Développement d'un biocomposite électrofilé de chitosan-oxyde de polyéthylène/fibrinogène pour des applications potentielles de cicatrisation

Contexte

Malgré de nombreux progrès réalisés dans le domaine de la gestion des plaies, peu de pansements bioactifs ont été commercialisés avec la capacité d'améliorer le processus de cicatrisation. Ce manque de succès du produit peut être attribué à la complexité du processus de cicatrisation, qui implique de nombreux médiateurs solubles, des cellules sanguines, des cellules parenchymateuses et des composants de la matrice extracellulaire (ECM). Les facteurs de croissance jouent un rôle central dans le processus de cicatrisation des plaies en favorisant la prolifération, la migration et la différenciation cellulaires. Cependant, l'élimination rapide et les demi-vies courtes dans le corps [1,2,3] ont limité l'adoption clinique de la thérapie par facteur de croissance pour favoriser la guérison et la régénération tissulaire [4, 5]. Actuellement, l'administration répétée in vivo de facteurs de croissance est nécessaire pour obtenir des effets thérapeutiques (par exemple, le recrutement et la différenciation cellulaires). Le développement d'un pansement capable d'administrer un facteur de croissance localisé et soutenu améliorerait considérablement les résultats du traitement et accélérerait l'adoption clinique.

Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) joue un rôle essentiel en tant qu'initiateur et médiateur de la cicatrisation des plaies; il agit comme un agent chimiotactique pour les neutrophiles, les monocytes et les fibroblastes [6] et aide à réguler le dépôt de la matrice. De plus, le PDGF peut inhiber la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes, ce qui peut avoir un impact sur les contractions de la plaie et diminuer la formation de cicatrices [6]. PDGF, vendu sous la marque Regranex®, est le seul facteur de croissance actuellement approuvé par la FDA et est destiné au traitement des ulcères diabétiques des membres inférieurs. Application topique une fois par jour de gel Regranex® (2,2 μg/cm ² de l'ulcère) s'est avérée entraîner un temps de guérison 30 % plus rapide avec des effets indésirables minimes. Cependant, l'application topique quotidienne et le retrait de Regranex® sont peu pratiques et peuvent avoir un impact négatif sur la qualité de vie des patients.

L'électrofilage a été établi comme une technique notable dans la fabrication d'échafaudages nanofibreux biomimétiques à l'aide de polymères biologiquement significatifs. De nombreux polymères synthétiques biodégradables (par exemple, la polycaprolactone) et naturels (par exemple, le collagène) ont été électrofilés dans des échafaudages nanofibreux non tissés qui présentent des rapports surface/volume élevés et des caractéristiques de porosité, qui sont importantes pour l'administration de médicaments et les applications de pansement. Les polymères naturels (par exemple, le collagène, l'élastine et le fibrinogène) sont des matériaux de pansement particulièrement attrayants en raison de leur bioactivité, leur biocompatibilité et leur capacité unique à se lier à des facteurs de croissance spécifiques, tels que le PDGF. Le fibrinogène (Fb), une protéine plasmatique globulaire de 340 kDa, joue un rôle majeur dans la formation de caillots grâce à sa forme activée, la fibrine, qui fonctionne comme une matrice temporaire pour la réparation et la régénération des tissus. L'absence de Fb et de fibrine a été corrélée à des défauts de cicatrisation [7]. Les produits à base de Fb démontrent la biodégradabilité, la non-immunogénicité et la promotion de la migration cellulaire et ont été précédemment développés sous forme d'hydrogels [8,9,10] et de câbles d'extrusion humides [11, 12] ; cependant, les propriétés physiques et structurelles de ces matériaux ont limité leur adoption clinique. Les hydrogels manquent d'intégrité structurelle et mécanique pour une utilisation à long terme, et les fibres d'extrusion humides présentent des diamètres exponentiellement plus grands (200-250 μm) que l'ECM natif (200-500 nm). Wnek et al. ont démontré que l'électrofilage, cependant, offre la capacité de fabriquer des échafaudages Fb qui ressemblent étroitement aux structures naturelles de l'ECM [13]. Bien que les nanofibres résultantes présentaient des propriétés mécaniques améliorées par rapport aux hydrogels, la structure manquait encore de propriétés mécaniques optimales pour les applications de pansement [14].

Pour améliorer les propriétés mécaniques de l'échafaudage de fibrinogène électrofilé, un polymère supplémentaire pourrait être introduit pour renforcer les nanofibres [15]. Plus précisément, le chitosan (CS), un N -déacétylé dérivé de la chitine, s'est avéré produire des propriétés antimicrobiennes souhaitables dans les applications de pansement [16, 17]. En plus d'être un puissant antimicrobien, le CS a été électrofilé pour diverses applications biomédicales, notamment la régénération osseuse guidée [18, 19], l'administration transdermique de médicaments [20], la différenciation dirigée des cellules souches [21] et l'hémostatique [22]. En raison de la nature polycationique du chitosane, l'électrofilage à l'aide de solvants courants présente des difficultés importantes. Pour surmonter ces difficultés et améliorer l'électrofilabilité, le CS a été mélangé avec divers autres polymères tels que le poly(vinylpyrrolidone) [23], le poly(oxyde d'éthylène) (PEO) [16] et le poly(alcool vinylique) [24]. De même, la nature polycationique du CS a limité la combinaison réussie avec Fb dans un seul échafaudage en raison de fortes interactions électrostatiques. Dans ce travail, cette limitation a été surmontée en utilisant un système polyvalent d'électrofilage à double buse. Les échafaudages nanofibreux résultants ont été analysés à l'aide de diverses caractérisations physicochimiques. Nous avons émis l'hypothèse que le nouvel échafaudage nanofibreux combinatoire CS-Fb présenterait un candidat viable pour un pansement bioactif et biomimétique qui pourrait délivrer du PDGF et pourrait être efficace pour influencer la migration des fibroblastes requise pour la cicatrisation des plaies.

Méthodes

Matériaux

Acide acétique (glacial, ≥  99,85 %), CS (faible poids moléculaire, 75 à 85 % de désacétylation), PEO (PM 300 000 g/mol), Fb (type IS, 65 à 85 % de protéines), 1,1,1, Le 3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP) et la sérumalbumine bovine (BSA, 96 %) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Le diméthylsulfoxyde (DMSO) a été acheté chez EMD Millipore (Billerica, MA, USA). Les fibroblastes dermiques humains (PCS-201-012) et les réactifs de culture cellulaire ont été achetés auprès de American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Le facteur de croissance BB dérivé des plaquettes humaines recombinant sans support (rhPDGF-BB) a été acheté auprès de PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA). Tous les réactifs étaient de qualité réactif et utilisés sans autre purification ni modification.

Préparation d'échafaudages composites électrofilés chitosane-oxyde de polyéthylène/fibrinogène

Les solutions mères de chitosan-PEO ont été préparées en dissolvant du CS et du PEO dans de l'acide acétique à 1 % avec du BSA (0,5 % v /v ) et DMSO (10 % v /v ) pour obtenir une teneur totale en polymère de 5,5% en poids avec un rapport massique de 2:1 CS à PEO. De l'oxyde de polyéthylène a été ajouté pour améliorer la capacité d'électrofilage du CS comme décrit précédemment [16]. Des solutions mères de fibrinogène (110 mg/mL) ont été préparées en dissolvant du Fb dans une partie 10 × de milieu essentiel minimum d'Eagle (EMEM) et neuf parties de HFIP. Les solutions mères de CS-PEO et de Fb ont été agitées à température ambiante jusqu'à dissolution complète. Pour les échafaudages chargés, PDGF a été mélangé dans chaque solution de polymère immédiatement avant électrofilage. Des échafaudages nanofibreux composites CS-PEO/Fb électrofilés ont été fabriqués à l'aide d'un système d'électrofilage à plusieurs buses (Fig. 1). Les solutions ont été chargées individuellement et pompées mécaniquement dans le système à l'aide d'une seringue jetable, connectée à une filière de calibre 18 et à une pompe à seringue NE-1000 (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY), à un débit de 0,7 et 1,0 mL h ⁻¹ pour CS-PEO et Fb, respectivement. Le mandrin collecteur, tournant à 25 tr/min, était situé entre les pointes des filières à une distance de 22 cm pour le CS-PEO et de 12,5 cm pour le Fb. Au cours du processus de fabrication, des tensions continues de 28 et 22 kV ont été appliquées aux pointes des filières pour les solutions de polymère CS-PEO et Fb, respectivement. Des échafaudages de nanofibres fabriqués ont été soit collectés sur des lamelles de verre de 18 cm pour des essais biologiques, soit directement découpés dans le mandrin pour une analyse de perméabilité et de résistance à la traction. Toutes les expériences d'électrofilage ont été réalisées à température ambiante et à une humidité relative de 35 à 45 % pendant 3 h. Les échantillons contenant du PDGF ont été stockés à − 20 °C dans un dessiccateur, tandis que les échafaudages non chargés ont été stockés dans un dessiccateur à température ambiante après fabrication.

Schéma de l'électrospinner à double filière

Morphologie et diamètre des nanofibres

Des échafaudages nanofibreux électrofilés ont été recouverts d'or par pulvérisation cathodique et observés en utilisant la microscopie électronique à balayage à émission de champ (FESEM) (Zeiss Sigma VP-40, Allemagne). Vingt micrographies ont été prises par échafaudage, et trois échafaudages filés individuellement ont été analysés par formulation. Les diamètres moyens des nanofibres ont été calculés en mesurant cinq points aléatoires par micrographie en utilisant ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Un nombre total de 100 mesures ont été effectuées par formulation d'échafaudage.

Caractérisation de la chimie de surface

La spectrométrie de masse ionique à temps de vol (ToF-SIMS) a été utilisée pour analyser la chimie de surface et les contributions des composants polymères dans l'échafaudage. ToF-SIMS est une méthodologie d'analyse de surface sensible et approfondie qui évalue la composition chimique de la couche nanométrique supérieure d'un matériau par bombardement avec du Bi₃ à haute énergie. ²⁺ clusters sous ultra-vide [25, 26]. Les fragments d'ions secondaires éjectés de la surface du matériau sont ensuite analysés en fonction de leur rapport masse atomique sur charge (m/z) et utilisés pour déduire la composition chimique globale de la surface.

L'analyse ToF-SIMS a été réalisée par Evans Analytics Group (EAG, Sunnyvale, CA) à l'aide d'un ToF-SIMS IV (Ion-ToF GmBH, Allemagne) avec un canon à ions de métal liquide au bismuth (30 kV). L'instrument a fonctionné dans un mode de microsonde ionique où trois spectres d'ions positifs et négatifs ont été acquis à partir de chaque échantillon. Les ions positifs et négatifs sélectionnés ont été cartographiés sur une zone raster de 50 × 50-μm avec une résolution d'image de 2048 × 2048 pixels pour fournir une cartographie des composants polymères des échafaudages. Une intensité normalisée, définie comme le nombre de chaque ion secondaire divisé par le nombre total d'ions enregistrés multiplié par 10 000, a été rapportée pour chaque fragment. La moyenne de trois emplacements différents sur la surface de six échantillons fabriqués indépendamment a été analysée (n = 6). La distribution des polymères CS-PEO et Fb analysée par ToF-SIM était représentative de l'ensemble de l'échafaudage.

Les angles de contact avec l'eau des échafaudages CS-PEO, CS-PEO/Fb et Fb ont été déterminés conformément aux normes américaines pour les méthodes d'essai (ASTM) D7334-08. Des échafaudages en nanofibres ont été électrofilés sur des lamelles de verre. Une seule goutte d'eau distillée (2 μL) a été appliquée sur la surface de l'échafaudage et l'angle de contact mesuré dans les 30 s à l'aide de l'analyseur de forme de goutte Krüss DSA10 MK2 (Krüss, Hambourg, Allemagne). Les mesures ont été répétées trois fois à différents endroits pour chaque échantillon, et l'angle de contact moyen a été calculé. Six échafaudages électrofilés indépendamment ont été analysés (n = 6).

Résistance à la traction mécanique uniaxiale

Les propriétés mécaniques des échafaudages électrofilés ont été mesurées à température ambiante à l'aide d'un Instron® E3000 ElectroPuls (Instron, Canton, MA) équipé d'une cellule de charge 250-N à une vitesse de déformation de 1 mm min ⁻¹ . L'épaisseur des échantillons a été mesurée à six positions aléatoires par le microscope à balayage laser 3D Keyence VK-200 (Keyence, Itasca, IL). L'épaisseur des échafaudages utilisés pour les essais de traction était de 93,8 ± 7,4 μm. Avant le test, les échafaudages ont été découpés en éprouvettes rectangulaires de 40 x 25 mm. Les données obtenues ont été rapportées et tracées sous forme de courbes contrainte-déformation, où la contrainte de traction était définie comme le rapport de la force à la section transversale de l'échantillon et où la déformation était définie comme le changement de longueur par rapport à la longueur d'origine. Les modules de Young, la contrainte de traction et les calculs de déformation à la rupture ont été obtenus à partir de courbes de contrainte-déformation à partir d'une moyenne de dix échantillons par formulation.

Taux de transfert de vapeur d'eau

Le taux de transfert de vapeur d'eau des échafaudages CS-PEO/Fb a été mesuré selon la méthode de dessiccation ASTM E96/E96M. Un total de six échantillons électrofilés indépendamment ont été préparés par formulation et placés sur l'ouverture de récipients d'essai contenant un déshydratant de gel de silice réutilisable à température ambiante et une humidité relative moyenne de 58,2 ± 5,2 %. Le taux de transmission de la vapeur d'eau (WVTR) a été calculé à partir du poids des conteneurs de test mesuré à différents moments sur 48 h :

où G représente le changement de poids du conteneur de test, t est le temps écoulé, et A est la section transversale de l'échafaudage.

Viabilité cellulaire in vitro

La cytotoxicité indirecte des échafaudages a été évaluée sur la base d'une approche adaptée de la méthode d'essai standard ISO10993-5 [27, 28]. Des fibroblastes dermiques humains ont été cultivés à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un milieu fibroblastique sans sérum et renouvelé tous les 3 jours. Une fois que les cellules ont atteint la confluence, elles ont été trypsinisées et ensemencées dans des plaques à 12 puits (10 000 cellules/mL). Le lendemain, les milieux ont été réapprovisionnés et des échafaudages nanofibreux ont été introduits. La prolifération cellulaire a été surveillée pendant 120 h à l'aide d'un test de prolifération cellulaire au 2-(4-iodophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-(2,4-disulfophényl)-2H-tétrazolium sodique (WST-1).

Visualisation des fibroblastes

Des fibroblastes dermiques humains ont été trypsinés et ensemencés sur des échafaudages CS-PEO, Fb et CS-PEO/Fb. Après 24 h d'incubation à 37 °C et 5% CO₂ , les cellules ont été lavées et colorées avec le kit de viabilité cellulaire LIVE/DEAD™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) selon les spécifications du fabricant. De plus, l'adhésion et la fixation des fibroblastes humains à l'échafaudage ont été évaluées par coloration avec Phalloidin-Atto 565 (Sigma Aldrich et dichlorhydrate de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; ThermoFisher Scientific) selon les spécifications du fabricant. Des images ont été observées et prise à l'aide d'un microscope confocal inversé (Nikon C1, C1EZ, Melville, NY, USA).

Dégradation in vitro

La dégradation des échafaudages nanofibreux CS-PEO/Fb a été réalisée en milieu basal fibroblastique (FBM, ATCC) à 37 °C et 5% CO₂ . Les échafaudages ont été immergés dans du FBM et incubés pendant 1, 6, 24 ou 48 h. Le poids sec initial de chaque échafaudage a été noté; à chaque instant, les échafaudages ont été lavés, lyophilisés et pesés à nouveau. La dégradation de l'échafaudage a été calculée à partir de la formule suivante :

où W ₀ est le poids initial de l'échafaudage, et W _t est le poids de l'échafaudage au moment respectif.

Libération et détection de PDGF

Les éluats, collectés à des moments précis au cours de l'expérience de dégradation in vitro, ont été analysés à l'aide d'un kit ELISA spécifique de rhPDGF-BB (R&D System, Minneapolis, MN). Les valeurs d'absorbance détectées ont été comparées à une norme, comme spécifié par les instructions du fabricant pour la détermination de la concentration de PDGF. La quantité de PDGF détectée a été normalisée au poids (mg) de l'échafaudage correspondant utilisé.

Propriété migratoire du facteur de croissance dérivé des plaquettes libéré

La migration des fibroblastes dermiques humains a été évaluée à l'aide du kit de test de migration cellulaire ORIS™ (Platypus Technologies, Madison, WI) pour évaluer la bioactivité du PDGF. Brièvement, des fibroblastes traités à la mitomycine C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ont été trypsinés et ensemencés dans des plaques 96 puits contenant des bouchons fournis par le fabricant et incubés à 37 ° C et 5% CO₂ pendant la nuit. Le lendemain, les bouchons ont été retirés, créant des zones de migration auxquelles 100 μL d'éluats collectés à différents moments ont été ajoutés et incubés pendant 24 h supplémentaires. 50 ng mL ⁻¹ fraîchement préparés Le PDGF et les milieux fibroblastiques basaux ont été utilisés comme témoins positifs et négatifs, respectivement. La migration des fibroblastes a été exprimée sous la forme d'un facteur de changement, par rapport à la migration provoquée par les 50 ng mL ⁻¹ Traitement PDGF. Les études ont été réalisées en triple dans trois expériences indépendantes pour trois concentrations de charge (2, 4 et 8 μg/mL).

Analyse statistique

Les données continues ont été exprimées sous forme de moyennes ± déviations standard. Les différences entre les moyennes des groupes ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance à un facteur (ANOVA). Le test de comparaison multiple de Tukey a été utilisé pour déterminer quelles moyennes parmi un groupe de moyennes étaient statistiquement différentes. La signification statistique a été fixée à α = 0,05. Toutes les données ont été analysées à l'aide de GraphPad Prism (San Diego, Californie, États-Unis).

Résultats et discussion

Il a été démontré que la combinaison de divers polymères améliore considérablement les propriétés du composite résultant [29, 30]. Les systèmes polymères combinatoires permettent efficacement la modulation de la résistance de l'échafaudage, de la flexibilité, de la biodégradation et de la cinétique de libération du médicament, qui sont des paramètres importants pour les applications de pansement. Cependant, la création de composites uniques peut être limitée par des interactions chimiques intrinsèques entre les polymères constitutifs. Par exemple, on a observé la formation d'un précipité de polymère lors du mélange de Fb chargé négativement et de CS chargé positivement; cette observation est bien documentée pour les molécules avec de fortes interactions électrostatiques dans diverses conditions de solvant [31,32,33]. Par conséquent, la fabrication d'un échafaudage composite polymère CS-Fb a nécessité l'utilisation d'une technique d'électrofilage à double extrusion, comme décrit précédemment [34].

Morphologie des nanofibres CS-PEO/Fb

Les diamètres moyens des fibres pour les échafaudages CS-PEO, CS-PEO/Fb et Fb étaient de 269,9 ± 68,4, 202,3 ± 113,2 et 351,1 ± 101,7 nm, respectivement (Fig. 2). Fait intéressant, les échafaudages composites CS-PEO/Fb présentaient des nanofibres plus minces que les échafaudages CS-PEO ou Fb. La diminution de la taille du diamètre des fibres pourrait être due à des forces électrostatiques supplémentaires générées par des jets de polymère chargés simultanément [35,36,37]. La répulsion des jets de polymères les uns par rapport aux autres provoquée par ces forces pourrait donc augmenter à la fois la distance inter-filières et le temps de dépôt. Le temps de dépôt prolongé qui en résulte est en corrélation avec des instabilités de flexion accrues qui sont connues pour provoquer l'allongement des fibres et la formation de fibres plus minces.

Micrographies FESEM représentatives d'échafaudages électrofilés. un CS-PEO, diamètre moyen 269,9 ± 68,4 nm. b CS-PEO/Fb, diamètre moyen 202,3 ± 113,2 nm. c Fb, diamètre moyen 351.1 ± 101.7 nm (n = 100)

Caractérisation de la chimie de surface via ToF-SIMS et angle de contact avec l'eau

Les spectres ToF-SIMS des échafaudages CS, Fb et PEO sont illustrés à la figure 3. Normalement, des espèces d'empreintes chimiques uniques peuvent être utilisées pour distinguer les composants polymères individuels. En raison des similitudes chimiques entre CS et Fb, cependant, il y avait un certain nombre d'espèces contenant de l'azote (C₃ H₆ NON ⁺ , CH₄ N ⁺ , CN ⁻ , et CNO ⁻ ) présent dans les deux spectres, ce qui rend difficile la distinction des polymères entre eux. Cependant, lorsque Fb a été incorporé dans l'échafaudage, le nombre total de CN ⁻ et CNO ⁻ espèces ont augmenté alors que les autres fragments sont restés inchangés ou ont diminué. Par conséquent, l'examen des changements dans CN ⁻ et CNO ⁻ les intensités des fragments ont permis la détection indirecte de Fb. De même, l'augmentation de C₂ H₅ O ⁺ (45 m/z) ont été utilisés pour identifier les fragments d'oxyde d'éthylène du PEO dans les échafaudages composites.

Représentant a positif et b spectres ToF-SIMS d'ions négatifs pour CS vierge (en haut), Fb (au milieu) et PEO (en bas). Des fragments d'ions encerclés ont été utilisés comme empreinte digitale unique pour identifier le composé

Pour élucider la présence et la distribution des composants Fb dans les échafaudages composites, CNO ⁻ et CN ⁻ Les ions ont été cartographiés sur un raster de 50 × 50-μm des échafaudages vierges et composites pour obtenir des cartes thermiques (Fig. 4a, b). La même technique de cartographie a été réalisée sur C₂ H₅ O ⁺ pour déterminer la distribution du PEO (Fig. 4c). L'intensité accrue de la carte thermique était corrélée à une teneur plus élevée en polymère de Fb ou de PEO. Nous avons observé que les intensités de CNO ⁻ , CN ⁻ , et C₂ H₅ O ⁺ étaient uniformément répartis dans toute la zone de trame de 50  × 50 μm des échafaudages composites. En raison de l'épaisseur des échafaudages (93,8 ± 7,4 μm) et du dépôt de fibres couche par couche, la composition de la surface devrait être représentative de l'ensemble de l'échafaudage. Par conséquent, les données ToF-SIM suggèrent que lorsque des échafaudages nanofibreux CS-PEO/Fb sont fabriqués à l'aide d'un électrofilage à double filière, les composants individuels sont déposés uniformément dans l'échafaudage composite.

Cartographie ToF-SIMS de a CNO ⁻ , b CN ⁻ , et c C₂ H₅ O ⁺ fragments d'ions sur divers échafaudages sur une zone raster de 50 × 50-μm

Les angles de contact avec l'eau des échafaudages fibreux électrofilés CS-PEO, CS-PEO/Fb et Fb ont été déterminés à 44,2° ± 5,1°, 61,4° ± 7,6° et 115,7° ± 16,2°, respectivement (Fig. 5). Sur la base des angles de contact avec l'eau, les échafaudages CS-PEO et CS-PEO/Fb étaient hydrophiles (> 90°), tandis que les échafaudages Fb étaient hydrophobes (< 90°). Les angles de contact avec l'eau des échafaudages composites CS-PEO/Fb ont démontré des caractéristiques de surface qui se situaient entre celles de ses composants, ce qui suggère que CS-PEO et Fb ont été déposés de manière homogène pendant la fabrication. Les caractéristiques de surface des surfaces polymères jouent un rôle important dans le dépôt de protéines et de facteurs d'adhésion. Plus précisément, d'importants facteurs d'adhésion bactérienne sont connus pour se produire plus facilement sur les surfaces hydrophobes, ce qui favorise la colonisation bactérienne [38]. En tant que tel, la nature hydrophile du CS-PEO/Fb pourrait être bénéfique pour dissuader l'attachement bactérien.

Comportement de l'eau déminéralisée à la surface d'un substrat en verre, échafaudages CS-PEO, CS-PEO/Fb et Fb

Résistance à la traction mécanique uniaxiale des échafaudages CS-PEO/Fb

Des essais de traction uniaxiale ont été effectués sur des échafaudages nanofibreux d'une épaisseur moyenne de 93,8 ± 7,4 μm. Un résumé des résultats est présenté dans le tableau 1 et les courbes contrainte-déformation correspondantes sont présentées sur la figure 6. En règle générale, les propriétés mécaniques des matériaux composites sont corrélées avec leur constituant le plus faible. Les résultats suggèrent que les échafaudages uniquement en Fb n'auraient pas les propriétés mécaniques idéales pour les applications de pansement. Cela souligne l'importance d'incorporer CS-PEO pour obtenir un produit plus stable mécaniquement.

Courbes contrainte-déformation des échafaudages CS-PEO, CS-PEO/Fb et Fb. Les données sont représentatives de dix échafaudages produits indépendamment

Taux de transfert de vapeur d'eau des échafaudages CS-PEO/Fb

Le WVTR joue un rôle essentiel dans le maintien d'une humidité idéale de l'environnement de la plaie, ce qui a un impact positif sur la granulation et l'épithélisation cellulaires [39, 40]. Des valeurs de WVTR plus élevées sont en corrélation avec une déshydratation rapide de la plaie due à l'évaporation et à l'exsudation, ce qui peut diminuer la température corporelle et augmenter le métabolisme. À l'inverse, des valeurs de WVTR extrêmement faibles sont en corrélation avec l'accumulation d'exsudat, l'inhibition de la cicatrisation et un risque accru d'infection. Lamke et al. a rapporté que le WVTR pour une peau normale était de 204 ± 12 g m ⁻² jour ⁻¹ et entre 279 et 5138 g m ⁻² jour ⁻¹ pour les peaux lésées, en fonction de l'état de la plaie [41, 42]. Pour l'épithélialisation des plaies et l'amélioration de la cicatrisation, un WVTR idéal de 2028,3 ± 237,8 g m ⁻² jour ⁻¹ a été rapporté [43]. Les WVTR des échafaudages CS-PEO et Fb étaient de 693,2 ± 95,7 et 686,1 ± 44,17 g m ⁻² jour ⁻¹ , respectivement. Bien que plus proches du WVTR idéal que les échafaudages vierges, les échafaudages CS-PEO/Fb (806,5 ± 56,1 g m ⁻² jour ⁻¹ ) était toujours en dessous du WVTR idéal (Fig. 7). Les manipulations des paramètres physiques de l'échafaudage pourraient améliorer les WVTR pour mieux imiter les taux idéaux signalés.

Taux de transfert de vapeur d'eau des échafaudages électrofilés CS-PEO, CS-PEO/Fb et Fb. Les barres d'erreur représentent l'écart type (n = 6, *p < 0,05 par rapport aux échafaudages CS-PEO/Fb)

Viabilité cellulaire in vitro des fibroblastes dermiques humains

Les échafaudages Chitosan-PEO/Fb n'ont pas montré d'effet prolifératif significatif sur les fibroblastes humains au cours des 48 h initiales (Fig. 8) ; pourtant, une exposition prolongée à 72 h a produit une réduction statistiquement significative de la prolifération par rapport au témoin sans échafaudage. Les résultats suggèrent qu'il existe une inhibition de la prolifération cellulaire présentée par l'échafaudage, qui peut être cumulative au fil du temps.

Comparaison de la prolifération des fibroblastes dermiques humains lorsqu'ils sont exposés à un échafaudage électrofilé Fb et CS-PEO/Fb (n = 9, *p < 0,05 comparaison faite à « aucun contrôle d'échafaudage » à chaque instant)

La diminution de la capacité de prolifération peut être due au degré d'acétylation (DA) associé au CS, qui a démontré avoir de fortes interactions cellulaires à travers ses charges positives [44]. Younes et al. ont démontré que les cellules de carcinome de la vessie traitées avec le CS (> 50 % DA) réduisaient considérablement la viabilité après 24 h, suggérant que la cytotoxicité du CS est directement liée à son DA qui peut avoir un impact sur la prolifération [45]. Cet effet peut également être isolé dans des conditions expérimentales in vitro; des études antérieures ont montré que le CS n'était pas toxique in vivo, car ses produits de biodégradation pourraient être éliminés par des voies métaboliques [46]. Le HFIP résiduel du processus d'électrofilage peut également contribuer à la cytotoxicité observée. Cependant, la même cytotoxicité n'a pas été observée dans l'échafaudage électrofilé Fb pur, qui a également été préparé en HFIP. Le HFIP a probablement été éliminé des échafaudages électrofilés au cours du processus de fabrication en raison de sa forte volatilité. Une diminution observable de la viabilité cellulaire serait évidente si le HFIP résiduel incorporé dans le système de fibres était libéré au cours d'une exposition chronométrée aux fibroblastes dermiques humains.

Test LIVE/DEAD et attachement cellulaire

La figure 9a–c montre la distribution et la viabilité des fibroblastes dermiques ensemencés à la surface du verre recouvert de fibronectine, des échafaudages CS-PEO/Fb non chargés et des échafaudages CS-PEO/Fb chargés en PDGF (4 μg/mL). Après 24 h de culture, des cellules mortes minimes ont été observées par rapport aux cellules vivantes. Aucune différence discernable entre les échafaudages chargés de PDGF et non chargés n'a été notée.

Micrographies confocales de fibroblastes ensemencés sur a , d fibronectin-coated glass; b , e unloaded CS-PEO/Fb scaffold; et c , f PDGF-loaded (4 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. a–c Cells were stained with LIVE/DEAD™:live cells (green), dead cells (red). d–f Cells were stained with DAPI (blue) and phalloidin (red)

Fibrinogen serves as an important mediator of cellular attachment and growth during wound healing. Phalloidin stains cellular actin filaments allowing for visualization of fibroblast attachment. Figure 9c, d shows the actin filament morphology of the fibroblasts on the surface of fibronectin-coated glass, unloaded CS-PEO/Fb scaffolds, and PDGF-loaded CS-PEO/Fb scaffolds. Overall, normal fibroblast morphology was observed, with the exception of some rounder cells being present on the scaffold samples. The changes in morphology may be attributed to the presence of CS, as shown in previous studies [47]. Alternatively, the differences could be due to the small porosity of the scaffold and dimensionality of the fiber surface in comparison to the flat surface of the control.

In Vitro Degradation of Electrospun CS-PEO/Fb Scaffolds

Scaffold degradation was evaluated by obtaining the dry weight of the scaffold after incubation in FBM for up to 48 h (Fig. 10). The scaffolds degraded at a linear rate after an initial burst release of material within the first hour. Weight loss in the initial hour was likely due to the solubility of PEO in aqueous solutions [16], and the subsequent weight loss was likely due to Fb and CS release. This highlights a unique biphasic degradation profile that could be beneficial for the delivery of bioactive molecules. Concurrently, CS-PEO/Fb scaffolds were shown to maintain their substructure for a minimum of 48 h (Fig. 10:insert), and the addition of 8 μg/mL of PDGF did not alter the scaffold degradation properties.

Degradation of electrospun unloaded CS-PEO/Fb scaffolds and PDGF-loaded (8 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. Insert:FESEM micrograph of CS-PEO/Fb scaffold after 48 h of incubation (n  = 6)

In Vitro Release of PDGF

Cumulative releases of PDGF after 48 h of incubation were 1.8 ± 0.7, 4.4 ± 1.8, and 11.4 ± 4.8 ng of PDGF/mg of scaffold for initially incorporated concentrations of 2, 4, and 8 μg/mL of PDGF, respectively. The results demonstrated that PDGF was released from the scaffolds in a dose-dependent manner (Fig. 11).

PDGF is released from CS-PEO/Fb scaffolds for up to 48 h in a dose-dependent manner (n  = 10, *p  < 0.05 when compared to 2 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point, ^# p  < 0.05 when compared to 4 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point)

During the in vitro degradation, CS-PEO/Fb scaffolds exhibited a unique biphasic release profile, with 21.6 ± 0.1% of the total eluted PDGF being detected in the first hour followed by linear release kinetics. This observation was thought to be a result of the combined polymers and highlighted the functional importance of Fb as a reservoir for the sustained release of biologically critical molecules. Growth factors (e.g., PDGF/VEGF, FGF, and TGF-β families) have been shown to bind the Fb heparin domain with high affinity and have been reported to retain their bioactivity for over 7 days [48,49,50].

Effects of Released PDGF on Fibroblast Migration

Fold differences in fibroblast migration in response to the released PDGF eluates collected from the scaffolds at various time points are shown in Fig. 12. Previously published reports have demonstrated that fibroblast attachment and migration rates are affected by PDGF in a dose-dependent manner [51, 52]. For example, Gamal et al. showed when at least 50 ng/mL PDGF was delivered locally, adherent fibroblast migration was increased [52]. In addition, Thommen et al. reported that the distance of migration was significantly increased when exposed to PDGF concentrations greater than 10 ng/mL [53]. Therefore, the biological activity of the scaffold-eluted PDGF was measured by its ability to induce migration and was normalized to a single 50 ng/mL PDGF dose.

Human dermal fibroblast migration after 24 h exposure to scaffold eluates acquired at 1, 6, 24, and 48 h in FBM (n  = 8, *p  < 0.05 when compared to unloaded CS-PEO/Fb scaffold at each specific time point)

Eluates collected from electrospun scaffolds, which were loaded with 4 or 8 μg PDGF/mL polymer solutions, demonstrated similar levels of fibroblast migration when compared to a single 50 ng/mL treatment. The data suggest that PDGF delivered by electrospun nanofibers can be equally effective in promoting fibroblast migration as a single application of PDGF. Additionally, the migration elicited by the scaffold-released PDGF was sustained for 48 h. Sustained delivery of PDGF eliminates the need for daily applications, which is an advantage over commercially available treatments such as Regranex®.

Fibroblast migration reached a maximum when cells were treated with the 24-h eluates from each of the PGDF-loaded scaffolds. Notably, when fibroblasts were treated with the 6-h eluates from the 4 and 8 μg PDGF/mL electrospun scaffolds, the same level of maximum migration was achieved. This suggests that the rate of migration increased in response to increased PDGF loading. Additionally, 4 and 8 μg/mL PDGF-loaded scaffolds might be able to elicit fibroblast migration potentials beyond the detection limits of the current assay, which can only assess the endpoint of migration, but not the migration rate. Finally, results demonstrated that eluates from unloaded CS-PEO/Fb scaffolds were also capable of eliciting a linear increase in migration over the same elution time points, albeit less effectively than the PDGF-loaded scaffolds. This result is most likely mediated by the ability of fibrinogen to enhance fibroblast migration [54, 55]. In general, PDGF-loaded composite scaffolds significantly improved in vitro migration, compared to the individual components of the scaffold.

Conclusion

The versatility of electrospinning allows for the combination of advantageous properties of various polymers and proven bioactive molecules. We utilized this technique to fabricate unique CS-PEO/Fb scaffolds with the ability to release biologically active PDGF over 48 h. This study evaluated the chemical and physical properties of the nanofibrous scaffolds including (1) morphology, (2) physical and mechanical properties, (3) in vitro scaffold degradation, and (4) the ability to release functional PDGF in a dose- and time-dependent manner. Electrospun CS-PEO/Fb scaffolds demonstrated nanoscale morphological properties that are conducive to wound dressing applications, as well as an adequate WVTR, mechanical stability, and a unique biphasic PDGF delivery profile. Furthermore, PDGF maintained its biological function throughout the electrospinning process, and when combined with the natural, chemotactic properties of Fb elicited dermal fibroblast migration that is functionally equivalent to a single 50 ng/mL dose of PDGF. Overall, these results highlight the potential of CS-PEO/Fb scaffolds as a viable wound dressing capable of delivering bioactive PDGF to enhance fibroblast recruitment and wound healing.

Abréviations

CS:

Chitosan

DA:

Degree of acetylation

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

ECM:

Extracellular matrix

EMEM:

Eagle’s minimum essential media

Fb:

Fibrinogen

FBM:

Fibroblast blast media

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FGF:

Fibroblast growth factor

HFIP:

1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol

PDGF :

Facteur de croissance dérivé des plaquettes

PEO :

Oxyde de polyéthylène

PLGA:

Poly(lactide-co-glycolide)

TGF-β:

Transforming growth factor beta

ToF-SIMS :

Spectrométrie de masse d'ions secondaires à temps de vol

VEGF :

Facteur de croissance endothélial vasculaire

WVTR:

Water vapor transfer rate