Un nouveau nanobiocapteur magnétoélastique pour la détection hautement sensible de l'atrazine

Introduction

Avec le développement rapide de l'industrie et de l'agriculture, de plus en plus de contaminants environnementaux ont été libérés dans l'environnement écologique [1], ce qui a suscité de nombreuses inquiétudes concernant les recherches pertinentes [2, 3]. Ces dernières années, les herbicides ont été utilisés en quantités croissantes pour améliorer la qualité et le rendement dans les champs agricoles, mais de nombreux herbicides peuvent rester actifs dans l'eau et les sols pendant des années, provoquant une grave pollution de l'environnement [4]. La pollution par les herbicides a attiré une attention considérable en raison de sa contamination écologique dans l'eau ou dans les produits agricoles [5]. Parmi les herbicides, l'atrazine (2-chloro-4-éthylamino-6-isopropylamino-1,3,5-triazine) est le plus largement utilisé pour lutter contre les plantes à feuilles larges et les graminées adventices dans le monde [6].

Bien que l'atrazine ait un certain effet inhibiteur sur certaines mauvaises herbes vivaces, en tant que contaminant environnemental, elle est hautement toxique [7] et peut entraîner des risques pour la santé des humains et d'autres espèces animales [8]. Des concentrations élevées à long terme d'atrazine peuvent nuire à la santé animale ou humaine, comme le cancer, des malformations congénitales et des dommages au cœur et au foie [9, 10]. Les États-Unis, l'Union européenne et le Japon ont tous inclus l'atrazine dans la liste des perturbateurs endocriniens [11]. Aux États-Unis, l'Environmental Protection Agency (EPA) autorise la limite admissible de 3 g/L (Lifetime Health Advisory Level) d'atrazine dans l'eau potable [12]. Ainsi, il est nécessaire de quantifier avec précision l'atrazine à de faibles concentrations.

De nombreuses techniques analytiques conventionnelles ont été développées pour la détection de l'atrazine, notamment la LC couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) [13], la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) [14] et la chromatographie en phase gazeuse couplée également à la spectrométrie de masse (GC-MS ) [15], mais ces méthodes ont également certaines limites, telles que le coût élevé, le besoin de gros instruments, une mauvaise sélectivité et une longue durée [16].

En tant que plate-forme sans fil sensible à la masse, le capteur magnétoélastique (ME) fabriqué à partir de matériau ME a été largement développé pour diverses applications en raison de leurs avantages critiques de faible coût, de sensibilité élevée, de plus petite taille et de facilité d'utilisation [17, 18]. Actuellement, les capteurs ME sont généralement constitués de matériaux d'alliages ferromagnétiques amorphes, tels que Metglas 2826 MB (Fe₄₀ Ni₃₈ Lu₄ B₁₈ ) [19]. Sous les champs magnétiques alternatifs et statiques appliqués de l'extérieur, le matériau ME vibre longitudinalement à sa fréquence de résonance [20], générant une densité de flux magnétique qui peut être détectée sans fil par une bobine de captage sans aucune connexion physique directe [21]. Selon l'éq. (1) [22], la fréquence de résonance fondamentale f ₀ dépend de la longueur du matériau L , densité ρ , module d'élasticité E , et le coefficient de Poisson v .

Une petite charge de masse supplémentaire ∆m déposé sur la surface du matériau ME de masse M (∆m ≪ M ) provoque un décalage de la fréquence de résonance (∆f ), qui est donné par l'équation. (2) [23].

Sur la base des propriétés uniques ci-dessus du matériau ME, la fréquence de résonance du matériau ME diminue avec une augmentation de la charge de masse supplémentaire. Ainsi, grâce à leur fonctionnalisation avec un film sensible, les matériaux ME ont été développés pour des analyses physiques, chimiques et biologiques, telles que la détection de stress/pression [24], température/humidité [25], dioxyde de carbone [26], endotoxine [27], Salmonella typhimurium/Bacillus anthracis spores [28] et Escherichia coli O157:H7 [29]. À notre connaissance, cependant, aucune application du matériel ME n'a été appliquée sur la détection d'atrazine.

Dans cette recherche, utilisant ses excellentes propriétés et avantages, nous avons d'abord proposé un nanobiocapteur ME sans fil utilisant le matériau ME comme substrat et des nanoparticules d'or (AuNPs) comme couche de revêtement, pour la détection d'atrazine au niveau ppb sur la base du dosage immunologique compétitif direct. procédures. Par rapport à l'immobilisation d'anticorps aléatoires covalents, la stratégie orientée covalente est plus bénéfique pour améliorer la sensibilité du nanobiocapteur. Parce que la protéine A est une alternative intéressante pour se lier spécifiquement à la région d'immunoglobuline Fc de l'anticorps, elle a été utilisée pour l'immobilisation orientée de l'anticorps atrazine [30], donnant la densité d'immobilisation la plus élevée, pour présenter une meilleure efficacité de liaison à l'antigène et améliorer les performances du nanobiocapteur [31]. Le dosage immunologique compétitif direct pour l'atrazine a été construit par immobilisation orientée d'anticorps d'atrazine contre la protéine A modifiée de manière covalente sur la surface du matériau ME recouvert d'AuNPs, suivie de la réaction compétitive du conjugué atrazine-albumine (Atr-BSA) et de l'atrazine avec l'anticorps d'atrazine. Atr-BSA a été induite pour amplifier les réponses de signal, augmentant à son tour de manière significative la sensibilité du nanobiocapteur. L'efficacité du nanobiocapteur ME a été évaluée, démontrant qu'un nouveau nanobiocapteur ME pour la détection de traces de concentrations d'atrazine a été développé avec succès.

Matériaux et méthodes

Matériaux

L'anticorps atrazine, l'antigène conjugué atrazine-albumine (Atr-BSA), l'atrazine et la protéine A ont été achetés auprès d'EastCoast Bio (Maine, États-Unis). La simazine, la prométryne et le dichlorodiphényltrichloroéthane (DDT) ont été obtenus auprès de Chengdu Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd. Cystéamine, chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), N -hydroxysulfosuccinimide (NHS), albumine de sérum bovin (BSA, 99 %) et solution saline tamponnée au phosphate (tampon PBS, pH =7,4) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Corporation (Saint Louis, MO, États-Unis).

Fabrication de nanobiocapteurs ME

Préparation de la plateforme de nanocapteurs ME

Rubans de matériau ME composés d'alliage Metglas 2826 (Fe₄₀ Ni₃₈ Lu₄ B₁₈ ) ont été achetés auprès de Honeywell Corporation (Morristown, NJ, USA) et découpés en 5 mm x 1 mm x 0,028 mm à l'aide d'une machine de découpe laser commandée par ordinateur. Pour éliminer le film organique et les débris, les rubans ME ont été nettoyés par ultrasons dans de l'acétone et de l'éthanol chacun pendant 10 min et rincés dans de l'eau déminéralisée, puis séchés dans un courant d'azote (Fig. 1a). Une couche d'environ 100 nm d'épaisseur de nanoparticules de chrome a été pulvérisée des deux côtés de la surface du ruban ME pour améliorer l'adhérence entre les AuNP et la surface du ruban. Par la suite, les deux côtés de la surface du ruban ME revêtu de chrome ont été pulvérisés avec des AuNP pour améliorer la biocompatibilité et protéger le ruban de l'oxydation et de la corrosion. L'image au microscope électronique à balayage (MEB) de la figure 1 a montré que les AuNPs enduites sur le ruban ME étaient de taille sphérique. AuNPs et -SH peuvent facilement former la liaison Au-S. En plus de leurs avantages attrayants de faible prix, de non-corrosion, de biocompatibilité et de non-toxicité [32], les AuNPs peuvent fournir une excellente interface pour la modification des éléments chimiques ou de bio-reconnaissance [33, 34]. Ensuite, les rubans ME ont été recuits dans une étuve à vide à 200 ° C pendant 2 h pour soulager les contraintes internes résiduelles et favoriser l'adhérence de la couche AuNPs aux rubans ME. Ensuite, les plates-formes de nanocapteurs ME étaient terminées et prêtes pour l'immobilisation des anticorps anti-atrazine (Fig. 1b).

La représentation schématique des procédures de fonctionnalisation des nanobiocapteurs ME :(a ) le ruban ME nu; (b ) le revêtement AuNPs ; (c ) la couche SAM ; (d ) l'immobilisation de la protéine A; (e ) la modification de l'anticorps ; (f ) blocage BSA ; (g ) l'atrazine et l'Atr-BSA combinées de manière compétitive avec l'anticorps ; Image SEM de la surface du nanocapteur recouverte d'AuNPs

Immobilisation d'anticorps d'atrazine

Les plates-formes de nanocapteurs revêtus d'AuNPs ont été nettoyées par ultrasons avec de l'acétone, de l'isopropanol, de l'eau déminéralisée et de l'éthanol chacune pendant 5 min, et séchées sous un courant d'azote. Ensuite, les plateformes de nanocapteurs ont été immergées dans une solution de cystéamine (10 mM) pendant 12 h à température ambiante pour obtenir une monocouche auto-assemblée (SAM) (Fig. 1c). La protéine A (1 mg/mL) a été activée avec 4 mg/mL d'EDC-4 mg/mL NHS pendant 30 min à température ambiante. Après cela, la protéine A activée a été incubée sur les nanocapteurs modifiés par SAM pendant 30 min à 37 ° C et rincée avec du tampon PBS (Fig. 1d). Les plates-formes de nanocapteurs ont ensuite été incubées avec un anticorps d'atrazine pendant 50 min et lavées avec du tampon PBS (Fig. 1e). Pour empêcher l'adsorption non spécifique, les nanocapteurs revêtus d'anticorps d'atrazine ont été traités avec 0,5% de BSA pendant 30 min, puis rincés avec du tampon PBS pour éliminer toute BSA non liée et séchés sous un courant d'azote. Enfin, les nanobiocapteurs ME ont été fabriqués pour la détection de l'atrazine (Fig. 1f).

Mesure du signal

La fréquence de résonance du nanobiocapteur ME a été mesurée à l'aide d'une bobine de captage enroulée autour d'un flacon, ainsi qu'un analyseur de réseau vectoriel (AV3620A, le 41e institut du CETC, Qingdao, Chine), comme représenté schématiquement sur la figure 2. Pour générer une alternance champ magnétique, l'analyseur de réseau connecté à la bobine de captage fonctionnait dans le S₁₁ mode pour fournir un signal de fréquence balayé à la bobine, et il peut surveiller le signal réfléchi par la bobine. De plus, un champ magnétique statique généré par un barreau magnétique a été appliqué pour améliorer le comportement de résonance. Les nanobiocapteurs ont été insérés verticalement et sans fil (sans aucune connexion filaire avec le système de mesure) dans le flacon contenant 30 L de solutions d'échantillon à tester. Toutes les expériences ont été menées à température ambiante (25 ± ± 2 °C) dans un système de solvant PBS (0,1 M, pH 7,4). La fréquence de résonance du nanobiocapteur peut être déterminée par la mesure du S₁₁ paramètre, qui a été surveillé et enregistré toutes les 5 min.

La représentation schématique du système de mesure sans fil du nanobiocapteur ME

Résultats et discussion

Caractérisation de la morphologie de surface du nanobiocapteur

L'observation au microscope à force atomique (AFM, ND-100, Park System, Corée) de la surface du nanobiocapteur a été réalisée pour examiner l'effet d'immobilisation de l'anticorps atrazine. Les images AFM du nanobiocapteur revêtu d'AuNPs et de la surface du nanobiocapteur modifié par des anticorps sont présentées sur les figures 3a, b, respectivement. Il est clair que l'augmentation de la rugosité de surface résulte de l'anticorps atrazine immobilisé de manière covalente. Une analyse complète de la topographie des sections transversales de l'AFM montre que le nanobiocapteur revêtu d'AuNPs a une variation de hauteur de 13,421 nm; cependant, la valeur a augmenté à 28,425 nm après la modification de l'anticorps. Aussi bien connu que le diamètre de l'anticorps moléculaire est d'environ 15 nm, il est évidemment conclu que l'immobilisation de l'anticorps atrazine est réussie.

Images AFM de (a ) le revêtement AuNPs et (b ) surface de nanobiocapteur modifiée par anticorps

Optimisation de la concentration d'anticorps d'atrazine

La concentration d'immobilisation de l'anticorps a une influence importante sur la sensibilité du nanobiocapteur. Par conséquent, il était nécessaire d'évaluer la réponse en fréquence de résonance du nanobiocapteur avec différentes concentrations d'immobilisation d'anticorps atrazine (25 g/mL, 50 g/mL, 75 g/mL, 100 g/mL). A partir de la figure 4, nous pouvons voir que le décalage de fréquence de résonance atteint un maximum à 50 g/mL. Lorsque la concentration d'anticorps d'atrazine a atteint 75 g/mL, la réponse a commencé à décliner en raison de l'encombrement stérique et de la répulsion électrostatique [35]. C'est-à-dire que l'anticorps atrazine à 50 µg/mL peut atteindre une immobilisation relativement saturée. Ainsi, 50 g/mL était la concentration optimale d'anticorps d'atrazine pour l'immobilisation.

Réponse en fréquence du nanobiocapteur ME avec différentes concentrations d'immobilisation d'anticorps d'atrazine (0 g/mL, 25 g/mL, 50 g/mL, 75 g/mL, 100 g/mL)

Optimisation de la concentration d'Atr-BSA

Dans l'immunoréaction, l'atrazine et l'Atr-BSA étaient en compétition pour le nombre limité de sites d'anticorps d'atrazine sur la surface du nanobiocapteur. Par conséquent, avec la concentration optimale d'anticorps d'atrazine pour l'immobilisation, la concentration de travail d'Atr-BSA, en tant que facteur important, affecte la sensibilité du nanobiocapteur. Le processus d'optimisation a été étudié en déterminant la réponse en fréquence de résonance du nanobiocapteur ME à Atr-BSA de différentes concentrations (20 g/mL, 40 g/mL, 60 g/mL, 80 g/mL). Comme indiqué sur la figure 5, la réponse maximale a été observée à 40 g/mL. Ainsi, 40 g/mL d'Atr-BSA ont été utilisés dans la détermination suivante.

Réponse en fréquence du nanobiocapteur ME à l'Atr-BSA de différentes concentrations (20 g/mL, 40 g/mL, 60 g/mL, 80 g/mL)

Détection d'atrazine

La figure 6 illustre la réponse en fréquence en temps réel du nanobiocapteur ME mesurée dans le mélange d'échantillons de 15 L d'Atr-BSA (40 g/mL) et de 15 L d'atrazine avec différentes concentrations (0 ng/mL, 1 ng/mL, 10 ng /mL, 100 ng/mL, 1000 ng/mL, 10 g/mL, 50 g/mL, 100 g/mL). Comme le montre la figure 1g, l'atrazine et l'Atr-BSA se sont combinées de manière compétitive avec l'anticorps immobilisé sur la surface du nanobiocapteur, ce qui à son tour entraîne une augmentation de la charge de masse sur la surface du nanobiocapteur, provoquant par conséquent une diminution de la fréquence de résonance avec l'incubation temps. Il ressort clairement de la figure 6 que la réponse en régime permanent est généralement obtenue à environ 50 min. La concentration d'Atr-BSA et le nombre de sites d'anticorps d'atrazine étaient fixes, de sorte que la quantité d'Atr-BSA liée sur le nanobiocapteur était inversement proportionnelle à la concentration d'atrazine en solution. Le poids moléculaire de l'Atr-BSA est supérieur à celui de l'atrazine. Par conséquent, la fréquence de résonance du nanobiocapteur change inversement avec la concentration d'atrazine en solution. Comme le montre la figure 6, la vitesse et l'amplitude du décalage de fréquence de résonance diminuaient avec l'augmentation des concentrations d'atrazine, et une concentration plus élevée d'atrazine peut induire un plus petit décalage de fréquence de résonance. La courbe de la figure 6 * représente une réponse de fond du capteur de contrôle à blanc (sans immobilisation d'anticorps d'atrazine) à Atr-BSA, qui est d'environ 48 Hz bien inférieure au signal de détection, indiquant que l'adsorption non spécifique peut être ignorée. Ainsi, la concentration d'atrazine peut être détectée par le décalage de fréquence de résonance du nanobiocapteur sans fil ME, avec une relation inversement proportionnelle.

Réponses en fréquence en temps réel à différentes concentrations d'atrazine allant de 0 à 100 g/mL. * La réponse de contrôle à blanc (sans immobilisation d'anticorps d'atrazine) à Atr-BSA

La courbe d'étalonnage standard pour la détection de l'atrazine sur le nanobiocapteur ME au cours des 50 premières minutes est illustrée à la figure 7. Pour chaque concentration, les expériences d'étalonnage du nanobiocapteur ont été menées cinq fois dans des conditions identiques. On constate que le décalage de fréquence de résonance est linéaire avec la valeur du logarithme des concentrations d'atrazine allant de 1 ng/mL à 100 g/mL, ce qui peut être représenté par ∆f = 54.717 log C _Atrazine − 442,45 (R ² = 0.971). La sensibilité est calculée à 3,43 Hz/μg mL ⁻¹ . Il ressort clairement de la figure 7 que la limite de détection (LOD) est de 1 ng/mL, ce qui est nettement inférieur à la limite supérieure admissible pour l'atrazine de 3 g/L donnée par l'US EPA, satisfaisant la norme actuellement disponible. De plus, la limite de détection est évidemment inférieure à celle des méthodes précédemment rapportées [36, 37]. Il a été démontré qu'un nanobiocapteur à faible coût, sans fil et très sensible a été mis en place avec succès pour la détection en temps réel de l'atrazine.

Courbe d'étalonnage :le décalage de 50 min de la fréquence de résonance en fonction des différentes concentrations d'atrazine

Étant donné que l'atrazine est la petite molécule, une approche d'immunoessai compétitif direct a été utilisée pour améliorer la sensibilité du nanobiocapteur ME. Dans le dosage immunologique compétitif direct, l'anticorps est modifié sur la surface du capteur et la réponse au signal résulte de la liaison de la molécule Atr-BSA. Inversement, dans le dosage immunologique compétitif indirect, Atr-BSA est immobilisé sur la surface du capteur et la réponse résulte de la liaison de la molécule d'anticorps. D'après les recherches de la littérature [38] et nos résultats, le dosage immunologique compétitif direct est réalisable pour le suivi de petites molécules. Le dosage immunologique compétitif indirect est très sensible à l'échantillon d'analyte avec une concentration à l'état de trace [39]. Bien que le dosage immunologique compétitif indirect ait une sensibilité plus élevée [40, 41], il peut être compliqué à opérer et difficile à mettre en œuvre pour une utilisation fiable répétée [36]. Cependant, le dosage immunologique compétitif direct est très rapide, simple à utiliser et autonome, aucun réactif supplémentaire n'est nécessaire [36]. Ainsi, pour le développement futur, le dosage immunologique compétitif direct peut être la méthode la plus prometteuse.

Spécificité du nanobiocapteur ME

La spécificité du nanobiocapteur ME à l'atrazine a été étudiée en déterminant les réponses du nanobiocapteur à d'autres pesticides, tels que la prométryne, la simazine et le DDT, comme le montre la figure 8. Il était évident à partir de la figure 8 que le nanobiocapteur ME a montré peu de réponses à ces les interférences dues à l'absorption non spécifique, et les réponses à la prométryne et à la simazine étaient légèrement supérieures à celles du DDT, qui avaient un niveau de réponse similaire à celui de la solution à blanc. Cela peut être dû au fait que la prométryne et la simazine ont des structures similaires avec l'atrazine, appartenant aux pesticides triazines ; cependant, le DDT est une sorte d'insecticide organochloré. Les résultats ont indiqué que l'atrazine était efficacement reconnue et spécifiquement combinée avec l'anticorps immobilisé sur la surface du nanobiocapteur. Ainsi, le nanobiocapteur ME a montré une forte spécificité pour la détection de l'atrazine.

Réponse en fréquence de résonance du nanobiocapteur ME à d'autres interférences avec une concentration de 100 g/mL

Stabilité du nanobiocapteur ME

La figure 9 montre la stabilité du nanobiocapteur ME vis-à-vis de la détection de l'atrazine. Six des mêmes nanobiocapteurs ME ont été préparés et stockés à 4 °C, chacun étant testé à 10 ng/mL d'atrazine tous les deux jours jusqu'à 6 jours. Chaque cycle de détection n'a testé qu'un seul nanobiocapteur pendant 50 min. Il est clair que les réponses en fréquence de résonance des nanobiocapteurs restent presque constantes et que l'écart type relatif (RSD) est calculé à 1,8 %. Le résultat démontre que le nanobiocapteur ME présente une excellente stabilité pour la détection de l'atrazine.

Mesures de stabilité de 10 ng/mL d'atrazine sur le nanobiocapteur ME

Conclusions

Un nanobiocapteur ME sans fil basé sur des matériaux ME et des AuNPs a été développé avec succès pour la détection en temps réel et très sensible de l'atrazine en utilisant le dosage immunologique compétitif. L'immobilisation orientée de l'anticorps d'atrazine à travers la protéine A a amélioré les performances du nanobiocapteur. Atr-BSA avec une masse moléculaire lourde et de l'atrazine combinée de manière compétitive avec un anticorps d'atrazine sur la surface du nanobiocapteur, amplifiant les réponses de signal, ce qui à son tour a amélioré la sensibilité. Le décalage de fréquence de résonance principalement induit par l'Atr-BSA lié est inversement proportionnel à la concentration d'atrazine cible. En outre, les concentrations de travail d'anticorps d'atrazine et d'Atr-BSA ont été optimisées pour être respectivement de 50 g/mL et 40 g/mL. Dans les conditions optimales, le nanobiocapteur ME affiche des plages de détermination largement linéaires pour l'atrazine de 1 ng/mL à 100 g/mL, avec une sensibilité satisfaisante de 3,43 Hz/μg mL ⁻¹ et la limite de détection de 1 ng/mL qui est suffisante pour les exigences législatives et est inférieure aux autres méthodes signalées. Les images AFM ont vérifié que l'anticorps d'atrazine a été immobilisé avec succès sur la surface du nanobiocapteur d'une manière orientée. Les résultats expérimentaux démontrent que le nanobiocapteur ME a une spécificité et une stabilité élevées vis-à-vis de l'atrazine. Bénéficiant de ses effets sur les limites de détection, la simplicité, la propriété jetable et la nature sans fil, l'étude a non seulement proposé une nouvelle méthode de détection très sensible de l'atrazine, mais a également indiqué sa faisabilité potentielle pour la détection d'autres contaminants environnementaux et la surveillance de la qualité de l'eau.

Abréviations

AFM :

Microscope à force atomique

Atr–BSA :

Antigène conjugué atrazine-albumine

AuNP :

Nanoparticules d'or

BSA :

Sérum albumine bovine

DDT :

Dichlorodiphényltrichloroéthane

EDC :

Chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide

ME :

Magnétoélastique

NHS :

N -Hydroxysulfosuccinimide

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

SAM :

Monocouche auto-assemblée

SEM :

Microscope électronique à balayage

US EPA :

Agence de protection de l'environnement aux États-Unis