Étude expérimentale d'éthosomes encapsulés de 5-fluorouracile combinés à un laser fractionné au CO2 pour traiter les cicatrices hypertrophiques

Contexte

La cicatrice hypertrophique est une affection cutanée caractérisée par des dépôts de quantités excessives de collagène qui donnent lieu à une cicatrice surélevée, mais n'atteignant pas le degré de chéloïdes observé [1]. Un total de 100 millions de patients ont développé des cicatrices dans les pays développés chaque année, à la suite de 55 millions d'opérations électives et 25 millions d'opérations après un traumatisme [2]. Après l'opération chirurgicale, environ 60 % des patients ont développé des cicatrices hypertrophiques après l'opération, généralement au cours des 3 premiers mois. La plupart des cicatrices hypertrophiques sont encore hypertrophiques 12 mois après les opérations chirurgicales [3]. Actuellement, les méthodes de traitement courantes comprennent des traitements chirurgicaux et non chirurgicaux. La pression, la radiothérapie, la chimiothérapie et d'autres traitements chirurgicaux médicamenteux sont les principaux traitements thérapeutiques. Jusqu'à présent, ces thérapies n'ont pas pu atteindre l'effet thérapeutique souhaité en raison de leurs défauts [4, 5]. La thérapie médicamenteuse est l'un des traitements non chirurgicaux les plus courants pour la cicatrice pathologique à la peinture externe basée sur des injections locales. En raison des effets secondaires des médicaments, les injections locales sont souvent limitées à un traitement à petite échelle et à faible dose. De plus, en raison de la courte demi-vie du médicament, les injections locales de médicament n'ont toujours pas réussi à maintenir des concentrations élevées de longue durée sur la cicatrice; par conséquent, des injections répétées sont souvent nécessaires [6]. Compte tenu de la densité du tissu cicatriciel et de la douleur intense, l'injection n'est généralement pas acceptable pour les patients. Malgré les avantages, notamment indolore, sans effet secondaire sur le foie et pratique pour un usage externe à long terme [7, 8], les médicaments ne pouvaient pas pénétrer dans la cicatrice en raison de la structure organisationnelle spéciale des cicatrices pathologiques. Des rapports récents ont également indiqué que les médicaments topiques sont difficiles à pénétrer dans le tissu cicatriciel [9]. Ainsi, l'utilisation externe du médicament est actuellement limitée.

Les éthosomes sont un nouveau vecteur lipidique utilisé par Touitou en 2000 [10], efficace pour délivrer des médicaments à travers la peau. Le composant principal des éthosomes est l'éthanol, qui peut modifier l'arrangement serré des molécules lipidiques de la cuticule, améliorer la fluidité des lipides et favoriser la flexibilité et la mobilité de la membrane des liposomes d'éthanol. L'éthanol provenant des éthosomes peut également accélérer la déformation de la couche cornée et améliorer sa capacité de transport et de pénétration du médicament à travers la couche cornée désordonnée dans la peau [11,12,13]. Cependant, étant différent du tissu cutané normal, le tissu cicatriciel a une structure spéciale. Dans notre étude précédente, nous avons démontré que les éthosomes sont un vecteur très efficace de médicament dans la cicatrice humaine [14]. Il est indispensable que le médicament dans le tissu cicatriciel ne soit pas bien réparti, mais qu'il soit significativement diminué de l'extérieur vers l'intérieur de la peau. Le médicament s'accumule principalement dans l'épiderme et la couche superficielle du derme mais pas dans toutes les couches du derme, ce qui diminue l'effet anti-cicatrice.

La thérapie laser fractionnée ablative, une technologie cosmétique, est une modalité très populaire et largement acceptée actuellement et principalement utilisée pour le traitement clinique des rides du visage, des cicatrices superficielles, des troubles de la pigmentation et de l'amélioration de la texture de la peau [15,16,17]. Basé sur la théorie de la photothermolyse à matrice de points [18], le laser fractionné ablatif produit un arrangement de type réseau de minuscules faisceaux laser et perturbe la barrière cutanée en créant des canaux verticaux microscopiques ablatifs entourés d'une zone de dommages thermiques, induisant une réponse de cicatrisation des plaies sur une peau modérée apparence [19,20,21,22]. Il a été rapporté que la principale barrière à l'absorption percutanée du médicament est le stratum corneum [23, 24]. Des études récentes ont montré que, l'un des lasers fractionnés ablatifs cliniques les plus couramment utilisés, le CO₂ le laser fractionné peut décomposer la couche cornée et former des canaux microporeux denses, sapant ainsi la principale barrière empêchant l'absorption percutanée du médicament et offrant de bonnes perspectives de pénétration transdermique du médicament [25,26,27,28].

Dans cette étude, nous avons exploré le CO₂ gel éthosomique fractionné à médiation laser portant le médicament anti-cicatrice 5-florouracil (5-FU) dans des échantillons de cicatrice humaine et un modèle de cicatrice hypertrophique d'oreille de lapin. En utilisant cette nouvelle approche, nous nous sommes concentrés sur l'amélioration de l'efficacité de l'administration de médicaments anti-cicatrices afin de raccourcir le processus de traitement des cicatrices longues. Pour la première fois, un modèle de cicatrice hypertrophique d'oreille de lapin a été appliqué pour déterminer le CO₂ ethosomes fractionnés à l'échelle nanométrique à médiation laser portant du 5-FU sur les cicatrices hypertrophiques et l'effet de pénétration du médicament. Ensemble, il a été suggéré que CO₂ le laser fractionné combiné à un médicament topique fournit une nouvelle méthode de thérapie pour la cicatrice hypertrophique humaine.

Méthodes

Ethosomes encapsulés 5-FU

La méthode de Touitou [10] a été utilisée comme préparation d'éthosomes encapsulés 5-FU. La distribution granulométrique de 25 °C et l'indice de polydispersité (PDI) ont été déterminés à l'aide d'un granulomètre laser (λ = 632,8 nm). Un PDI <0,1 indique une distribution granulométrique régulière et un PDI> 0,3 suggère une distribution granulométrique inhomogène. La microscopie électronique à transmission (MET) a été utilisée pour l'observation de la morphologie des éthosomes. La méthode d'ultracentrifugation [29] a été utilisée pour mesurer l'efficacité d'encapsulation (EE) des éthosomes dans cette étude.

Chromatographie liquide haute performance

La concentration de 5-FU dans le compartiment récepteur des cellules de Franz a été déterminée par un système HPLC Waters 2695 (Meadows Instrumentation, Illinois) et un détecteur ultraviolet 2487 avec une colonne Diamonsil TM C18 en phase inverse (250 mm × 4,6 mm, 5 μm ). Le 5-FU a été détecté à 265 nm avec une phase mobile de méthanol-H₂ O (5:95 v /v ) à un débit de 1 ml/min. Les données ont été analysées par zone de pic et la méthode standard externe, en utilisant un système Waters Empower.

Microscopie confocale à balayage laser

Le tissu cicatriciel hypertrophique humain a été analysé par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) par incréments de 10 μm. L'intensité de fluorescence a été analysée à l'aide d'un microscope à balayage laser LSM 510 (Zeiss, Jena, Allemagne) avec un objectif Fluar 10x, à ouverture numérique 0,5. L'excitation optique a été réalisée avec un laser HeNe de 543 nm, et l'émission de fluorescence a été détectée au-dessus de 560 nm pour la rhodamine 6GO (Rho). Les images ont été analysées par le logiciel d'analyse d'images Release Version 4.0 SP2 pour calculer la distribution de fluorescence et l'intensité de fluorescence des tissus cicatriciels. Dans 10 × 10 fois le champ de vision, la taille et la distribution des valeurs de pixels devaient déterminer la plage de pénétration du 5-FU EG (étiqueté Rho) et par une méthode semi-quantitative.

Essai de perméabilité des éthosomes 5-FU dans le tissu cicatriciel humain

Des spécimens de cicatrice hypertrophique humaine du neuvième hôpital populaire de chirurgie plastique affilié à l'université Jiaotong de Shanghai proviennent de l'excision de cicatrice chez des patientes dans trois cas, toutes des femmes, âgées de 21 à 35 ans ; la cicatrice est située sur l'épaule et le dos; évolution de la cicatrice hypertrophique de 6 mois à 1 an ; intégrité du tissu cicatriciel; pas d'ulcération; pas de lésions infectieuses ; et la cicatrice la plus basse doit également être plus haute que la peau, et le patient n'a reçu aucun traitement depuis la maladie. L'anesthésie générale a été utilisée pour éliminer l'effet des anesthésiques locaux sur le tissu cicatriciel. Les échantillons obtenus ont été immédiatement retirés du tissu sous-cutané, protégés l'épiderme, transformés en une épaisseur de 4,0 mm, une surface de 3 cm  ×  3 cm. avec du papier d'aluminium et conservé au réfrigérateur à − 20 °C. Le tissu cicatriciel hypertrophique humain a été retiré et conservé dans un congélateur à - 20°C avant utilisation. Le tissu cicatriciel hypertrophique humain a été immergé dans du PBS à pH 7,4 à 25 °C pendant 2 h, et l'eau à la surface du tissu a été retirée doucement avec de la gaze sèche. Toutes les régions du tissu épidermique du tissu cicatriciel hypertrophique étaient CO₂ laser fractionné irradié. Les paramètres laser sont immédiatement suivis par le mode DeepFX, une densité d'énergie de 25 mj, une couverture de 20 %, une fréquence d'émission de 300 Hz, sur la 10e taille de spot et sans chevauchement. Tous les échantillons irradiés ont été collectés en utilisant la détection HPLC, pour déterminer la teneur en tissu cicatriciel de 5-FU. Les coupes histopathologiques sont immédiatement utilisées pour le dosage CLSM.

Modèle de cicatrice hypertrophique d'oreille de lapin

La méthode du modèle de cicatrice hypertrophique d'oreille de lapin a été brièvement décrite ci-dessous :12 lapins blancs de Nouvelle-Zélande, mâles, et pesant 2 kg (SLAC, Shanghai) ont été hébergés séparément pendant 2 semaines. Pour l'anesthésie du lapin, le lumianning a été mélangé avec 1,5 mg de kétamine pour 100 g de poids par injection intramusculaire. Toutes les blessures étaient entourées par le point central des oreilles du lapin. Chaque plaie ronde d'un diamètre de 1 cm était défectueuse, puis le périchondre a été retiré. Vingt-huit jours après la chirurgie, la croûte de l'oreille du lapin s'est détachée de la plaie et a complètement guéri, avec un diamètre visible d'environ 0,9 cm de cicatrices hypertrophiques. La cicatrice était rouge vif, des bosses étaient sur la peau autour de l'hyperplasie évidente, et la cicatrice était épaisse et dure.

Détermination des taux d'ouverture des micro-canaux

Différents moments après CO₂ traitement au laser fractionné dans un modèle de cicatrice hypertrophique d'oreille de lapin, la fluorescence rouge Rodanmin 6GO avec des éthosomes a été appliquée aux tissus cicatriciels. Trois heures plus tard, CLSM a été utilisé pour déterminer le taux d'ouverture du canal. Taux d'ouverture de canal =numéro de canal ouvert/(numéro de canal ouvert + numéro de canal fermé) × 100 %. Le pourcentage du taux d'ouverture du canal reflète l'effet du CO₂ efficacité de pénétration laser fractionnée.

Coloration H&E

Généralement, les lapins sont sacrifiés en utilisant 10 % de pentobarbital i.v. injection (dose de 5 fois la dose normale pour l'anesthésie, 35 mg/kg). Retirer immédiatement les échantillons et passer à l'étape de coloration H&E. La méthode de coloration à l'hématoxyline et à l'éosine est conforme au protocole de coloration H&E standard.

Indice d'élévation de la cicatrice et détermination de l'épaisseur relative

Vingt-huit jours après induction des cicatrices hypertrophiques de l'oreille de lapin, quatre groupes d'intervention sont réalisés :Groupe 5EL :gels enthosomiques encapsulés au 5-FU associé au CO₂ laser fractionné; Groupe 5E :les gels enthosomiques encapsulés au 5-FU; CO₂ groupe : CO₂ traitement laser fractionné; et groupe témoin. Nous avons défini A comme l'épaisseur de la partie la plus épaisse du tissu cicatriciel hypertrophique de l'oreille de lapin et B comme une épaisseur de 1,0 cm à partir de la partie la plus épaisse du tissu cicatriciel hypertrophique de l'oreille de lapin (près du point central). L'épaisseur relative est calculée par A/B. L'hypertrophie de la cicatrice dermique a été illustrée par le SEI. SEI =la zone de derme néoformé/la zone de derme non lésé. SEI> 1,5 représente une cicatrice hypertrophique.

Statistiques

Toutes les expériences ont été répétées trois fois. Les données sont présentées sous forme de moyenne  ± écart type (SD). L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de SPSS version 19.0 (SPSS Inc., Chicago, États-Unis). t de l'étudiant test a été utilisé pour calculer la significativité. *p une valeur < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative ; **p la valeur < 0,01 a été considérée comme statistiquement très significative ; ***p la valeur < 0,001 a été considérée comme statistiquement extrêmement significative, et ****p la valeur < 0,0001 a été considérée comme statistiquement hautement extrêmement significative.

Résultats

Évaluation de la qualité des éthosomes encapsulés avec du 5-florouracil (5E)

Tout d'abord, pour valider la qualité du gel éthosomique encapsulé au 5-florouracil (5E), la morphologie et les diamètres ont été détectés par observation au microscope électronique à transmission (MET). Les éthosomes en suspension ont formé un cercle complet de taille universelle ou une vésicule ovale-sphérique, qui mesure moins de 100 nm au microscope (Fig. 1a-b). Après la formulation du gel, les éthosomes sont restés intacts (Fig. 1c–d). À l'aide d'un analyseur de taille de particules laser, les éthosomes en suspension semblent avoir un diamètre de 87,72   ± 9,27 nm, et le PDI était de 0,10 ± 0,01. Pendant ce temps, la taille des particules des éthosomes était de 98,78 ± 10,88 nm, et le PDI était de 0,11 ± 0,02. Une comparaison statique montre que la taille des particules n'a pas de différence significative (p> 0,05). De plus, les deux PDI n'avaient pas de différence significative (p> 0,05). De plus, les données obtenues à partir d'un analyseur de taille de particules laser et d'un MET ont montré des résultats comparables. De plus, l'efficacité de piégeage (EE) a également été déterminée en utilisant la méthode d'ultracentrifugation (tableau 1). Les résultats ont montré que l'EE de la suspension éthosomique était de 10,47 ± 1,47 %, et l'EE du gel éthosomique était de 11,56 ± 1,12 % (n = 6), sans signification (p> 0,05). En conclusion, aucun changement de morphologie et de taille des particules n'a été trouvé dans l'état de suspension et l'état de gel des éthosomes.

Images au microscope électronique à transmission d'éthosomes 5-FU. Ethosomes de solutions (a et b ) et des éthosomes de gel (c et d )

CO₂ Le laser fractionné favorise la perméabilité 5E à travers les cicatrices hypertrophiques in vitro

Après évaluation de la qualité d'éthosomes encapsulés au 5-florouracil (5-FU), nous avons exploré sa perméabilité dans les cicatrices hypertrophiques humaines avec ou sans CO₂ laser fractionné in vitro. Du tissu cicatriciel hypertrophique humain a été irradié par du CO₂ laser fractionné, puis 5E a été appliqué uniformément. Les concentrations cumulées de 5-FU ont été déterminées à 1, 3, 6, 10, 16 et 24 h par HPLC ( 2). Nous avons comparé les concentrations cumulées de 5-FU de CO₂ laser fractionné combiné avec des éthosomes encapsulés avec le groupe 5-florouracil (5EL) et le groupe 5E à différents moments. À 1 h, la concentration cumulée de 5-FU du groupe 5EL était de 4,15  ± 2,22 μg/ml/cm ² , qui était supérieure à la concentration du groupe 5E (0,73 ± 0,33 μg/ml/cm ² , p < 0,001). Dans le traitement à long terme (24 h), concentration de perméation cumulée de 5-FU du groupe 5EL (107,61 ± 13,27 μg/ml/cm ² ) était également plus élevée que celle du groupe 5E (20,73 ± 3,77 μg/ml/cm ² , p < 0,0001). Aux points de temps antérieurs, 3, 6, 10 et 16 h, les groupes 5EL ont toujours montré une concentration de perméation cumulative de 5-FU plus élevée que les groupes 5E (Fig. 2a). De plus, la quantité de rétention de 5-FU dans le groupe 5EL était de 24,42 ± 4,37 μg/cm ² , qui est supérieur au groupe 5E (12,45 ± 1,64 μg/cm ² , p < 0,01, n = 6) (Fig. 2b). Ce résultat suggère que CO₂ l'irradiation laser fractionnée peut favoriser de manière significative le liposome contenu dans le 5-FU à travers le tissu cicatriciel hypertrophique humain et aider à la rétention du 5-FU dans le tissu cicatriciel hypertrophique in vitro.

CO₂ le laser fractionné favorise la perméabilité 5E à travers les cicatrices hypertrophiques in vitro. un Comparaison de la perméation des groupes 5E et 5EL dans une étude de 24 heures sur la cicatrice hypertrophique humaine in vitro. Les valeurs ont été exprimées en tant que moyenne  ± SD. n = 6. b La rétention cumulée du 5-FU dans la cicatrice hypertrophique in vitro après application pendant 24 h. n = 6. ***p la valeur < 0,001 a été considérée comme statistiquement extrêmement significative, ****p la valeur < 0,0001 a été considérée comme statistiquement hautement extrêmement significative

La profondeur et l'étendue de la pénétration du 5-FU ont été déterminées à l'aide du 5E marqué avec Rho pour évaluer l'effet d'amélioration de la pénétration du CO₂ laser fractionné in vitro. Un test de fluorescence a été utilisé pour indiquer l'intensité des groupes 5E et 5EL à 1, 6 et 24 h après le traitement au 5-FU (Fig. 3a). Les résultats ont montré qu'après 1 h de traitement 5EL, la fluorescence Rho était distribuée dans la couche peu profonde de l'épiderme et du derme, en particulier autour du CO₂ zone de gazéification fractionnée induite par laser. En revanche, sans CO₂ irradiation laser fractionnée, la distribution de la fluorescence Rho était limitée à la zone de l'épiderme dans le groupe 5E. Après 6 h de traitement dans le groupe 5EL, la fluorescence Rho s'étend au derme profond et présente une plus grande accumulation. Bien que la distribution de fluorescence du groupe 5E ait commencé à apparaître dans le derme, l'intensité de fluorescence a diminué progressivement du derme à l'épiderme. Après 24 h de traitement, la fluorescence de deux groupes était largement distribuée dans l'ensemble du tissu cutané, mais l'intensité de la fluorescence dans le groupe 5EL était significativement plus élevée. En outre, le logiciel d'analyse d'images Release Version 4.0 SP2 a été utilisé pour l'analyse quantitative afin de calculer l'intensité de fluorescence pour les deux groupes. Les résultats de l'analyse quantitative ont montré une augmentation significative de l'intensité de la fluorescence Rho dans le groupe 5EL par rapport au groupe 5E (1 h :59,61 ± 6,39 contre 6,39 ± 1,64, p < 0,0001 ; 6 h :163,32  ± 13,23 contre 49,89 ± 4,01, p < 0,0001 ; 24 h :270,36 ± 8,73vs. 148.25 ± 16.89, p < 0,0001) (Fig. 3b). En résumé, CO₂ l'irradiation laser fractionnée favorise considérablement la pénétration du 5E dans le tissu cicatriciel hypertrophique humain in vitro.

CO₂ le laser fractionné favorise la perméabilité à travers les cicatrices hypertrophiques in vitro. un La fluorescence rouge est marquée par les éthosomes qui ont pénétré les tissus cicatriciels hypertrophiques après 1, 6 et 24 h in vitro. b L'intensité de fluorescence des éthosomes marqués à la Rhodamine 6GO sur le tissu cicatriciel hypertrophique in vitro après 1, 6 et 24 h. ****p la valeur < 0,0001 a été considérée comme statistiquement hautement extrêmement significative

Durée du CO₂ Le laser fractionné améliore la pénétration du 5-FU in vivo

Pour obtenir des preuves plus substantielles de CO₂ effet laser fractionné, nous avons effectué une pénétration de 5-FU in vivo en utilisant un modèle de cicatrice hypertrophique de lapin. La configuration du modèle de cicatrice hypertrophique de lapin a été décrite comme méthode. Différents moments (3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 jours et 7 jours) après l'application de CO₂ Un traitement au laser fractionné, 5E ou 5EL a été effectué et la distribution de la fluorescence a été déterminée immédiatement par CLSM (Fig. 4). La fluorescence Rho était largement visible et largement distribuée dans la couche de derme des cicatrices hypertrophiques de l'oreille de lapin, qui étaient plus proches de la zone ablative (Fig. 4a). Ces résultats peuvent indiquer que Rho mélangé avec 5E s'infiltre principalement à travers le canal poreux après CO₂ irradiation laser fractionnée. La fluorescence peut être détectée dans la zone ablative entourant le tissu dermique après 6 h 5EL, même avec une petite zone de distribution (Fig. 4b). La zone de distribution de la fluorescence continue de rétrécir 12 h après le traitement médicamenteux, ce qui indique que les canaux microporeux sont progressivement fermés lorsque la plaie guérit (Fig. 4c). Après 24 h, 3 jours et 7 jours de traitement du CO₂ irradiation laser fractionnée, la fluorescence n'a pu être trouvée que dans les pores de la croûte autour des ouvertures et aucune pénétration dans le derme (Fig. 4d-f), ce qui suggère que le CO₂ l'effet de pénétration fractionnée du laser a disparu avec une réépithélialisation complète de l'épiderme. Nos données suggèrent que l'ouverture des micro-canaux joue un rôle essentiel dans la pénétration du médicament avec le traitement 5EL. Par la suite, nous avons calculé les taux d'ouverture des micro-canaux de 3 h, 6 h, 12 h, 24h, 3 jours et 7 jours après l'irradiation laser, respectivement. Aux points temporels de 3 et 6 h, les canaux microporeux étaient tous ouverts, ce qui indiquait que les taux d'ouverture des micro-canaux étaient de 100 %. Les taux d'ouverture des micro-canaux ont commencé à baisser à 90,59 % à 12 h et à 15,58 % à 24 h. En particulier, les canaux microporeux étaient tous fermés à 3 et 7 jours après le traitement 5EL. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le CO₂ le laser fractionné contrôle la pénétration du médicament dans le tissu cicatriciel hypertrophique du lapin in vivo.

CO₂ le laser fractionné favorise les taux d'ouverture des micro-canaux in vivo. La fluorescence rouge est marquée les éthosomes imprègnent les tissus cicatriciels hypertrophiques de l'oreille de lapin 0 h (a ), 6 h (b ), 12 h (c ), 24 h (j ), 3 jours (e ) et 7 jours (f ) après CO₂ traitement laser fractionné in vivo

L'effet thérapeutique du 5EL sur la cicatrice hypertrophique in vivo

Pour comprendre en profondeur le traitement 5EL, nous avons effectué la détermination de l'épaisseur relative de la cicatrice hypertrophique de l'oreille de lapin. Après la configuration du modèle de cicatrice hypertrophique d'oreille de lapin, les valeurs d'épaisseur relative avant et après le traitement 5EL ont été calculées. Aucune différence significative n'a été trouvée dans les groupes avant le traitement. Cependant, l'épaisseur relative du groupe 5EL était de 1,27 ± 0,15, ce qui était significativement inférieur à celui du groupe 5E (1,52 ± 0,10, p < 0,05) et non traité (1,61 ± 0,15, p < 0,0001) (Fig. 5). Fait intéressant, il n'y a eu aucun changement significatif entre le CO₂ groupe de traitement au laser uniquement et le groupe 5EL. Ces données suggèrent que le CO₂ le laser fractionné joue un rôle dominant dans la guérison de la cicatrice hypertrophique de l'oreille de lapin in vivo.

Comparaison de l'épaisseur relative des cicatrices hypertrophiques du lapin avant et après l'application de différents traitements. 5EL :les gels enthosomiques encapsulés au 5-FU associé au CO₂ laser fractionné, n = 14 ; CO₂ :CO₂ laser fractionnaire uniquement, n = 12 ; Groupe 5E :les gels enthosomiques encapsulés au 5-FU, n = 14 ; champ :vide, n = 16. *p la valeur < 0,001 a été considérée comme significative, ****p la valeur < 0,0001 a été considérée comme statistiquement hautement extrêmement significative

Nous avons également comparé la morphologie de la cicatrice hypertrophique de l'oreille de lapin pour déterminer la différence d'utilisation du CO₂ laser fractionné. Dans le groupe 5EL, les cicatrices hypertrophiques se sont aplaties et la couleur est devenue significativement rose clair (Fig. 6a–b). En CO₂ groupe de traitement au laser fractionné uniquement, l'épaisseur de la cicatrice hypertrophique a diminué dans une certaine mesure et sa couleur est devenue rouge pâle (Fig. 6c–d). Dans le groupe 5E, l'épaisseur de la cicatrice hypertrophique a légèrement diminué mais la couleur est restée rouge vif (Fig. 6e–f). Enfin, il n'y avait pas de changement significatif dans le groupe non traité par rapport à avant le traitement (Fig. 6g-h). Ensuite, la coloration H&E a été utilisée pour l'analyse pathologique en 7 jours après le traitement pour ces quatre groupes sur le tissu cicatriciel hypertrophique des oreilles de lapin (Fig. 7). Le groupe 5EL et CO₂ Seuls les groupes de traitement au laser fractionné ont montré une diminution de l'épaisseur de la couche dermique des cicatrices hypertrophiques et une croûte en forme de pointe avec de rares fibres de collagène du derme superficiel en forme nodulaire ou en forme de spirale (Fig. 7a-b). Un grand nombre de pénétration des fibres de collagène dermiques, une disposition désordonnée des fibres de collagène et un derme superficiel nodulaire ou en forme de spirale ont été trouvés dans le groupe 5E et le groupe non traité (Fig. 7c-d). Une autre méthode d'évaluation importante pour la cicatrice hypertrophique est l'indice d'élévation de la cicatrice (SEI). Similaire avec le modèle d'épaisseur relative, SEI du groupe 5EL (1,16 ± 0,08) et CO₂ Le groupe de traitement au laser fractionné seul (1,22 ± 0,10) était significativement diminué par rapport au groupe 5E (1,32 ± 0,13) et au groupe non traité (1,49 ± 0,08) (Fig. 8). Ensemble, l'analyse de la morphologie et les données de calcul du SEI montrent le CO₂ Le laser fractionné fonctionne sur la cicatrisation de la cicatrice hypertrophique de l'oreille de lapin in vivo.

Imagerie photographique de cicatrices hypertrophiques de lapin avant et après application de différents traitements pendant 7 jours. Le groupe 5EL :les gels enthosomiques encapsulés au 5-FU associé au CO₂ laser fractionné, avant (a ) et après (b ) traitement pendant 7 jours ; CO₂ groupe : CO₂ laser fractionné, avant (c ) et après (d )traitement pendant 7 jours ; 5E groupe B :les gels enthosomiques encapsulés au 5-FU, avant (e ) et après (f ) traitement pendant 7 jours ; et groupe vide :vide, avant (g ) et après (h ) traitement pendant 7 jours

Analyse histologique H&E de cicatrices hypertrophiques de lapin après application de différents traitements pendant 7 jours. Le groupe 5EL :les gels enthosomiques encapsulés au 5-FU associé au CO₂ laser fractionné (a ); CO₂ groupe : CO₂ traitement laser fractionné (b ); Groupe 5E :les gels enthosomiques encapsulés au 5-FU (c ); et groupe vide :vide (d ). Grossissements d'origine :× 40

Comparaison du SEI de cicatrices hypertrophiques de lapin après application de différents traitements pendant 7 jours. 5EL :les gels enthosomiques encapsulés au 5-FU associé au CO₂ laser fractionné, n = 14 ; CO₂ :CO₂ laser fractionné, n = 12 ; 5E :les gels enthosomiques encapsulés au 5-FU, n = 14 ; champ :vide, n = 16. ***p la valeur < 0,001 a été considérée comme statistiquement extrêmement significative et ****p la valeur < 0,0001 a été considérée comme statistiquement hautement extrêmement significative

Discussion

Le traitement médicamenteux est la principale approche thérapeutique, principalement topique ou en injections locales, pour le traitement non chirurgical des cicatrices hypertrophiques. En raison des effets secondaires de divers médicaments, l'injection locale est souvent limitée à de faibles doses et ne permet donc qu'une petite plage de traitement. De plus, en raison de la courte demi-vie des médicaments, une concentration élevée persistante dans la cicatrice nécessite des injections répétées [6, 30, 31]. De plus, du fait que le tissu cicatriciel est très concentré et qu'une douleur intense lors des injections est souvent ressentie, les patients n'acceptent souvent pas le traitement. Although external drug usage having advantage of being convenient, painless, with long-term stability, low side effects, avoiding to affection of the gastrointestinal environment [7, 8], there are several limitations. First of all, topical and injected drugs availability is limited by special pathological scar tissue structure, which presents with a thickening of the stratum corneum and hyperplasia of the dermis, which hinders the penetration of the drug and achieving an effective therapeutic concentration. Recent reports have proven this and described how external use of drugs inefficiently penetrates the scar tissue [4, 9]. Ethosomes, proposed by Touitou et al. [10] in 2000 as a transdermal drug carrier, have been widely reported [11, 12, 32]. In this study, we improved the ethosomes preparation process to nano-level (particle size 70~90 nm). This change of a new nanoscale dimensions and the spatial conformation of the ethosomes allow them to penetrate into the scar tissue through a narrowly tightly connected cell gap not only due to the small size, but also by the similarity to the cell membrane of scar tissue cells. Based on such penetration mechanisms, ethosomes become a convenient transdermal drug carrier [14, 33, 34]. However, the anti-scar drug 5-FU encapsulated with ethosomes is mainly concentrated in the epidermis and dermis, which is not conducive to fibroblasts in deeper layers of the dermis. Therefore, our purpose is to explore a method that would allow to increase the penetration of drugs and would promote the uniform dispersion of drugs in scar tissue.

So far, commonly used methods to promote the penetration are divided into two categories:the promotion of chemical substances and physical methods to enhance permeability. The physical enhancement techniques include electroporation, iontophoresis, laser, microdermabrasion, microneedle, pressure, radiofrequency induction, and sonography [35]. There are many different types of lasers that have been shown to promote percutaneous administration, and ablative fractional lasers become the most popular laser in recent years for promoting drug penetration into the skin [20]. Ablative fractional laser can not only extremely reduce drug dosage, but also be conducive to drug penetration into deep skin and achieve high local concentrations to obtain a therapeutic effect. CO₂ fractional laser, Erbium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Er:YAG) fractional laser, and Erbium-doped Yttrium Scandiu Gallium Garnet (Er:YSGG) fractional laser can produce ablative zone or microporous channels on the surface of the skin. Compared with Er:YAG fractional laser (2940 nm wavelength) and Er:YSGG fractional laser (2790 nm wavelength), CO₂ fractional laser (10,600 nm wavelength) has lower water absorption coefficient, larger thermal damage, and greater destruction effect of stratum corneum of the epidermis, which is more conducive to promote penetration effect [36].

In this study, 5-FU retention in the 5EL group (24.42 ± 4.37 μg / cm ² ) was significantly higher than in the 5E group (12.45 ± 1.64 μg/cm ² ) in scar tissue of 24 h treatment in vitro. Additionally, in Rho-labeled assay, 5EL group has shown higher fluorescence intensity than 5E group at 1-, 6-, and 24-h treatment time points. Image analysis showed that fluorescence can be found distributed in the gasification zone and surrounding dermal tissue matrix after 1-h CO₂ laser treatment in the 5EL group, and the fluorescence in 5E group is only distributed in the epidermis. After 6- and 24-h treatment, diffuse fluorescence range is wider and fluorescence intensity is higher in the 5EL group than in the 5E group. CO₂ fractional laser-induced gasification zone provided an effective way for drug penetration through the skin scar tissue, enlarge range of dermis penetration depth, and retention content in scar tissue. There are three different forms of thermal effect damage by CO₂ fractional laser acting on the skin or scar tissue, from center to outliner, the gasification zone, thermal coagulation necrosis zone, and thermal denaturation zone [37]. Fluorescence data showed that Rho fluorescence was distributed from more concentrated gasification zone to diffused tissue, suggesting that there is no effect for permeation of drugs in thermal coagulation necrosis zone and thermal denaturation zone, which also confirmed the feasibility of CO₂ fractional laser for the promotion of topical anti-scarring drug penetration. Together, CO₂ fractional laser is conducive to more anti-scarring drugs 5-FU retention in scar tissue and achieve high drug concentration required to strengthen the anti-scarring effect.

The duration of CO₂ fractional laser enhancing 5E was evaluated by CLSM on rabbit ear hypertrophic scar in vivo. The opening rates of microporous channels for drug permeation were 100% (0 h), 100% (6 h), 90.59% (12 h), and decreased to 15.58% (24 h) after CO₂ fractional laser treatment of hypertrophic scar. Moreover, microporous channel opening rates dropped to zero on 3 and 7 days, and the drug can no longer penetrate into the skin through these channels. These results were consistent with that of epidermal re-epithelialization after ablative fractional laser irradiation, which is the skin wound around the keratinocytes to the wound defect migration and proliferation, covering the wound to form a complete layer of cells formed by the epidermis. When the dermal layer of skin was wound, the repair process will immediately start and quickly rebuild the skin barrier [38, 39]. The whole skin tissue trauma repair process can be divided into four continuous and overlapping steps:coagulation, inflammation, re-epithelialization, and remodeling [40]. Human skin after ablation of the fractional laser irradiation injury area (including the gasification area and coagulation necrosis area) complete epidermal re-epithelialization in 2 to 3 days and dermal remodeling for at least 4 weeks [41]. Thus, although the lesion in the dermis does not heal within 24 h after the CO₂ laser treatment, the epidermis has completed the complex epithelization, including the formation of the stratum corneum, where the topical drug could not penetrate through channels. Taken together, epidermis, especially the stratum corneum, is still the main barrier for drug penetration through the skin.

In addition, our CLSM data showed both in in vitro human hypertrophic scar skin and in vivo rabbit ear hypertrophic scar skin, Rho-labeled 5E can penetrate the necrotic coagulation layer and the formation of crust on the surface after the CO₂ fractional laser irradiation. It suggested that the skin under the crust but not the coagulation necrotic layer and crust tissue can impede the penetration of drug. Therefore, 24 h is the critical time-point for the effect of CO₂ fractional laser on the penetration effect of hypertrophic scar in rabbits.

It has been reported that the clinical application of exfoliative fractional laser is an effective method to treat various skin diseases (such as solar keratosis, basal cell carcinoma, Bowen’s disease, etc.) [25,26,27,28]. However, the clinical efficacy of CO₂ fractional laser in combination with drugs has not been explored in the treatment of hypertrophic scars [42, 43]; in particular, there are no reports of combined CO₂ fractional laser (physical technique) with anti-scar drug nano-level ethosomes (chemical substances promoting scar penetration) for the treatment of hypertrophic scars. Using in vivo study, we performed a rabbit hypertrophic scar model for validation of CO₂ fractional laser protocol. On the seventh day after intervention, the relative thickness of the four groups of hypertrophic scar was measured:experimental group (CO₂ fractional laser combined with 5-FU EG):1.27 ± 0.15 2 fractional laser irradiation only):1.35 ± 0.09 2 fractional laser had a leading role in the intervention of hypertrophic scars. This finding was mainly manifested in three aspects. First of all, CO₂ fractional laser generated micro-channels for the promotion of scar drugs penetration. Secondly, CO₂ fractional laser itself could help in hypertrophic scar tissue’s collagen remodeling. Thirdly, 5E itself could directly influence hypertrophic scars. From H&E staining data, we found that processes of collagen fiber bundle remodeling, from disordered, different-direction collagen fibers into a consistent, paralleled direction collagen beam take place. In the experimental group of rabbit ear hypertrophic scar, there was a significant reduction in scar thickness, but also color change of hypertrophic scar, from bright red to light red, which may be induced by vascular proliferation of the scar tissue.

The toxicity of the ethosomes should be a big concern in this study. Nevertheless, after reviewing literature, there are no results exhibiting the toxicity of ethosomes in vitro or in vivo study [44,45,46]. The permeability mechanism of ethosomes is mainly as follows:high concentration of ethosomes, the flexibility, and fluidity of ethanol liposome membrane, makes ethosomes deform in the process of transmission, and enhances the permeability in scar tissue [47].

Although the difference between the experiment group and control group A was not statistically significant, the relative thickness and SEI of the experimental group was smaller than that in the control group A. Both groups were treated with CO₂ fractional laser, with or without 5E. This finding suggests that CO₂ fractional laser may have the dominant role, which overtakes the minor effect of 5E drug in the final anti-scar effect.

Conclusion

CO₂ fractional laser can rapidly and significantly promote 5-fluorouracil encapsulated ethosomes’ permeability through hypertrophic scars in vitro. CO₂ fractional laser is a potentially efficient method of promoting drug permeation in hypertrophic scars’ treatment. Our hypertrophic scar model (rabbit) showed that CO₂ fractional laser combined with external-loaded 5-fluorouracil encapsulated ethosomes can effectively cure hypertrophic scars. Also, CO₂ fractional laser itself can facilitate collagen remodeling in hypertrophic scar of rabbit ears. CO₂ fractional laser can significantly promote the permeation of 5-fluorouracil encapsulated ethosomes, but the effect begins to relinquish 24 h after CO₂ fractional laser irradiation, which indicates that 24 h is a critical period.