Fig. 2). Since, among the control samples tested for GNP synthesis, only day 10 Fruc-Hb showed AGE fluorescence, the reactivity can be attributed to the AGE products than a mere structural alterations of the due to glycation (Figs. 1 and 2). To confirm this norm further, the products of glycation obtained from day 10 Fruc-Hb was fractionated to separate the products according to their molecular weights.

Fractionation of glycated Hb segregated two major population of products, high molecular weight proteinaceous (population I) and low molecular weight non-proteinaceous (population II) glycation products (Figs. 3 and 4). When GNPs were synthesised using these fractions of day 10 Fruc-Hb, it was found that only the products belonging to population II, the non-proteinaceous glycation products, were capable of carrying out the synthesis of particles (Fig. 5). This confirmed that the non-proteinaceous AGE products can initiate GNP synthesis by their own and the formation of GNPs from a Fruc-Hb template can be clearly attributed to the AGEs. Also, this opens up the possibility of using this property for the colorimetric detection of AGE products along with the distinction between proteinaceous and non-proteinaceous glycation products of HbA0.

Generally, CARBONYL groups present in the protein and sugar enable the stable synthesis of gold nanostructures in biological syntheses. Here, the generation of AGE products consisting of dicarbonyl functional groups during glycation might be providing the reducing environment for the proposed GNP synthesis [65]. As a matter of fact, the suggested mechanism can be used for the detection of advanced lipid per-oxidation end products (ALEs) as well, since the latter is also characterised by dicarbonyl functional groups and shares structural similarities with AGEs [66]. In short, GNPs synthesised from fractionated glycosylated Hb samples can clearly distinguish between proteinaceous and non-proteinaceous products. Our GNP-based simple colorimetric sensing of glycation products is highly sensitive and can detect nanogram levels of glycation products (S6) in a concentration-dependent manner (Fig. 6). The detection limit using the proposed sensing mechanism for the fractions is 1 ng/μL. The method developed in here can be scaled down to smaller reaction volumes without affecting the reaction kinetics, thus enabling lower sample requirements (data not shown) as well as enhance the reaction kinetics by increasing the concentrations (S5).

Conclusions

Concisely, in this study, we have demonstrated a colorimetric sensing mechanism for the non-proteinaceous AGE products which is simple and highly sensitive with a detection limit down to nanogram levels. Conditions like type 2 diabetes requires continuous monitoring of sugar levels at regular time intervals. Currently, levels of HbA1c formed as a result of extensive glycation of haemoglobin is used as a diagnostic means for diabetes. Chromatographic [67], electrophoretic and advanced technologies including high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS) [12, 46,47,48,49, 68] are used for HbA1c detection. Early glycation adducts including fructosamines are also indicative of the glycemic control [69] which can be used as a marker for diabetes detection. Monitoring the AGE levels in addition to the HbA1c levels can significantly improve the determination the degree of complexity associated with diabetes, since the advancement of the disease is often associated with AGE formation and is involved in the progression of the disorder as well. Till date, the LC-MS/MS offers the highest selectivity and sensitivity in AGE detection [70]. But when it comes to simple, cost-effective, point-of-care diagnostics, our method can detect few nanograms of the sample compared to other fluorescence emission-based techniques [71, 72]. The method is highly specific for the AGEs, such that sugars and proteins do not develop any colour as such which are the expected interferences in the clinical samples such as blood or serum for the proposed study (Additional file 1 section 7). In this study, we have also segregated the products of glycation to proteinaceous and non-proteinaceous components and proved that non-proteinaceous AGEs are more reactive by the GNP based colorimetric assay. Further research can explore how this idea can be expanded for the distinction between different AGEs and thereby apply it for the diagnosis of organ specific diabetes-related complications.

Abréviations

AGEs:

Advanced glycation end products

Fruc-Hb:

Glycated Hb

GNPs:

Nanoparticules d'or

HbA0:

Haemoglobin A0

SPR :

Résonance plasmonique de surface