Nanobulles de chitosan biocompatibles pour l'administration ciblée de doxorubicine par ultrasons

Contexte

La chimiothérapie est actuellement utilisée comme modalité de traitement primaire pour les néoplasmes malins et améliore considérablement le taux de survie des patients atteints de cancer. Néanmoins, l'efficacité des médicaments chimiothérapeutiques est limitée par leurs effets secondaires indésirables, tels que la toxicité systémique [1]. L'administration locale de médicaments chimiothérapeutiques peut réduire leur toxicité en augmentant leur dose thérapeutique aux sites ciblés et en diminuant les taux plasmatiques de médicaments en circulation. En raison de son caractère non invasif et de sa capacité de ciblage, la destruction des nano/microbulles ciblées par ultrasons (UTN/MD) a été largement utilisée comme système d'administration de médicaments efficace.

Par rapport aux microbulles traditionnelles, les particules nanométriques peuvent traverser la paroi capillaire plus facilement et peuvent donc être acheminées vers le site cible plus efficacement. Les NB ont été utilisés dans l'étude de thérapies ciblées, comme les NB chargés de 5-fluorouracile testés pour une utilisation dans le carcinome hépatocellulaire [2]. Shen et al. ont récemment utilisé des NB à médiation par ultrasons pour administrer du resvératrol aux cellules du noyau pulpeux [3], et les NB ont également été utilisés dans le traitement du cancer du sein [4].

Les nanobulles (NB) utilisées dans UTN/MD sont généralement composées d'un noyau de gaz et d'une enveloppe stabilisée. Des lipides, des tensioactifs, des polymères ou d'autres matériaux entrent dans la composition de l'enveloppe. Différents types de NB ont été réalisés dans des études antérieures. Cependant, de nombreux produits chimiques utilisés pour former des nanoparticules ou des nanoparticules représentent une menace potentielle pour le corps humain. Par conséquent, le transport de certaines nanoparticules a apporté une efficacité thérapeutique et une toxicité insatisfaisantes dans les tissus et cellules normaux [5]. Les agents chimiques, tels que le Tween 80 et le glutaraldéhyde, ont une toxicité élevée et présentent des risques mutagènes, limitant ainsi leurs applications cliniques [6, 7]. Le PLA, un autre matériau utilisé dans les NB, peut provoquer des effets secondaires cliniques dans certains cas [8]. Dans ce contexte, il est important de considérer la biocompatibilité et la sécurité des matériaux utilisés pour assembler les NB.

Le polysaccharide chitosan a attiré l'attention en raison de son origine naturelle, sa biodégradabilité, sa biocompatibilité, son immunogénicité exceptionnellement faible, son activité antibactérienne et son aspect pratique [9, 10]. Le chitosan est le dérivé N-désacétylé de la chitine, qui est l'un des matériaux biologiques les plus abondants sur terre [11]. De plus, une étude précédente a montré qu'en présence d'IFN-γ, les oligomères de chitosane hydrosolubles peuvent activer les macrophages pour tuer les cellules cancéreuses [12]. Par conséquent, le chitosane lui-même a des effets antitumoraux directs et indirects, ce qui le rend plus approprié comme vecteur de médicaments anticancéreux. Les autres matériaux que nous avons utilisés dans nos NB étaient la lécithine et l'acide palmitique, qui sont d'excellents candidats pour une utilisation dans les NB [13]. L'acide palmitique est l'un des acides gras saturés les plus abondants à 14, 16 et 18 carbones et est normalement synthétisé par l'acétyl-CoA et possède une faible toxicité et une biocompatibilité élevée [14]. La lécithine est un tensioactif natif principalement dérivé du soja [15]. Des recherches antérieures ont montré que la lécithine de soja présente des avantages pour la santé en raison de ses propriétés hypocholestérolémiantes. Par exemple, la lécithine de soja est utile pour réduire le risque de maladies cardiovasculaires, tandis que le soja purifié pourrait être utilisé pour encapsuler la nisine [16, 17]. Dans cette étude, nous avons utilisé les matériaux ci-dessus pour fabriquer des NB biocompatibles. Avec l'aide d'ultrasons pour l'administration, le chlorhydrate de doxorubicine (DOX) a été utilisé comme médicament modèle pour tester la capacité de charge médicamenteuse des nouveaux NB de chitosane biogénique, qui ont été fonctionnalisés avant l'évaluation dans la Michigan Cancer Foundation-7 (MCF- 7) les cellules cancéreuses du sein. De plus, les effets antitumoraux des DOX-NB ont également été évalués après UTN/MD.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Les NB décrits dans cette étude ont été construits en utilisant du perfluoropropane (C3F8, R&D Center for Specialty Gases at the Research Institute of Physical and Chemical Engineering of Nuclear Industry, Beijing, China) comme noyau et un revêtement de chitosan comme enveloppe. De plus, Epikuron 200 (lécithine de soja contenant 95% de dipalmitoylphosphatidylcholine, Lukas Meyer, Hambourg, Allemagne), éthanol (qualité analytique, Hushi, Chine), chlorhydrate de doxorubicine (Sigma-Aldrich, Missouri, USA), chitosan (100~300 kD , Bozhihuili, Qingdao, Chine) et l'acide palmitique (JINDU, Shanghai, Chine) ont également été utilisés dans cette étude. Pluronic F68 a été acheté chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Ligne cellulaire

La lignée cellulaire de carcinome du sein humain MCF-7 a été obtenue auprès de l'American Type Culture Collection (Rockville, MD, États-Unis) et cultivée dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS) (Gibco, Carlsbad , Californie, États-Unis). Les cellules ont été cultivées sous 37 °C, 5% CO₂ , et 95% d'humidité. Les cellules en phase de croissance logarithmique ont été récoltées pour des expériences.

Préparation des NB de chitosan chargés DOX

Nous avons fait des NB selon les méthodes décrites précédemment [18, 19]. Du chitosane de poids moléculaire moyen (100~300 kD) a été utilisé pour les coques des DOX-NB, et du perfluoropropane a été utilisé pour le noyau. Pour préparer la solution de DOX-chitosane, la dose appropriée de DOX a été dissoute dans de l'eau ultrapure et 2 ml de solution de DOX (1 mg/mL) ont été ajoutés à la solution d'eau de chitosane en mélangeant avec un mélangeur vortex pendant 5 s. La solution de DOX-chitosane a été incubée pendant 1h à 65°C. Séparément, une solution d'éthanol contenant Epikuron 200 a été ajoutée à une solution aqueuse d'acide palmitique. Après avoir ajouté le volume approprié d'eau ultrapure, le système acide palmitique-Epikuron 200 a été homogénéisé à l'aide d'un mélangeur vortex. Par la suite, le système acide palmitique-Epikuron 200 a été divisé en tubes Eppendorf de 1,5 ml (tubes EP) et l'air dans le tube a été remplacé par du perfluoropropane à l'aide d'une seringue de 10 ml avec une longue aiguille fine. Chaque tube a oscillé pendant 120 s dans un oscillateur mécanique (mélangeur Ag et Hg, Xi'an, Chine). Ensuite, tout le liquide dans les tubes EP de 1,5 ml a été versé dans un tube à centrifuger et combiné avec la solution de DOX-chitosane dans un bain de glace. Par la suite, le mélange a été incubé pendant 30 min à - 4 °C. Ensuite, une solution aqueuse de Pluronic F68 (0,01%, w /w ), un agent stabilisant, a été ajouté au mélange ci-dessus sous agitation. Une étape de purification par dialyse (tube à centrifuger ultrafiltration, Millipore, 30 kDa) a ensuite été réalisée pour éliminer toute DOX libre résiduelle.

Observation des propriétés physiques des NB

La suspension de DOX-NBs a été diluée en ajoutant une quantité appropriée de PBS (solution saline tamponnée au phosphate). La forme des DOX-NB a ensuite été observée et imagée sous un microscope à fluorescence équipé d'un objectif à immersion dans l'huile × 100 (OLYMPUS BX41, Olympus Corporation, Japon). Les images de fluorescence ont été évaluées à l'aide d'un microscope à fluorescence (Nikon TE2000-S, Japon). La morphologie des DOX-NB a également été observée par microscopie électronique à transmission (MET) (JEOL, Tokyo, Japon). Les suspensions aqueuses de nanobulles diluées ont été pulvérisées sur une grille de cuivre revêtue de Formvar et colorées avec 4% w /v acétate d'uranyle pendant 10 min. Ensuite, les échantillons ont été visualisés et imagés à l'aide de MET. La taille et le potentiel zêta de surface des DOX-NB ont été mesurés par un analyseur de taille de particules et de potentiel zêta Delsa Nano C (Beckmann Instruments, USA). Toutes les mesures ont été effectuées en triple pour calculer la valeur moyenne.

Stabilité des DOX-NB

La taille et la morphologie des DOX-NB ont été mesurées au cours du temps pour observer la stabilité de ces nanobulles. Certaines parties des DOX-NB ont été conservées au réfrigérateur à 4 °C pendant 24 h ou 48 h. Les autres ont été conservés à température ambiante pendant 6 h. La stabilité des nanobulles à 25 °C a également été étudiée dans du sérum humain lyophilisé (Seronorm™ Human, Norvège). A cet effet, 1µml de la suspension aqueuse de DOX-NBs a été ajouté à 1µml de sérum et incubé pendant 6µh à 25°C. Ensuite, tous les DOX-NB ont été mesurés par analyse morphologique en utilisant la microscopie optique pour évaluer l'intégrité de leurs structures. La taille des NB a été mesurée par un analyseur de taille de particules et de potentiel zêta Delsa Nano C (Beckmann Instruments, USA).

Détermination de la capacité de chargement DOX des NB

Une courbe standard de concentration de DOX a été préparée à l'aide de dilutions en série de DOX à des concentrations de 0,025, 0,05, 0,1 et 0,2 µmg/mL et mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre UV (UV-2450, SHIMADZU). Par la suite, l'efficacité de chargement de DOX a été évaluée à 480  nm en utilisant des NB vierges comme contrôle, et la concentration de DOX dans les DOX-NB a été calculée sur la base de la courbe standard établie ci-dessus. Pour éviter la photodégradation de la DOX pendant le processus de purification et de mesure, toutes les procédures ont été effectuées à l'abri de la lumière. Par la suite, la suspension de DOX-NBs a été lyophilisée pendant 1,5 jour avec un lyophilisateur à - 55 °C et sous 0,080 mbar [20]. Les DOX-NB lyophilisés ont ensuite été pesés pour calculer la capacité de charge de médicament en termes d'efficacité d'encapsulation de médicament (EE) comme suit :EE = A /B × 100 %, où A est la quantité de DOX chargée dans les NB, et B est la quantité initiale de DOX dans la solution. Les expériences ont été répétées trois fois.

Libération DOX par ultrasons

La cinétique de libération in vitro de la DOX à partir des DOX-NB a été déterminée en présence et en l'absence d'ultrasons (US) par la technique du sac de dialyse à 37°C. Les DOX-NB ont été enfermés dans une membrane de dialyse (Spectra/Por, seuil de 12 000 à 14 000 Da), qui a été placée dans un conteneur de 100 ml de PBS sous agitation à 100 rpm. Le groupe américain a été soniqué par US (VCX400, Sonics and Materials, USA; densité de puissance, 1,0 W/cm2; fréquence, 20 kHz) pendant 40 s avant le test [21]. La libération de DOX a été mesurée jusqu'à 24 h, en retirant 1 ml à chaque heure fixe et en remplaçant par 1 ml de PBS frais. Les concentrations de DOX dans le tampon externe ont été mesurées à 480 nm par un spectrophotomètre UV. Les expériences de libération ont été réalisées en triple.

Imagerie échographique in vitro (courbe temps-intensité)

L'imagerie US et la stabilité des DOX-NB sous échographie ont été vérifiées in vitro sur un système de scanner à ultrasons clinique (LOGIQ E9; GE, USA). L'expérience a été menée avec des fréquences, des puissances de transmission et des durées d'exposition aux ultrasons spécifiques. En utilisant une méthode précédemment développée [19] (Fig. 5a), les DOX-NB ont obtenu une amélioration par ultrasons. La stabilité de l'imagerie ultrasonore des DOX-NB a été évaluée après leur exposition à un stimulus ultrasonore avec un indice mécanique (MI) de 0,10 et une profondeur d'imagerie de 4,5 cm. Toutes les images américaines ont été analysées hors ligne avec Image J. Par la suite, une analyse d'image a été effectuée à l'aide du logiciel intégré de LOGIQ E9 pour calculer les valeurs d'échelle de gris des échantillons. Pour chacun des clips de 60 s, qui ont été obtenus de 0 à 15 min, une correction de mouvement a d'abord été effectuée pour chaque image et la valeur en décibels a été obtenue. Chaque valeur en décibels a été tracée sur une courbe temps-intensité pour refléter les changements dans l'amélioration du contraste avant et après l'irradiation par ultrasons. L'intensité maximale et la durée du rehaussement ont été exprimées par une courbe temps-intensité. Au cours de l'analyse, les valeurs de rétrodiffusion corrigées de la distance ont été obtenues en soustrayant les signaux de fond correspondant à un échantillon d'eau.

Test de cytotoxicité pour les NB vides

La biosécurité des NB de chitosane vides a été testée à l'aide d'un kit de dosage Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Sigma-Aldrich, USA). Avant le test, les cellules MCF-7 ont été étalées à une densité de 2 × 10 ³ cellules/puits dans des plaques à 96 puits. Les cellules ont été soumises à un traitement par des concentrations variables de chitosane NB et des conditions d'ultrasons. La biosécurité des NB de chitosane a été évaluée en incubant des cellules MCF-7 à des concentrations en série de NB de 0 à 30 %. Un équipement de stimulation par ultrasons à faible intensité (US10, Cosmogamma Corporation, Italie) a été utilisé pour effectuer une stimulation par ultrasons à une fréquence fixe de 1  MHz, en utilisant un cycle de service de 70 % et une fréquence d'impulsions de 100  Hz. Chaque groupe a été traité avec un temps d'irradiation différent et une intensité sonore différente. Pour des raisons de sécurité, les ultrasons ont été utilisés à une intensité de 0,5 W/cm ² ou 1,0 W/cm ² avec une durée d'impulsion de 30 ou 60  s (tableau 1). La profondeur, la fréquence et d'autres conditions échographiques ont été maintenues cohérentes pendant toutes les expériences échographiques [22]. Après les traitements, les cellules ont été cultivées dans les plaques à 96 puits pendant 24h supplémentaires. Par la suite, un milieu d'entretien contenant 1% de FCS a été utilisé pour remplacer le milieu contenant le médicament, et une solution de CCK-8 a été ajoutée dans les plaques selon les instructions du fabricant. Après une incubation supplémentaire de 2,5 h à 37 °C, l'absorbance spectrophotométrique dans chaque puits a été déterminée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Bio-Rad, USA) à une longueur d'onde de 450 nm.

Captation intracellulaire de médicaments in vitro

L'absorption intracellulaire de DOX a été déterminée par cytométrie de flux (Beckman Coulter, Miami, USA). En bref, les cellules MCF-7 ont été étalées dans des plaques à six puits à une densité de 2,5 × 10 ⁵ cellules/puits dans du milieu DMEM additionné de 10 % de FBS. Après une nuit de culture, le milieu a été remplacé par un milieu de culture contenant des DOX-NB ou des DOX libres à la même concentration, et les cellules ont été traitées avec ou sans ultrasons. Compte tenu de la viabilité cellulaire et de l'efficacité élevée de la sonoporation, une concentration de DOX-NBs de 20 % a été choisie pour les expériences suivantes, tandis que le traitement par ultrasons a été réglé à une intensité de 0,5  W/cm ² avec une durée d'impulsion de 30 ou 60 s. Ensuite, après 1 h d'incubation, le milieu cellulaire a été retiré et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS frais pour éliminer les DOX-NB ou DOX libres et non liés. Les cellules ont ensuite été collectées par centrifugation (5 min, 1000 rpm), remises en suspension dans 500 μL de PBS avant l'absorption intracellulaire de DOX, et analysées sur un cytomètre en flux FACSCalibur. Au cours de l'analyse, la porte a été arbitrairement définie pour la détection de la fluorescence rouge et 10 000 cellules ont été analysées pour chaque échantillon.

Les effets des DOX-NB sur les cellules MCF-7 in vitro

Des dosages de CCK-8 et une cytométrie en flux ont été utilisés pour effectuer une évaluation quantitative de la prolifération et de l'apoptose des cellules MCF-7 après l'absorption de DOX. En bref, les cellules MCF-7 ont été étalées et incubées dans des plaques à 96 puits ou des plaques à 6 puits et traitées en utilisant les procédures décrites ci-dessus. Pour le test de prolifération, les cellules traitées ont été incubées à 37°C pendant 24h, suivies d'une coloration CCK-8 pendant 2h et d'une lecture d'absorbance sur un lecteur de microplaque. L'apoptose induite par la DOX a été déterminée par un dosage d'Annexine V-APC comme suit :après un traitement de six heures, les cellules ont été colorées en ajoutant 0,5 μL V-APC (Sungene Biotech, Tianjin, Chine) dans chaque puits, et analyse par cytométrie de flux (Beckman, Coulter, Fullerton, CA, USA) a été utilisé pour quantifier les cellules apoptotiques.

Analyse statistique

Toutes les expériences ont été réalisées en triple et les données ont été exprimées en moyenne. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de SPSS version 18.0. Un p la valeur < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Caractérisation physico-chimique des DOX-NB

Les NB préparés présentaient une morphologie sphérique. Sous un microscope inversé, l'imagerie des NB a montré des contours sphériques discrets et intacts (Fig. 1a), ce qui était cohérent avec l'imagerie au microscope à fluorescence des DOX-NB (Fig. 1b). Une image MET représentative de la solution de DOX-NBs est illustrée à la Fig. 1c. Les propriétés physiques des NB ont été déterminées par la taille des particules et l'analyseur de potentiel zêta. Comme le montre la figure 2, le diamètre moyen des DOX-NB était de 641  nm, P.I. 0,256. Le potentiel zêta des DOX-NB était de + 67,12 ± 2,1 mV, ce qui était suffisamment élevé pour les obliger à se repousser, aidant à prévenir l'agrégation de NB et soutenant leur stabilité à long terme.

NB observés au microscope optique (grossissement × 1000) (a ) et l'image au microscope à fluorescence des NB chargés de DOX (b ) et image TEM des NB chargés de DOX (c )

La distribution de la taille des NB chargés DOX

Stabilité et efficacité de chargement de médicaments des DOX-NB

Les DOX-NB étaient stables en suspension pendant 48 h à 4 °C. Après avoir été conservées à température ambiante, la taille des DOX-NB s'est avérée légèrement plus grande à la fois dans le PBS et le sérum humain (Fig. 3). La capacité de charge finale des DOX-NB était de 64,12  mg DOX/g DOX-NB, ce qui correspondait à un EE de 54,18 %.

Images optiques des DOX-NB a à température ambiante, b après 6 h à 25°C en PBS, et c après 6 h à 25°C dans le sérum

Libération DOX par les DOX-NB In Vitro

La figure 4 montre le profil de libération in vitro de DOX à partir de DOX-NB dans du PBS en présence ou en l'absence d'un traitement américain pour évaluer les effets de la sonication sur la libération de DOX. La quantité de DOX libérée par les DOX-NB était significativement différente entre le groupe américain et le groupe non américain. Après 5 h, les DOX-NB du groupe américain avaient libéré 46,45 % de la DOX encapsulée, contre seulement 9,3 % dans le groupe non américain. Le groupe non américain n'a libéré que 19,4% de DOX après 24h. En revanche, près de 80 % des DOX ont été rejetés dans le groupe américain. Les résultats suggèrent que l'irradiation américaine peut favoriser la libération de DOX à partir de DOX-NB en raison d'un effet de cavitation.

Libération de doxorubicine par les DOX-NB avec ou sans irradiation ultrasonore (2 kHz, 1,0 W/cm ² )

Stabilité aux ultrasons des DOX-NB

Les DOX-NB ont obtenu une amélioration des ultrasons in vitro, comme le montre la figure 5b. L'atténuation de la valeur des décibels ultrasonores est illustrée à la Fig. 5c. Les résultats ont montré que les DOX-NB ont obtenu une bonne amélioration des ultrasons, et la courbe lisse démontre que le processus d'atténuation des ultrasons dans les suspensions de NB était relativement lent. Cela indique que le signal ultrasonore des DOX-NB peut être suffisamment stable pour l'imagerie et l'amélioration du contraste.

Une illustration schématique du montage expérimental in vitro (a ), images échographiques de NB chargés de DOX (0, 5, 10 et 15 min) à l'aide d'une sonde de 9,0 MHz (b ) et mesures d'intensité de temps des NB à contraste ultrasonique et DOX (c )

Biosécurité des NB vides

La viabilité des cellules MCF-7 a été mesurée par culture avec des NB vides (sans DOX) pendant 24h après l'échographie. Comme le montre la figure 6, les NB vides n'ont pas affecté de manière significative la viabilité cellulaire sous certaines intensités ultrasonores. Lors de l'utilisation d'une intensité ultrasonore de 0,5 W/cm ² et un temps d'irradiation de 30 s, 99,53 % et> 80 % des cellules MCF-7 étaient vivantes dans des suspensions à 10 % et 30 % de NB, respectivement (groupe 1), et la diminution de la viabilité des cellules MCF-7 était dose-dépendante. De plus, l'intensité des ultrasons et le temps d'irradiation étaient deux autres facteurs qui affectaient la viabilité des cellules MCF-7. En particulier, lorsque la concentration de NB vides était de 30%, les cellules MCF-7 traitées à 0.5 W/cm ² pendant 30 s ont montré une viabilité plus élevée que ceux traités à 0,5 W/cm ² pour 60 s ou 1 W/cm ² pendant 30 s (0,84 % contre 0,75 % contre 0,63 %). Par conséquent, une intensité ultrasonore de 0,5 W/cm ² et un temps d'irradiation de 30 s/60 s ont été utilisés pour les expériences d'absorption cellulaire.

Cytotoxicité in vitro de diverses concentrations de NBs et intensité sonore dans les cellules MCF-7

Amélioration de la délivrance in vitro de DOX médiée par les DOX-NB et l'irradiation par ultrasons

Les cellules MCF-7 traitées avec des DOX-NB ou de la DOX libre (à des concentrations de DOX égales) ont été fixées, et leur intensité de fluorescence a été mesurée par cytométrie en flux. Les cellules ne recevant aucun traitement DOX ont été utilisées comme témoins à blanc. L'absorption cellulaire de la DOX dans le groupe DOX-NBs a été comparée à celle de la DOX libre et du groupe témoin. Sur la figure 7, l'intensité de fluorescence moyenne des cellules MCF-7 incubées avec des DOX-NB était bien inférieure à l'autofluorescence des cellules incubées avec du DOX libre, illustrant que l'encapsulation de DOX dans des NB de chitosane pouvait protéger les cellules de l'absorption de DOX et de DOX- blessure induite.

Analyse par cytométrie en flux de l'administration de DOX dans des cellules MCF-7 par des NB chargés de DOX (US1 0.5 W/cm ² 30 s, US2 0.5 W/cm ² 60 s)

Cependant, l'irradiation par ultrasons a entraîné une augmentation marquée de l'absorption de DOX dans les cellules MCF-7 incubées avec des DOX-NB ; Les DOX-NB pourraient fournir plus de DOX dans les cellules MCF-7 à l'aide d'une irradiation par ultrasons. En revanche, l'absorption de DOX dans les cellules MCF-7 incubées avec de la DOX libre n'a été que légèrement augmentée sous irradiation ultrasonore. Les résultats suggèrent que l'absorption de DOX dans les cellules MCF-7 incubées avec des DOX-NB était beaucoup plus élevée que celle des cellules incubées avec de la DOX libre sous irradiation ultrasonique.

De plus, l'absorption de DOX dans les cellules MCF-7 incubées avec des DOX-NB a été légèrement augmentée lors d'un temps d'irradiation plus long. Cela peut être dû à une rupture accrue des DOX-NB, générant des pores transitoires sur les membranes des cellules MCF-7.

Amélioration de la prolifération et de l'apoptose des cellules tumorales induites par la DOX par irradiation par ultrasons

Pour étudier les effets anticancéreux de l'administration de DOX-NB assistée par ultrasons, la viabilité des cellules MCF-7 a été mesurée à l'aide d'un test CCK-8 et d'une cytométrie en flux. Les résultats montrent que la viabilité des cellules MCF-7 dans le groupe DOX-NBs était supérieure à celle du groupe DOX sans ultrasons. Pendant ce temps, la viabilité des cellules MCF-7 dans le groupe DOX-NBs était significativement inférieure à celle du groupe DOX avec irradiation ultrasonore locale. Le rapport de viabilité cellulaire dans le groupe DOX-NBs (21,0 ± 2,2%, p < 0,01) était beaucoup plus élevé que celui du groupe DOX libre sans irradiation par ultrasons (6,4 ± 0,7%), ce qui suggère qu'en tant que vecteurs d'administration de médicaments, les NB améliorent la diminution de la prolifération cellulaire induite par la DOX dans la circulation sanguine.

De plus, le ratio de viabilité cellulaire a été significativement diminué dans les cellules traitées avec DOX-NBs + US (3,1 ± 0,8%, 2,2 ± 0,9%) par rapport à celles traitées avec DOX-NBs seul (21,0 ± 2,2%, p < 0,01), DOX libre seule (6,4 ± 0,7%) et DOX libre + ultrasons (4,1 ± 0,8%, 3,8 ± 0,6%) (Fig. 8). Les données ont indiqué que DOX-NBs + US a considérablement amélioré les effets cytotoxiques de DOX dans les cellules MCF-7. Le groupe DOX-NBs + US a également démontré une plus grande cytotoxicité dans les cellules MCF-7 que les groupes DOX libre et DOX libre + ultrasons.

La comparaison de la viabilité cellulaire dans différents groupes

Le ratio de viabilité cellulaire dans le groupe DOX libre + ultrasons (4,1 ± 0,8%) était inférieur à celui du groupe DOX libre (6,4 ± 0,7%). Par conséquent, les ultrasons ont également réduit la viabilité des cellules MCF-7 traitées avec de la DOX libre. Le rapport de viabilité cellulaire était de 2,2 ± 0,9% lorsque les cellules étaient traitées avec DOX-NBs + ultrasons (60 s), ce qui était inférieur à celui traité avec DOX-NBs + ultrasons (30 s) (3,1 ± 0,8%), indiquant que la durée d'impulsion plus longue (60  s) était plus efficace dans l'administration de DOX-NB.

De plus, l'apoptose des cellules MCF-7 a été évaluée par coloration à l'Annexine V 6h après un traitement DOX ou DOX-NB libre, avec ou sans irradiation aux ultrasons. Le pourcentage de cellules MCF-7 apoptotiques en présence de DOX libre était de 4,4 ± 0,9%, tandis qu'un rapport similaire a été observé dans les cellules traitées avec de la DOX libre et des ultrasons (30 s, 60 s). L'administration des DOX-NB assistées par ultrasons a augmenté de manière significative le pourcentage de cellules apoptotiques par rapport à celui du groupe DOX libre (45,7 ± 1,1% contre 4,4 ± 0,9%, p < 0,01). De plus, le pourcentage de cellules apoptotiques dans le groupe DOX-NBs sans irradiation aux ultrasons était inférieur à celui du groupe de traitement DOX libre (3,2 ± 0,9% contre 4,4 ± 0,9%). Conformément au test de viabilité cellulaire, ces données ont indiqué que l'administration de DOX-NB assistée par ultrasons améliorait l'effet anticancéreux de la DOX.

Discussion

Le cancer du sein attire de plus en plus l'attention en raison de ses taux élevés d'incidence et de mortalité. Selon un rapport de Globocan, le cancer du sein est la cause la plus fréquente de décès par cancer chez les femmes dans les régions moins développées [23]. La DOX est un agent anti-cancer mammaire populaire car elle peut induire des dommages à l'ADN [24]. Cependant, il peut également provoquer des effets secondaires graves, tels que la cardiotoxicité, dans les applications cliniques [25]. Pour surmonter ces effets toxiques, des systèmes d'administration de médicaments efficaces qui ciblent uniquement les cellules cancéreuses sont nécessaires, augmentant ainsi la concentration de médicament sur ses sites cibles et la réduisant dans les tissus non cibles [26]. Dans ce travail, des NB de chitosane biologique chargés de DOX ont été conçus, qui, lorsqu'ils sont utilisés conjointement avec des ultrasons, pourraient transporter de manière directionnelle la DOX dans les cellules cancéreuses du sein.

Des NB biologiques de chitosane composés de lécithine et d'acide palmitique ont été formulés et utilisés pour la détection par IRM/échographie, l'administration de gènes et l'administration d'oxygène [13, 18, 27]. Cependant, la capacité de charge de médicament et l'efficacité de livraison des NB de chitosane biologique sont loin d'être optimales. Marano et al. ont combiné des NB de chitosane glycol chargés en DOX et des ondes de choc extracorporelles (ESW) pour améliorer l'activité antitumorale de la DOX [28]. Mais les ESW ne possèdent pas la capacité d'imagerie pour évaluer la taille de la tumeur et détecter avec précision son emplacement. De plus, bien que les effets secondaires graves des ESW soient rares, ils peuvent induire des arythmies cardiaques transitoires [29]. Les métabolites du glycol dont le glycolate et la précipitation de l'oxalate de calcium peuvent également provoquer une acidose métabolique sévère [30]. Par rapport aux ESW, l'échographie présente de plus grands avantages en raison de sa capacité d'imagerie, de son caractère non invasif et de sa sécurité.

Dans cette étude, de nouveaux DOX-NB ont été préparés en utilisant du perfluoropropane comme noyau et du chitosane comme enveloppe. Le chitosan peut activer les macrophages et peut également améliorer leurs fonctions pro-inflammatoires [31]. Il convient de noter que les DOX-NB chargées positivement peuvent interagir fortement avec les composants sanguins, entraînant une élimination rapide du sang et une accumulation ciblée sous-optimale au site tumoral [32]. To overcome this problem, the surface of DOX-NBs was coated with Pluronic F-68, an amphiphilic and non-ionic block copolymer formed by propylene oxide and ethylene units, which may also prevent the aggregation of nanobubbles by steric stabilization [13, 33].

Ensuring the biosafety of NBs is fundamental to their clinical application. In this study, the safety of chitosan NBs was monitored via cell viability, which showed no obvious effect on cell viability with a chitosan NB concentration of 10% and ultrasound treatment (0.5 W/cm ² , 30 s), suggesting low cytotoxicity of chitosan NBs. Indeed, even treatment with a high dosage (30%) of chitosan NBs resulted in less than 20% observable cell death. The results showed that cell viability in chitosan NBs was much higher than that in lipid-coated nanobubbles [19], indicating that chitosan NBs were highly biocompatible with MCF-7 cells and that the cell death observed in this study may be due to the energy released by ultrasound-induced NB disruption. The high safety profile of biocompatible chitosan NBs renders them suitable for loading other drugs in the future.

Our research shows that US irradiation can effectively promote the release of DOX from DOX-NBs and subsequent cellular uptake of DOX in vitro. Exposure of cells to DOX-NBs and ultrasound resulted in near instantaneous cellular entry of DOX. The reason for this is that sonoporation is a process by which ultrasonically activated ultrasound contrast agents pulsate near biological barriers (cell membranes or endothelial layers), increasing their permeability and thereby enhancing the extravasation of external substances. In this way, drugs and genes can be delivered inside individual cells [34]. Our data showed that the cellular uptake of DOX was significantly higher in the DOX-NBs group than in the free DOX group when ultrasound-assisted delivery was applied. Meanwhile, without ultrasound, MCF-7 cells in the free DOX group showed increased DOX uptake than those in the DOX-NBs group, indicating that the chitosan NBs could reduce cellular uptake of DOX in normal tissues and protect them in the absence of ultrasonic irradiation.

Chen et al. showed that the carrier-free HCPT/DOX nanoparticles enhanced synergistic cytotoxicity against breast cancer cells in vitro [35], but they could not reduce DOX cytotoxicity and its toxicity in the circulation. A biophysical research group from Vytautas Magnus University proposed combining DOX-liposomes with microbubbles and US to enhance targeting [36]. Their results showed that the cell survival rate of DOX-liposomes decreased by 60~70% when microbubbles and ultrasound were present. By comparison, the cell survival rate of the DOX-NBs + US group in our study was 85.3% or 89.5% ((21–3.1 or 21–2.2)/21) lower than that of the DOX-NBs group. This proves that the combination of DOX-NBs and US are more effective in transporting DOX than DOX-liposomes combined with microbubbles and US. We also found that the cells in the DOX-NBs + US group showed a higher rate of apoptosis than those in the free DOX and DOX-NBs only groups. This finding was not unexpected as greater accumulation of DOX in cancer cells can increase cell death, consistent with a previous report [37].

Conclusions

In summary, DOX-loaded biocompatible chitosan NBs were successfully prepared using a combination of biological surfactants. The prepared NBs possessed a good ability to achieve ultrasound enhancement and excellent biosafety. The in vitro results demonstrated that DOX­NBs are an innovative drug delivery system that may be useful in obtaining efficient ultrasound­assisted DOX delivery for the treatment of mammary cancer.

Abréviations

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

DMEM :

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DOX:

Doxorubicin hydrochloride

EE:

Encapsulation efficiency

EP tubes:

Eppendorf tubes

ESWs:

Extracorporeal shock waves

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

NBs:

Nanobubbles

US:

Ultrasound

UTN/MD:

Ultrasound-targeted nano/microbubble destruction